張媛 田晶晶 羅云波 田洪濤 許文濤

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，保定 071001；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；3. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100083；4. 國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，保定 071001）

生物傳感器是以具有生物識(shí)別作用的生物成分（如酶、蛋白質(zhì)、DNA、抗體和抗原等）或生物體本身（如細(xì)胞、微生物和組織等）為敏感材料，與適當(dāng)?shù)男盘?hào)轉(zhuǎn)換器相結(jié)合，將生化反應(yīng)的程度用離散或連續(xù)的信號(hào)表達(dá)出來(lái)，從而能夠進(jìn)行生命物質(zhì)和化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)和監(jiān)控的裝置［1］。近年來(lái)，生物傳感器已經(jīng)得到了空前的發(fā)展，并且已經(jīng)應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、環(huán)境等各個(gè)領(lǐng)域，生物傳感器的種類有很多，其中核酸生物傳感已經(jīng)成為近幾年大量學(xué)者的研究熱點(diǎn)。

核酸生物傳感器是利用DNA分子之間互補(bǔ)配對(duì)的特異性，以核酸作為分子識(shí)別元件，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)殡?、光、聲等可識(shí)別的信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定核酸序列進(jìn)行分析的傳感器。由于其具有簡(jiǎn)便快速、靈敏度較高、穩(wěn)定性強(qiáng)及成本較低的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)診斷、食品檢驗(yàn)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。各種核酸內(nèi)切酶在核酸生物傳感器的構(gòu)建中都起了重要作用，如雙鏈特異性核酸酶（Duplex-specific nuclease，DSN酶），根據(jù)其對(duì)單雙鏈核酸不同的切割特點(diǎn)，搭載不同的信號(hào)輸出及擴(kuò)增方式，已經(jīng)介導(dǎo)了一系列核酸傳感器包括光學(xué)傳感器、電化學(xué)傳感器和光磁傳感器等，實(shí)現(xiàn)了microRNA、mRNA、重金屬離子等一系列生物標(biāo)志物及食品安全風(fēng)險(xiǎn)因子的檢測(cè)。脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1（Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1），具有能夠在堿基缺失位點(diǎn)（AP site）處識(shí)別并切割 DNA 能力，利用這一能力可以生成理想的功能核酸鏈，并結(jié)合不同的信號(hào)輸出及放大方式，研究者已經(jīng)建立了一些 APE1介導(dǎo)的電化學(xué)、熒光功能核酸生物傳感技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì) DNA 糖基化酶等的酶活性的檢測(cè)，同時(shí)也對(duì)腫瘤的治療方面有一定的應(yīng)用。末端轉(zhuǎn)移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT酶）是一種無(wú)需模板的DNA聚合酶，可以催化DNA的3′末端添加同聚物或在DNA的3′末端標(biāo)記，可以介導(dǎo)電化學(xué)、熒光等核酸傳感器，用于檢測(cè)金屬離子，蛋白質(zhì)分子和小分子等，也能診斷、治療如急性淋巴性白血病等疾病。

S1核酸酶是一種高度單鏈特異的核酸內(nèi)切酶，來(lái)源于稻谷曲霉（Aspergillus oryzae），是由Vogt在1973年首先從米曲霉中分離得到的［2］，廣泛用于核酸的生物化學(xué)分析。目前，結(jié)合S1核酸酶對(duì)核酸鏈特有的性質(zhì)及生物傳感器快速、微量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，人們?cè)O(shè)計(jì)出了許多精確度越來(lái)越高的S1核酸酶介導(dǎo)的核酸生物傳感器，可以用來(lái)檢測(cè)不同種類的金屬離子、單鏈核酸、氨基酸等，S1核酸酶的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。因此本文對(duì)近年來(lái)S1核酸酶的應(yīng)用，介導(dǎo)的生物傳感器的種類等進(jìn)行了總結(jié)，有助于使其在生物學(xué)、分子診斷學(xué)、基因組研究和藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域得到更好的應(yīng)用。

1 S1核酸酶的介紹

1.1 S1核酸酶的結(jié)構(gòu)和功能

S1核酸酶是S1-P1核酸酶家族的一種鋅離子依賴性核酸酶，是具有兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的糖蛋白，S1-P1核酸酶家族在真菌、植物、原生動(dòng)物和寄生蟲(chóng)等中廣泛存在，但S1核酸酶只存在于稻谷曲霉中。Kova?等［3］展示了這種核酸酶的第一個(gè)X射線結(jié)構(gòu)，以及對(duì)負(fù)責(zé)識(shí)別和結(jié)合配體的反應(yīng)、抑制機(jī)制、性質(zhì)進(jìn)行了徹底分析，如鑒定出了額外的核堿基結(jié)合位點(diǎn)，明確了活性位點(diǎn)與磷酸鹽、核苷酸等的多種結(jié)合方式。S1核酸酶能降解單鏈DNA或RNA，對(duì)雙鏈DNA、雙鏈RNA和DNA-RNA雜交體相對(duì)不敏感。通常水解單鏈DNA的速率要比水解雙鏈RNA快75 000倍。這種水解反應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)的生物過(guò)程以及許多生物技術(shù)中發(fā)揮著重要的作用，如基因的修復(fù)、重組、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及分子克隆、基因分型和映射等［4-8］。

1.2 S1核酸酶的性質(zhì)

S1核酸酶是一種分子量為32 kD，依賴 Zn2+的糖蛋白質(zhì)，最適pH范圍為4.0-4.3。該酶對(duì)熱很穩(wěn)定，在底物存在下65-70℃仍能表現(xiàn)活性。經(jīng)研究表明，一些螯合劑（如EDTA和檸檬酸等）能強(qiáng)烈地抑制S1核酸酶活性，K+以某些G-四聯(lián)體為底物對(duì)S1核酸酶的活性有抑制作用［9］，0.4 mmol/L的Na2ATP可以有效的抑制S1核酸酶對(duì)ssDNA的消化［10］。此外，磷酸緩沖液也可以抑制其活性，但它對(duì)尿素及甲酰胺等試劑是穩(wěn)定的。

S1核酸酶盡管其主要底物是單鏈的，但它也可以偶爾在雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜合體中引入單鏈斷裂。即它可以水解雙鏈DNA中的單鏈區(qū)域，從單鏈部位切斷核酸分子，而且這種單鏈區(qū)可以小到只有一個(gè)堿基對(duì)的程度，如環(huán)和間隙。由于具備這種功能，使S1核酸酶在分析核酸雜交分子（RNADNA）的結(jié)構(gòu)、RNA分子定位、測(cè)定真核基因中間隔子序列的位置、去除DNA片段中突出的單鏈尾，以及打開(kāi)在雙鏈cDNA合成期間形成的發(fā)夾環(huán)過(guò)程中起作用。更重要的是，S1核酸酶不需要特定的識(shí)別位點(diǎn)和 3′-5′（或 5′-3′）方向的水解，因此無(wú)論發(fā)夾的末端或莖環(huán)的序列如何，都會(huì)發(fā)生水解作用。這與早期分子信標(biāo)，納米粒子擴(kuò)增方案或量子點(diǎn)耦合熒光共振能量轉(zhuǎn)移中使用的核酸內(nèi)切酶形成鮮明對(duì)比［11-15］。

2 S1核酸酶介導(dǎo)的功能核酸生物傳感器分類

2.1 S1核酸酶介導(dǎo)的肽核酸（PNA）生物傳感器

肽核酸（Peptide nucleic acid，PNA）是具有類多肽骨架的DNA類似物，可以特異性地與DNA或RNA雜交，形成穩(wěn)定的復(fù)合體。Ye等［16］通過(guò)結(jié)合PNA和S1核酸酶開(kāi)發(fā)了一種非常簡(jiǎn)單和實(shí)用的基因分型方法。樣品DNA中與PNA互補(bǔ)（完全或部分）的部分被保護(hù)，可免于酶的消化，通過(guò)添加識(shí)別PNA / DNA雙鏈體的3，3′-二乙基硫代二羰花青碘化物可以通過(guò)比色法判斷是否有SNP存在，這種化合物在PNA與DNA完全互補(bǔ)時(shí)混合物呈紫色，有SNP存在時(shí)呈藍(lán)色?？梢詫⑦@種方法應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并用肉眼觀察顏色的變化來(lái)快速檢測(cè)SNP是否存在于患者的DNA中。

2.2 S1核酸酶介導(dǎo)的表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）

傳感器

Yoo等［17］將金納米線膜上表面增強(qiáng)拉曼散射（Surface enhanced raman scattering， SERS）平臺(tái)與 S1核酸酶反應(yīng)相結(jié)合，開(kāi)發(fā)了一種新型的用來(lái)檢測(cè)錯(cuò)配堿基（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）的傳感器。將探針DNA通過(guò)巰基連接到金納米線（Au nanowire，Au NW）上，當(dāng)目標(biāo)DNA浸入含有探針DNA的溶液中時(shí)，探針DNA可以與目標(biāo)DNA雜交。如果目標(biāo)DNA與探針DNA雜交完全匹配，則其保護(hù)探針DNA免受S1核酸酶水解，使得拉曼信號(hào)分子Cy5保留在Au NW附近的探針DNA處，由此提供強(qiáng)烈的SERS信號(hào)。如果與探針DNA雜交的靶DNA具有錯(cuò)配，則通過(guò)S1核酸酶的水解除去Cy5并且拉曼信號(hào)消失。從用S1核酸酶處理之前和之后的拉曼信號(hào)的差異可以清楚地識(shí)別出SNPs的存在。

Draz等［18］研發(fā)了一種將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）和表面增強(qiáng)拉曼散射相結(jié)合的DNA感應(yīng)測(cè)定法，應(yīng)用的金納米探針專門設(shè)計(jì)用于標(biāo)記LAMP產(chǎn)生的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，使用SERS技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，原理如圖1所示。依靠使用S1核酸酶的酶消化步驟來(lái)區(qū)分靶DNA的存在與否，當(dāng)靶DNA存在時(shí)可特異性結(jié)合其互補(bǔ)序列并形成雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，其中復(fù)雜的cy5-DNA被保護(hù)免受核酸酶消化，并且最終cy5保持與金納米顆粒的表面連接，產(chǎn)生較強(qiáng)的拉曼信號(hào)。相反，在沒(méi)有靶DNA的情況下，S1核酸酶通過(guò)水解金納米探針的表面的DNA寡核苷酸，觸發(fā)從金納米顆粒表面釋放cy5，導(dǎo)致顯著降低拉曼信號(hào)的強(qiáng)度。

圖1 LAMP-SERS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理圖［18］

2.3 S1核酸酶介導(dǎo)的熒光傳感器

Guo等［19］開(kāi)發(fā)了一種新型的無(wú)標(biāo)記熒光生物傳感器，實(shí)驗(yàn)基于陽(yáng)離子（9，9-雙（6′-N，N，N-三甲基銨）己基）氟亞苯基（9，9-bis（6′-N，N，N-trimethylammonium）hexyl）fluorine phenylene，PFP）和苝二酰亞胺衍生物（Perylene diimide derivatives，PDI）開(kāi)發(fā)了一種新型的無(wú)標(biāo)記的熒光生物傳感器。由于PFP和PDI兩者之間具有靜電排斥作用，PDI本身不能淬滅PFP的熒光。當(dāng)ssDNA被添加到混合溶液中時(shí)，由于更強(qiáng)的靜電吸引相互作用，可以形成PFP / ssDNA / PDI復(fù)合物，使熒光淬滅。當(dāng)存在S1核酸酶時(shí)，ssDNA被水解成小片段，PFP / ssDNA / PDI復(fù)合物被分解并且小ssDNA片段上的PDI無(wú)法聚集，PDI的淬滅能力減弱與PDI之間的距離較遠(yuǎn)，使PFP的熒光顯著恢復(fù)。該方法更靈敏、高效及簡(jiǎn)單，為生物分析提供了一個(gè)新的平臺(tái)。

Bao等［20］采用陽(yáng)離子共軛聚電解質(zhì)（Conjugated polyelectrolytes，CPEs）作為檢測(cè)DNA的指標(biāo)，開(kāi)發(fā)了新型均相雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization chain reaction，HCR）檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)采用兩個(gè)用熒光素標(biāo)記發(fā)夾探針H1和H2，在存在目標(biāo)ssDNA時(shí)，經(jīng)過(guò)HCR之后，兩個(gè)發(fā)夾探針被靶標(biāo)DNA觸發(fā)以形成在鏈中具有多個(gè)熒光素標(biāo)記的長(zhǎng)鏈雙鏈DNA聚合物，其對(duì)S1核酸酶降解具有抗性。當(dāng)添加CPE時(shí)，熒光素標(biāo)記的DNA與CPE之間發(fā)生強(qiáng)烈的靜電相互作用，從而允許從CPE到熒光素標(biāo)記的DNA的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）以及共軛聚合物溶液的明顯的熒光顏色變化，熒光顏色由藍(lán)色變?yōu)榫G色。在不存在目標(biāo)ssDNA時(shí)，S1核酸酶可以結(jié)合并裂解H1和H2發(fā)夾探針的單鏈DNA片段，這導(dǎo)致H1和H2的莖環(huán)區(qū)釋放熒光素。在UV照射下可以觀察到陽(yáng)離子共軛聚電解質(zhì)［（9，9-雙 {60 -［（N，N-二乙基）-N-甲基銨］己基} -2，7-亞麻烯基乙炔）-共 -（2，5-雙 {30 -［（N，N-二乙基）-N-甲基銨］-10-氧雜丙基 } -1，4-亞苯基）］四碘化物（［（9，9-bis{60-［（N，N-diethyl）-N-methylammonium］hexyl}- 2，7- fuorenyleneethynylene）-alt-co-（2，5-bis{30-［（N，N-diethyl）-N-methylammonium］-10-oxapropyl}-1，4-phenylene）］tetraiodide，PFEPN+）發(fā)出的藍(lán)色熒光，原理圖如圖2所示。

圖2 基于HCR和CPE的DNA檢測(cè)級(jí)聯(lián)信號(hào)放大策略示意圖［20］

2.4 S1核酸酶介導(dǎo)的納米材料傳感器

貴金屬納米簇（Nano-cluster，NCs）因其尺寸小、無(wú)毒性和生物相容性良好等優(yōu)點(diǎn)而引起了廣泛關(guān)注。銀納米簇（Ag nanocluster，AgNCs）作為一種貴金屬納米簇，因具有高度極化的電子躍遷性能，已成為一種極具潛力的熒光基團(tuán)［21-22］。Wang等［23］以富含胞嘧啶C的單鏈DNA作為模板合成高熒光量子產(chǎn)物AgNCs，當(dāng)S1核酸酶存在時(shí)，S1核酸酶可把ssDNA降解為單核苷酸或寡核苷酸片段，使其無(wú)法進(jìn)行構(gòu)型轉(zhuǎn)變形成AgNCs，導(dǎo)致體系熒光信號(hào)顯著降低。該熒光探針?lè)椒`敏度高、操作簡(jiǎn)單且無(wú)需標(biāo)記。

Qi等［24］基于（+）金納米粒子（Au nanoparticles，AuNPs）對(duì)長(zhǎng)ssDNA和由酶解切割反應(yīng)產(chǎn)生的片段化DNA的完全不同的電化學(xué)發(fā)光（Chemiluminescence，Cl）效應(yīng)，來(lái)監(jiān)測(cè)核酸酶對(duì)DNA切割過(guò)程。魯米諾陰離子和氫過(guò)氧化物陰離子（HO2-）是Cl系統(tǒng)中存在的主要分子形式，ssDNA本身是帶有負(fù)電荷磷酸骨架的聚陰離子物質(zhì)，通過(guò)靜電相互作用與（+）AuNPs作用，導(dǎo)致Cl反應(yīng)體系的局部濃度降低，使得化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度降低。當(dāng)S1核酸酶存在時(shí)，ssDNA被S1核酸酶切割成小片段，一方面，片段化的DNA具有較少的帶負(fù)電荷的磷酸骨架其電負(fù)性較弱；另一方面，小DNA片段不能像長(zhǎng)的ssDNA那樣自由地包裹AuNPs表面，因此片段化DNA不能與（+）AuNPs相互作用，（+）AuNPs保持其原始的高正電荷密度，并且增加的局部濃度效應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)Cl信號(hào)，原理圖如圖3所示。

3 S1核酸酶介導(dǎo)的功能核酸生物傳感器的應(yīng)用

3.1 金屬離子的檢測(cè)

鉀離子（K+）是細(xì)胞內(nèi)液中主要的陽(yáng)離子，心肌和神經(jīng)肌肉均需要相對(duì)恒定的鉀離子濃度以維持正常的應(yīng)激性，同樣也是植物生長(zhǎng)過(guò)程中所需要的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［25］。精確的檢測(cè)K+這類物質(zhì)，在生物化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)及食品衛(wèi)生等方面有著重要的意義。Zhou等［9］利用目前研究的以原卟啉IX（Protoporphyrin IX，PPIX）作為信號(hào)源，開(kāi)發(fā)的基于G四聯(lián)體的內(nèi)切核酸酶活性熒光的測(cè)定法進(jìn)行研究，當(dāng)S1核酸酶能夠?qū)-四聯(lián)體DNA切割成小片段即不會(huì)形成G-四聯(lián)體時(shí)，PPIX的熒光會(huì)減弱。在加入K+后能降低S1核酸酶的活性，穩(wěn)定G4結(jié)構(gòu)，使PPIX的熒光可以大大提高，該系統(tǒng)可以選擇性的檢測(cè)K+。

圖3 通過(guò)Cl信號(hào)來(lái)監(jiān)測(cè)核酸酶對(duì)DNA切割過(guò)程原理圖［24］

Pb2+是生態(tài)環(huán)境中毒性最大的污染物之一，會(huì)對(duì)人體健康，特別是兒童健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響。找到一種方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，性價(jià)比高，并且具有良好的靈敏度和選擇性的檢測(cè)方法尤為重要。Li等［10］用凝血酶結(jié)合適體（Thrombin adaptor，TBA）作為酶結(jié)合適體，在沒(méi)有Pb2+的情況下，核酸酶S1可以將單鏈TBA有效降解為單核苷酸或寡核苷酸片段，因此TBA片段不能誘導(dǎo)探針的聚集形成，導(dǎo)致弱的熒光強(qiáng)度。在Pb2+存在下，TBA折疊成穩(wěn)定的G4結(jié)構(gòu)，其阻斷核酸酶S1的水解消化，聚集復(fù)合體預(yù)計(jì)會(huì)形成，熒光強(qiáng)度會(huì)增強(qiáng)，原理如圖4所示，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熒光發(fā)射的強(qiáng)度與Pb2+的添加量成正比。

3.2 單鏈核酸的檢測(cè)

圖4 檢測(cè)pb2+的原理示意圖［10］

Micro RNA是一類短小的、內(nèi)源性的非編碼RNA，是單鏈核酸的一種，長(zhǎng)度大約在18-24個(gè)核糖核苷酸之間。它們?cè)谏砗筒±磉^(guò)程中扮演重要的角色，可以調(diào)控基因的活性，且對(duì)細(xì)胞的增殖、遷移以及凋亡有抑制或促進(jìn)作用［26-27］，對(duì)癌癥、糖尿病和阿爾茲海默癥的診斷也十分有價(jià)值［28］。

Micro RNA被當(dāng)作癌癥治療中的腫瘤標(biāo)記物和治療靶標(biāo)［26-27，29-30］。因此，micro RNA的高效檢測(cè)對(duì)更好地了解它們?cè)谀[瘤細(xì)胞中的角色，以及進(jìn)一步驗(yàn)證其在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷中的功能至關(guān)重要。但是，micro RNA的一些特殊性質(zhì)使分析它們具有一定的難度。例如，片段小、在家族中序列的高同源性、在總體RNA中的低豐度等［31］。因此，發(fā)展特異性、超靈敏的micro RNA定量檢測(cè)的方法乃當(dāng)務(wù)之急。Zhou等［32］，利用S1核酸酶只能水解單鏈核苷酸不能水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜合體這一特殊的性質(zhì)，開(kāi)發(fā)出一種簡(jiǎn)單的電化學(xué)方法用于micro RNA的檢測(cè)，在不存在雜交過(guò)程的情況下，電極表面上的組裝探針DNA可以被核酸酶S1容易地消化，并且由于朝向氧化還原探針可以降低排斥力產(chǎn)生的強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)。然而，當(dāng)探針DNA與靶micro RNA雜交后，核酸酶S1的消化活性被抑制，這可能導(dǎo)致弱的電化學(xué)信號(hào)。基于電化學(xué)信號(hào)的變化，可以實(shí)現(xiàn)靶microRNA-319a的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)原理如圖5所示。

3.3 小分子的檢測(cè)

腺苷三磷酸（Adenosine triphosphate，ATP）被認(rèn)為是生命的能量分子，作為細(xì)胞內(nèi)能量傳遞的“分子貨幣”，起著儲(chǔ)存和傳遞化學(xué)能的作用，其參與著機(jī)體的新陳代謝［33］，在生物合成，神經(jīng)活動(dòng)，主動(dòng)運(yùn)輸?shù)确矫嬉舶l(fā)揮著重要的作用。傳統(tǒng)方法如高效液相色譜法，雖然能檢測(cè)出ATP，但通常耗資高，方法復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)操作繁瑣。Liu等［33］基于滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling circle amplification，RCA）和Exo III輔助循環(huán)的雙重放大熒光傳感平臺(tái)，利用ATP對(duì)S1核酸酶活性的抑制作用，從而保護(hù)RCA反應(yīng)的引物鏈不被水解，使RCA反應(yīng)得以進(jìn)行，并順利地發(fā)生后續(xù)的核酸外切酶III輔助熒光信號(hào)放大反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP的檢測(cè)。

3.4 氨基酸的檢測(cè)

圖5 基于針對(duì)核酸酶S1消化的雜交保護(hù)的micro RNA測(cè)定的檢測(cè)策略的示意圖［32］

2011年，Xu等［34］利用S1核酸酶在單鏈DNA上的水解功能，提出了一種靈敏的檢測(cè)L-精氨酰胺的方法。用可以產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)（Cl）的試劑N-（4-氨基丁基）-N-乙基異魯米諾［N-（4-aminobutyl）-N-ethylisoluminol，ABEI］標(biāo)記DNA適體及其互補(bǔ)DNA。將用5′-ABEI標(biāo)記的DNA1-ABEI固定在膠體金覆蓋的磁珠（MB）上，DNA1為L(zhǎng)-精氨酸酰胺適體互補(bǔ)序列，用3′-ABEI標(biāo)記的DNA2-ABEI以MB雙鏈形式自我裝配，DNA2為L(zhǎng)-精氨酸酰胺適體。在目標(biāo)L-精氨酰胺的存在下，形成莖環(huán)適體結(jié)構(gòu)，其響應(yīng)地使雙鏈體變性并從互補(bǔ)DNA2釋放，形成DNA2中的單鏈區(qū)域。S1核酸酶催化逐步去除單鏈區(qū)域的單核苷酸并最終釋放L-精氨酰胺。釋放的L-精氨酰胺然后與另一個(gè)適體相互作用，從那里重新開(kāi)始循環(huán)。同時(shí)，MB表面形成的單鏈DNA也被S1核酸酶水解。因此，單一的L-精氨酰胺產(chǎn)生許多Cl試劑ABEI，進(jìn)而產(chǎn)生強(qiáng)烈的Cl信號(hào)。實(shí)驗(yàn)原理如圖6所示。

圖6 靈敏的檢測(cè)L-精氨酰胺的原理圖［34］

3.5 核酸反應(yīng)體系的純化

Yoo等［35］開(kāi)發(fā)了基于S1核酸酶的多點(diǎn)陣列系統(tǒng)，該系統(tǒng)可高通量地檢測(cè)出錯(cuò)配DNA，有效防止出現(xiàn)假陰性結(jié)果，具有高度特異性。在雜交期間，靶標(biāo)DNA結(jié)合到探針DNA的匹配區(qū)域形成DNA雙鏈體（dsDNA），沒(méi)有互補(bǔ)序列區(qū)的和不能與任何靶標(biāo)DNA結(jié)合的探針DNA 或者形成具有由一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配堿基對(duì)產(chǎn)生的單鏈環(huán)的異源雙鏈體可被S1核酸酶水解，將完美匹配的探針DNA留在玻璃基底上，在玻璃基底可以檢測(cè)到熒光信號(hào)。這種方法也可以用來(lái)檢測(cè)導(dǎo)致傳染性疾病的基因突變，SNPs，遺傳疾病和微生物病原體等。

Guan等［36］設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)復(fù)雜的污染物樣品中的序列特異性單鏈DNA（ssDNA）簡(jiǎn)單的無(wú)標(biāo)記傳感方法，檢測(cè)原理如圖7所示。在檢測(cè)過(guò)程中，S1核酸酶起著重要的作用。S1核酸酶可以降解單鏈核酸或在由切口，缺口，錯(cuò)配或環(huán)引起的單鏈區(qū)裂解雙鏈DNA，核酸染料只能與dsDNA結(jié)合，通過(guò)使用S1核酸酶清除多余的互補(bǔ)ssDNA和可能錯(cuò)配的雙鏈DNA，消除過(guò)多的互補(bǔ)單鏈DNA或其他單鏈核酸污染物，從而降低非特異性熒光背景，進(jìn)而提高所提方法的靈敏度和實(shí)用性。

3.6 多元化基因文庫(kù)的構(gòu)建

圖7 檢測(cè)ssDNA的原理圖［36］

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫(kù)。Tullman［37］研究發(fā)現(xiàn)S1核酸酶可以通過(guò)在質(zhì)粒分子中產(chǎn)生單一的雙鏈斷裂將超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化為單位長(zhǎng)度的線性雙鏈DNA，這些雙鏈斷裂不僅發(fā)生在靠近反向重復(fù)的復(fù)制起點(diǎn)處，而且遍及整個(gè)質(zhì)粒的各個(gè)位置。S1核酸酶在通常用于單鏈核酸酶活性的條件下才顯示出這種活性。因此，質(zhì)粒DNA的S1核酸酶消化在第一次雙鏈斷裂后有效停止。該屬性使構(gòu)建大型域插入庫(kù)變得更加容易，其目標(biāo)是在各種位置插入線性DNA。所以，利用S1核酸酶這一性質(zhì)能夠構(gòu)建更多元化的基因文庫(kù)。

4 S1核酸酶的檢測(cè)

傳統(tǒng)的檢測(cè)S1核酸酶的方法，如放射性同位素標(biāo)記法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、高效液相色譜法及酶聯(lián)免疫分析法等。這些方法費(fèi)力、耗時(shí)而且操作較為復(fù)雜，部分方法還存在需要同位素標(biāo)記的缺點(diǎn)。近些年來(lái)，為了克服這些缺點(diǎn)，其它檢測(cè)核酸酶活性的技術(shù)相繼出現(xiàn)，如電化學(xué)技術(shù)［38］和光學(xué)技術(shù)。例如，一些可附著在DNA上的分子，如硅雜環(huán)戊二烯分子、二萘嵌苯衍生物分子［39］及金納米顆粒［40］，一旦核酶將DNA水解，將導(dǎo)致這些分子的聚集狀態(tài)發(fā)生改變，進(jìn)而引起溶液的熒光或顏色改變，以此來(lái)檢測(cè)核酸酶。

He等［41］設(shè)計(jì)了一種基于氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）的傳感系統(tǒng)用于核酸內(nèi)切酶的檢測(cè)。研究表明，GO有淬滅熒光的作用并且可以與單鏈DNA相互作用，實(shí)驗(yàn)采用20-mer ssDNA作為核酸酶底物，20F通過(guò)p-p堆積被吸附到GO片上，由此GO顯著地猝滅熒光基團(tuán)-羧基熒光素（Financial analyst meeting，F(xiàn)AM）的熒光。在S1核酸酶的存在下，可將20F切割成片段，由于短的FAM連接的寡核苷酸片段對(duì)GO的弱親和力，將GO引入感應(yīng)溶液導(dǎo)致FAM熒光弱猝滅，并且隨著S1核酸酶濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，F(xiàn)AM的熒光強(qiáng)度與S1核酸酶的濃度成正比。

Li等［42］將陽(yáng)離子 9，9-雙（6，6-（N，N，N-三甲基銨）-芴）-2，7-亞基-亞乙烯基-共-交替-2，5-二氰基 -1，4-亞 苯基（9，9-bis（6，6-（N，N，N-trimethylammonium）-fluorene）-2，7-ylenevinylene -co -alt-2，5-dicyano-1，4-phenylene），PFVCN） 用 作 信 號(hào) 物質(zhì)，單層二硫化鎢（Tungsten disulfide，WS2）可作為帶負(fù)電荷表面的猝滅劑。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，PFVCN與WS2反應(yīng)使熒光淬滅，當(dāng)ssDNA存在時(shí)，由于更強(qiáng)的靜電作用，ssDNA與PFVCN相互作用形成復(fù)合物，PFVCN發(fā)出黃色熒光。當(dāng)ssDNA被S1核酸酶或羥基自由基水解成小片段時(shí)，片段化的DNA和PFVCN之間的相互作用變?nèi)酰瑢?dǎo)致PFVCN被吸附在WS2的表面上并且通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移淬滅熒光。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，由于S1核酸酶特有只能水解單鏈DNA和RNA而不能水解雙鏈DNA和RNA的這一性質(zhì)，其已廣泛的被應(yīng)用于生物傳感器的檢測(cè)領(lǐng)域。等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)是一類新型的核酸分析技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了恒溫條件下核酸的擴(kuò)增。與傳統(tǒng)PCR相比，等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擺脫了對(duì)熱循環(huán)儀器的需求，并且針對(duì)靶標(biāo)序列的擴(kuò)增具有耗時(shí)短、反應(yīng)靈敏、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多的科研人員也開(kāi)始把目光聚焦于體外核酸擴(kuò)增新技術(shù)的開(kāi)發(fā)。S1核酸酶室溫下就可發(fā)生反應(yīng)，且具有較高的熱穩(wěn)定性，因此可與體外恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)如LAMP、RCA等相結(jié)合實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大并實(shí)現(xiàn)靶物質(zhì)的檢測(cè)。目前S1核酸酶介導(dǎo)的生物傳感器可用于檢測(cè)金屬離子、micro RNA、小分子物質(zhì)、氨基酸等，由于其可降解錯(cuò)配堿基，也可用于純化反應(yīng)體系，人們?cè)O(shè)計(jì)出了許多精確度越來(lái)越高的生物傳感器用來(lái)檢測(cè)S1核酸酶，但總體來(lái)說(shuō)S1核酸酶的應(yīng)用較少，如何利用S1核酸酶設(shè)計(jì)高靈敏度、高特異性的生物傳感器將成為今后研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

總體來(lái)說(shuō)，對(duì)S1核酸酶的研究仍處于初級(jí)階段，要想使其介導(dǎo)的生物傳感器得到更廣泛的應(yīng)用，需要在以下幾方面進(jìn)行進(jìn)一步研究和探索：首先，在理論方面需要深入研究S1核酸酶的結(jié)構(gòu)與活性的構(gòu)效關(guān)系，找出其活性位點(diǎn)，探究其對(duì)于核酸鏈的堿基碎片化規(guī)律，為其應(yīng)用提供理論支持。其次，應(yīng)尋找一種方法可以使該酶的活性被封閉，便于常溫貯藏和運(yùn)輸，使其能在快速檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮作用。再次，可利用該酶與其他酶，如解旋酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等，配合開(kāi)發(fā)新的復(fù)合酶恒溫?cái)U(kuò)增新技術(shù)，并探究復(fù)合酶的最佳應(yīng)用場(chǎng)景及最優(yōu)反應(yīng)體系。該酶核酸酶介導(dǎo)的生物傳感器主要為熒光生物傳感器，對(duì)于其他類型的生物傳感器涉及的較少，并且一般都為單一物質(zhì)檢測(cè)，我們應(yīng)該合理的利用S1核酸酶開(kāi)發(fā)出功能多樣化、智能化集成化、微型化的生物傳感器。最后，該酶還可與新型納米材料結(jié)合運(yùn)輸?shù)桨麅?nèi)及體內(nèi)進(jìn)行活細(xì)胞生物傳感器的檢測(cè)，基于S1核酸酶的胞內(nèi)檢測(cè)和胞內(nèi)成像將成為未來(lái)的研究熱點(diǎn)。