焦雪倩，余丹，黃伏生

（武漢大學(xué)中南醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430071）

腦卒中是遺傳和環(huán)境共同作用的疾病，具有高發(fā)病率和高病死率，其中梗死性腦卒中是最常見(jiàn)的形式，約占全部腦卒中的80%[1]。據(jù)報(bào)道，高血壓、糖尿病及高血脂等是腦梗死的危險(xiǎn)因素[2]。此外，一些未知的基因也與腦梗死的發(fā)生有關(guān)。線粒體外膜轉(zhuǎn)移酶 40（translocase of outer mitochondrial membrane 40,TOMM40）定位于19q13.2，在某些蛋白質(zhì)如DNA聚合酶、RNA聚合酶及氧自由基清除因子等進(jìn)入線粒體的過(guò)程中起作用[3]。本研究采用高分辨率熔解曲線（high resolution melting, HRM）技術(shù)，探索TOMM40基因多態(tài)性與武漢地區(qū)中老年人群腦梗死發(fā)病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年9月—2017年7月在武漢大學(xué)中南醫(yī)院就診的507例漢族腦梗死患者作為腦梗死組。其中，男性305例，女性202例；年齡40～84歲，平均（66.89±11.68）歲；所有患者經(jīng)過(guò)CT或MRI證實(shí)。納入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)腦梗死病史，經(jīng)CT或MRI檢查無(wú)腦血管病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：腦出血、顱內(nèi)占位、自身免疫性疾病、嚴(yán)重的肝腎疾病、感染性疾病及惡性腫瘤。收集同期在武漢大學(xué)中南醫(yī)院體檢中心就診的510例漢族健康體檢者作為對(duì)照組。其中，男性313例，女性197例；年齡42～87歲，平均（65.62±11.77）歲；收集受試者的性別、年齡、收縮壓（systolic blood pressure, SBP）、舒張壓（diastolic blood pressure, DBP）、血糖（blood glucose, GLU）、總膽固醇（total cholesterol,TC）、三酰甘油（Triglyceride, TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol, HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA的提取 收集受試者的靜脈血2 ml，用苯酚-氯仿法提取基因組DNA，純度和濃度采用Nanodrop 2000C分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher公司）檢測(cè)。

1.2.2 目的片段的擴(kuò)增及基因型的檢測(cè)TOMM40基因rs2075650位點(diǎn)正向引物：5’-AGGAAGAGAT GAGAGTTGGTGTG-3’，反向引物：5’-CTGGAGAA GAGAAACGCTGTC-3’。PCR反應(yīng)體系為10μl。PCR反應(yīng)結(jié)束后使用LightScanner 96高分辨率分析系統(tǒng)（美國(guó)Idaho Technology公司）結(jié)合熔解曲線進(jìn)行基因分型。根據(jù)熔解曲線圖挑選出不同基因型的樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送到武漢天一輝遠(yuǎn)生物公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR） 選取腦梗死組和對(duì)照組患者各80例，收集靜脈血2 ml，取200μl血用DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取DNA，剩余血液用Trizol（美國(guó)Invitrogen公司）試劑提取RNA，純度和濃度用Nanodrop 2000C分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher公司）檢測(cè)，將提取的RNA置于-80℃冰箱保存。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。TOMM40基因正向引物：5’-CATCCAGACCCAGCAGTCG-3’，反向引物：5’-GAGGTAGTGGGCTACGAGGA-3’，選 取 3- 磷酸甘油醛脫氫酶為內(nèi)參基因。內(nèi)參基因正向引物：5’-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’，反向引物：5’-GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3’?？偡磻?yīng)體系為20μl。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)2次，取2次檢測(cè)的平均值。用2-ΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或中位數(shù)和四分位數(shù)間距M（P25，P75）表示，比較用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）或構(gòu)成比表示，比較用χ2檢驗(yàn)，群體基因型用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組年齡、性別及LDL-C比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué) 意 義（P＞0.05）；兩 組 SBP、DBP、GLU、TC及TG、HDL-C比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 兩組基因型和等位基因的頻率比較

兩組TOMM40基因rs2075650位點(diǎn)AA、AG及GG基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組A、G等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。腦梗死組顯性模型AA與AG+GG基因型頻率分別占83.63%和16.37%，對(duì)照組分別為77.84%和22.16%，兩組AA與AG+GG基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義0.942）P=0.019]，腦梗死組隱性模型GG與AG+AA基因型頻率分別占1.18%和98.82%，對(duì)照組分別為2.55%和97.45%，兩組GG與AG+AA基因型頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2和附圖。

表1 兩組一般資料比較

表2 兩組患者基因型和等位基因頻率比較 例（%）

附圖 HRM對(duì)TOMM40基因rs2075650位點(diǎn)的分型圖

2.3 兩組TOMM40 mRNA表達(dá)水平比較

腦梗死組TOMM40mRNA表達(dá)量為3.91（1.71，6.49），對(duì)照組為7.84（6.24，10.18），經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-6.834，P=0.000），腦梗死組低于對(duì)照組。

3 討論

TOMM40基因位于19q13.2，是外膜轉(zhuǎn)位酶形成的復(fù)合體，介導(dǎo)核基因編碼的蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入線粒體的傳遞。TOMM40位于載脂蛋白E（apolipoprotein E,APOE）上游，其中的幾個(gè)單核苷酸多態(tài)性與APOE具有連鎖不平衡[4-5]。TOMM40與阿爾茨海默病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、長(zhǎng)壽及認(rèn)知障礙等有關(guān)[6-8]。APOE可能與TOMM40相互作用而影響線粒體功能[9]。線粒體被認(rèn)為是所有細(xì)胞的動(dòng)力，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，為神經(jīng)元的存活提供能量[10]。線粒體中99%蛋白質(zhì)都是由核基因編碼合成再轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中，而TOMM40幾乎為所有核編碼的線粒體蛋白質(zhì)入口的重要組成部分，TOMM40的減少或功能障礙導(dǎo)致一些重要的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入線粒體發(fā)揮作用，影響線粒體的功能和神經(jīng)元的存活[11]。HAINES等[12]發(fā)現(xiàn)敲除小鼠的解偶聯(lián)蛋白2（uncoupling protein 2,UCP2）基因能使缺血再灌注小鼠腦組織的梗死面積增加，敲除UCP2后能抑制缺血再灌注后的抗氧化基因。UCP2能夠保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，改善腦血管功能障礙[13-14]。UCP2的表達(dá)下調(diào)還與動(dòng)脈粥樣硬化、血管損傷有關(guān)，影響神經(jīng)傳遞，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生有重要影響[15]。解偶聯(lián)蛋白屬于線粒體載體蛋白超家族，TOMM40的缺乏可能影響解偶聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體發(fā)揮作用，從而引起線粒體功能障礙，影響腦組織的功能。

本研究中腦梗死組與對(duì)照組TOMM40基因的rs2075650位點(diǎn)之間基因型和等位基因的頻率分布比較有差異，對(duì)照組中突變等位基因G的頻率高于腦梗死組，腦梗死組和對(duì)照組的顯性模型（AA vs AG+GG）基因型頻率也有差異，說(shuō)明該基因位點(diǎn)可能與腦梗死的發(fā)病相關(guān)。YAMASE等[16]發(fā)現(xiàn)TOMM40的rs2075650位點(diǎn)與腦梗死有相關(guān)性，且次要等位基因G是腦梗死的保護(hù)性基因，與本研究結(jié)果一致。對(duì)相關(guān)指標(biāo)的分析表明，血壓、GLU及TG是腦梗死發(fā)病的危險(xiǎn)因素，HDL-C可能是腦梗死的保護(hù)性指標(biāo)，這符合傳統(tǒng)的研究結(jié)果。然而本研究中兩組LDL-C比較無(wú)差異，可能是腦梗死患者所用藥物及人群選擇差異導(dǎo)致。qRT-PCR結(jié)果顯示，對(duì)照組的TOMM40 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于腦梗死組。機(jī)制可能是腦梗死患者TOMM40 mRNA表達(dá)量下調(diào)影響核基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)入線粒體，導(dǎo)致一些關(guān)鍵性蛋白質(zhì)不能發(fā)揮作用，線粒體的功能障礙、腦組織能量不足等可能導(dǎo)致腦梗死的發(fā)生。LEE等[17]發(fā)現(xiàn)TOMM40 mRNA在阿爾茨海默病患者中表達(dá)下調(diào)，該疾病的發(fā)生可能也與TOMM40相關(guān)蛋白質(zhì)無(wú)法正常發(fā)揮作用有關(guān)。

綜上所述，本研究用HRM技術(shù)對(duì)腦梗死組和對(duì)照組TOMM40的rs2075650位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，并用qRT-PCR檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)武漢地區(qū)中老年漢族人群中該基因位點(diǎn)與腦梗死的發(fā)病相關(guān)。