蔡佳佳，石 達(dá)，郭廣武，吳 松※

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[1]。最新的統(tǒng)計數(shù)據(jù)預(yù)估2018年美國新發(fā)膀胱癌患者6.2萬例，其發(fā)病率位于男性癌癥的第4位[2]；最新的中國癌癥統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)顯示，2014年中國新發(fā)膀胱癌7.8萬例[3]。膀胱癌可分為肌層浸潤型膀胱癌(muscle invasive bladder cancer，MIBC)和非肌層浸潤型膀胱癌,其中非肌層浸潤型膀胱癌的治療方式包括經(jīng)尿道切除術(shù)和術(shù)后化療或術(shù)后膀胱內(nèi)卡介苗灌注治療等[1]。灌注治療(免疫治療的一種方式)可降低疾病復(fù)發(fā)、侵襲和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險[4]。MIBC或轉(zhuǎn)移性膀胱癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方式是根治性全膀胱切除術(shù)和盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)后輔以化療，對不能從一線化療中獲益或不符合化療標(biāo)準(zhǔn)的患者可選擇免疫治療的方案[5]。MIBC免疫治療具備顯著有效性、持續(xù)反應(yīng)性和較低毒性的特點[6-8]。程序性死亡受體1(programmed cell death 1,PD-1)與對應(yīng)的配體——程序性死亡配體1(programmed cell death ligand-1,PD-L1)結(jié)合時可抑制免疫系統(tǒng)，形成腫瘤免疫逃逸的現(xiàn)象[9]。PD-1/PD-L1抑制劑是MIBC患者有效免疫治療藥物之一，能明顯延長患者總體生存期，但膀胱癌患者對非精準(zhǔn)免疫治療的客觀緩解率僅為15%～21%,大部分患者不能從中受益[6,10-12]。因此，需尋找指導(dǎo)精準(zhǔn)免疫治療的方案提高治療有效率。近年來，癌癥基因組學(xué)的發(fā)展為實現(xiàn)癌癥個性化治療提供了新方向，人類癌癥對藥物反應(yīng)的分子特征也得到補(bǔ)充[13]?，F(xiàn)從MIBC患者對PD-1/PD-L1抑制劑反應(yīng)的分子特征圖譜方面進(jìn)行總結(jié)分析。

1 MIBC分子特征圖譜與PD-1/PD-L1的關(guān)系

腫瘤抗原或被T細(xì)胞識別表位的缺乏、腫瘤組織中浸潤性T細(xì)胞過少和免疫抑制因子增多均可導(dǎo)致免疫治療失敗[14]。免疫系統(tǒng)激活的過程可分為以下7步：①腫瘤細(xì)胞抗原產(chǎn)生；②腫瘤抗原的呈遞；③免疫系統(tǒng)激活；④T細(xì)胞向腫瘤組織趨化；⑤腫瘤組織中出現(xiàn)浸潤性T細(xì)胞；⑥T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞識別；⑦T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞[14]。腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PD-L1與免疫細(xì)胞表面PD-1結(jié)合而激活的信號通路可抑制免疫活性，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸；PD-1/PD-L1抑制劑通過阻斷以上生物過程可增強(qiáng)免疫活性來殺傷腫瘤細(xì)胞[15]。PD-1/PD-L1抑制劑治療MIBC患者是否成功也取決于以上免疫系統(tǒng)激活的7個步驟，其中突變抗原、PD-L1的表達(dá)量和γ干擾素的表達(dá)量等均可影響免疫治療效果[16]。通過研究以上因素相關(guān)的基因突變和表達(dá)情況可間接預(yù)測PD-1/PD-L1抑制劑在MIBC治療中的反應(yīng)情況[16]?；蚪M計劃產(chǎn)生的大量高通量基因組學(xué)的數(shù)據(jù)促進(jìn)了膀胱癌分子層面的研究，使膀胱癌分子圖譜得到完善，有助于研究者們促進(jìn)膀胱癌精準(zhǔn)免疫治療的發(fā)展[17-18]。

2012年，Sj?dahl等[19]根據(jù)93例MIBC樣本中11種特定基因的RNA表達(dá)量將其分為5種亞型，分別為Urobasal A型、Urobasal B型、基因組不穩(wěn)定型、滲出型和鱗狀細(xì)胞癌樣型；其中浸潤型膀胱癌中表現(xiàn)出免疫細(xì)胞特征。2014年，Damrauer等[20]根據(jù)數(shù)據(jù)庫中MIBC基因表達(dá)數(shù)據(jù)的Meta分析結(jié)果將其分為管腔樣和基底樣兩個亞型，研究表明管腔樣亞型高表達(dá)UPK1B、UPK2、UPK3A和KRT20，而基底樣亞型則高表達(dá)膀胱癌基底細(xì)胞標(biāo)志物，如KRT14、KRT5和KRT6B；建立的BASE47基因集可將MIBC亞型進(jìn)行準(zhǔn)確分類。Choi等[21]對73例MIBC樣本的mRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，將其分為3個不同的亞型，分別為基底型、管腔型和p53樣型，其中p53樣型膀胱癌對于大多化療藥物抵抗，且化療抵抗的樣本中均能發(fā)現(xiàn)p53樣亞型的癌細(xì)胞。

2014年癌癥基因組圖譜研究團(tuán)隊對131例MIBC組織的分子特征(主要包括DNA、RNA、蛋白質(zhì))進(jìn)行探索，將患者DNA突變情況分為A、B、C三個亞型，其中A型為集中擴(kuò)增型，B型為乳突狀CDKN2A缺失-FGFR3突變型，C型為TP53/細(xì)胞周期突變型；根據(jù)mRNA表達(dá)量將MIBC分為4個亞型，分別為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型，其中Ⅰ型和Ⅱ型高表達(dá)人表皮生長因子受體2和雌激素受體，為膀胱癌的靶向治療提供了理論基礎(chǔ)[18]。2015年，研究者根據(jù)MIBC組織的mRNA表達(dá)量、體細(xì)胞拷貝數(shù)變異和基因突變的綜合分型(consensus clusters,CC)將其劃分為CC1型、CC2型和CC3型三個亞型；研究發(fā)現(xiàn)該分型與其他分型的亞型具有相似的特征，如CC3型與基底型和管腔型具有相似的特征[22]。

2017年，Robertson等[17]則根據(jù)408例MIBC的mRNA數(shù)據(jù)將其分為5種不同的亞型，即管腔-乳頭狀型、管腔滲透型、管腔型、基底狀/鱗狀型和神經(jīng)元型，同時發(fā)現(xiàn)管腔滲透型與2014年定義的Ⅱ型膀胱癌表達(dá)特征相似并均對基于順鉑的化療不敏感,但對免疫檢查點抑制劑敏感。另一項研究則發(fā)現(xiàn)2014年定義的Ⅱ型轉(zhuǎn)移性或不可手術(shù)的膀胱癌患者對atezolizumab(PD-L1抑制劑)敏感[6]。研究表明分子特征圖譜展示的信息與癌癥的臨床病理特征及藥物反應(yīng)相關(guān)[10]，根據(jù)藥物作用靶點和癌細(xì)胞基因組學(xué)改變情況可針對性地選擇癌癥治療有效的藥物[17]。因此，疾病分子特征圖譜成為輔助指導(dǎo)治療的新方法，有助于臨床醫(yī)師獲得更多基因組學(xué)信息并實行精準(zhǔn)化醫(yī)療。

2 膀胱癌分子特征圖譜在PD-1/PD-L1抑制劑治療中的應(yīng)用

美國食品藥品管理局批準(zhǔn)5種免疫治療藥物用于化療失敗或者不符合化療標(biāo)準(zhǔn)的晚期膀胱癌患者的治療[6-8]。其中，atezolizumab(PD-L1抑制劑)和pembrolizumab(PD-1抑制劑)已被用作基于順鉑化療方案無效的晚期或轉(zhuǎn)移性膀胱癌患者的一線治療方案[23]。同時，另一項研究表明免疫檢查點抑制劑治療的反應(yīng)性與基因組不穩(wěn)定性相關(guān)[24]。膀胱癌患者的分子特征可能也與免疫治療應(yīng)答相關(guān)。

2.1基因突變與PD-1/PD-L1抑制劑反應(yīng)效果的關(guān)系

2.1.1特定基因突變對療效的影響 研究發(fā)現(xiàn)超過30%的膀胱癌患者存在非同義突變[25],另一項研究則在膀胱癌中發(fā)現(xiàn)多個調(diào)控染色體重組的基因突變，如KDM6A、CREBBP、EP300和ARID1A[26-27]?；蚪M改變不僅可導(dǎo)致癌細(xì)胞信號通路發(fā)生改變(如p53/Rb細(xì)胞周期通路、受體酪氨酸激酶/磷脂酰肌醇-3-激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白增殖通路和組蛋白修飾染色質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò))，也會使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生新抗原[28]。在腫瘤發(fā)生過程中由體細(xì)胞突變產(chǎn)生的特異性新抗原已被證明能誘導(dǎo)高度選擇性的T細(xì)胞應(yīng)答[29]。突變導(dǎo)致新抗原的產(chǎn)生可激活免疫系統(tǒng)的啟動，影響免疫系統(tǒng)激活的第一步[14]。研究表明腫瘤細(xì)胞因體細(xì)胞突變產(chǎn)生的新抗原與PD-1和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4抑制劑治療療效呈正相關(guān)[30]。

2.1.2腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutational burden,TMB)對療效的影響 TMB是指腫瘤基因組中每個編碼區(qū)的突變總數(shù),在黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌中TMB與免疫檢查點抑制劑的應(yīng)答率相關(guān)[24-31]。研究表明TMB高的患者抗細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4治療效果更好[32]。一項415例MIBC患者的Ⅱ期臨床試驗表明TMB不僅與患者的預(yù)后相關(guān)，也可用于預(yù)測atezolizumab的治療反應(yīng)效果[6]；同時，另一項374例膀胱癌患者的臨床研究也得到了同樣的結(jié)論。Balar等[7]則用公式表明兩者間的關(guān)系：客觀緩解率=10.8×log(X)-0.7(其中X表示DNA每兆編碼區(qū)突變數(shù))，該公式可用于預(yù)測腫瘤對PD-1抑制劑治療的反應(yīng)效果。這些結(jié)果提示TMB對免疫治療反應(yīng)結(jié)局的預(yù)測具有一定的應(yīng)用前景，但關(guān)于TMB是來源于全外顯子測序還是特定某些基因的測序結(jié)果的觀點尚未統(tǒng)一，仍需更多樣本的前瞻性研究進(jìn)行探索。

2.1.3高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability-high，MSI-H)和錯配修復(fù)缺陷(mismatch repair deficient，dMMR)對療效的影響 研究表明基因突變率高的患者具有特定DNA損傷反應(yīng)缺陷，如MSI-H和dMMR[33]。臨床試驗表明具有MSI-H或dMMR特征的實體瘤患者對PD-1抑制劑的有效率更高[34]。這可能是因為dMMR特征腫瘤表達(dá)突變相關(guān)的新抗原進(jìn)而識別腫瘤細(xì)胞，并激活抗腫瘤免疫[34]。美國食品藥品管理局基于149例實體瘤患者的臨床試驗結(jié)果批準(zhǔn)默沙東公司生產(chǎn)的pembrolizumab用于治療診斷為MSI-H或dMMR的實體瘤患者[35]。5個KEYNOTE試驗結(jié)果表示具有MSI-H和dMMR特性的人群在經(jīng)過pembrolizumab治療后生存期達(dá)到6個月甚至更長時間的反應(yīng)比率達(dá)到78%[34]。MIBC、遺傳性非息肉病性結(jié)直腸和子宮內(nèi)膜癌疾病的一個重要特征是MSI-H，其中MIBC患者中具有該類特征的概率為5%[36-37]，表明MIBC患者的基因突變特征可用于預(yù)測免疫治療效果。

2.2表達(dá)異常與PD-1/PD-L1抑制劑療效的關(guān)系

2.2.1PD-L1表達(dá)對療效的影響 腫瘤細(xì)胞可通過表達(dá)PD-L1躲避免疫監(jiān)視進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，PD-L1抑制劑則可阻斷該生物過程[8]。在膀胱腫瘤中免疫組織化學(xué)實驗測量的PD-L1表達(dá)與切除術(shù)后病理分級增高和病死率增加有關(guān)，表明PD-L1的表達(dá)可作為預(yù)后因素[38-39]。臨床試驗表明膀胱癌中PD-L1表達(dá)量的改變與PD-L1抗體免疫療效相關(guān)[8]，但以此作為評估免疫治療效果的生物標(biāo)志物存在一些難以解決的問題：①檢測樣本時使用的實驗方法不同。如在檢測nivolumab(PD-1抑制劑)療效的臨床試驗中使用Dako實驗檢測PD-L1的表達(dá)量，但是在durvalumab(PD-L1抑制劑)的臨床試驗中則使用Ventana實驗方法檢測其表達(dá)量[40]。②檢測過程中使用的抗體不同。一項針對90例非小細(xì)胞肺癌隊列的研究中，比較22C3、28-8、SP263和SP142抗體檢測PD-L1的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞使用SP142抗體檢測時得到的PD-L1表達(dá)量最少[41]。③檢測樣本的組織來源不同。在一項研究中，研究者選擇免疫細(xì)胞表達(dá)的PD-L1作為腫瘤組織PD-L1的表達(dá)量[42]，而另一項研究檢測PD-L1的表達(dá)量卻來源于腫瘤細(xì)胞[43]。④腫瘤組織內(nèi)PD-L1的表達(dá)量存在異質(zhì)性，非小細(xì)胞肺癌檢測PD-L1表達(dá)量時，檢測腫瘤組織的不同部位得到的結(jié)果相差近25%[44]。這些研究表明PD-L1的檢測結(jié)果受實驗方法、抗體、組織來源和瘤內(nèi)異質(zhì)性的影響。

除此之外，關(guān)于PD-L1表達(dá)陽性的定義也尚未統(tǒng)一，部分研究者認(rèn)為若有5%以上的腫瘤組織表達(dá)PD-L1則為PD-L1表達(dá)陽性[45]，而另外一些研究者則定義12%以上膀胱癌細(xì)胞表達(dá)PD-L1才為PD-L1陽性[39]。為解決實驗方法帶來的檢測結(jié)果誤差，Huang等[46]通過檢測PD-L1信號通路mRNA的表達(dá)量來取代免疫組織化學(xué)方法檢測PD-L1蛋白表達(dá)水平。該研究納入3個不同的膀胱癌患者的隊列，共695個樣本，使用微陣列基因表達(dá)數(shù)據(jù)表明PD-L1的高表達(dá)導(dǎo)致患者的預(yù)后較差。這一研究方法從轉(zhuǎn)錄組水平對PD-L1的表達(dá)進(jìn)行定量，避免了利用免疫組織化學(xué)方法所致的檢測結(jié)果不穩(wěn)定。

使用PD-L1狀態(tài)作為預(yù)測的生物標(biāo)志物只參考了腫瘤微環(huán)境的一個因素，但腫瘤微環(huán)境還受很多其他因素影響[47-48]。Ock等[49]根據(jù)CD8A和PD-L1的表達(dá)量將腫瘤微環(huán)境免疫類型分為4種亞型，與其他亞型相比，CD8A和PD-L1表達(dá)量增高的Ⅰ型患者具有更高的TMB和更多的新抗原，這些特征導(dǎo)致其對PD-1和PD-L1抑制劑更加敏感。

2.2.3基因表達(dá)譜對療效的影響 研究表明，基因表達(dá)譜是預(yù)測化療和免疫治療效果的有效生物標(biāo)志物[52-53]。Rosenberg等[6]將膀胱癌據(jù)根據(jù)TCGA(腫瘤基因組圖譜)的分類方法進(jìn)行分子分型后，發(fā)現(xiàn)該分型與PD-L1拮抗劑治療效果相關(guān)；其中，在基底型膀胱癌中表達(dá)PD-L1的腫瘤細(xì)胞比重達(dá)到39%，而在管腔樣膀胱癌中僅為4%；但基底型膀胱癌中PD-L1的表達(dá)量增加與PD-1/PD-L1反應(yīng)性并不呈正相關(guān)[6]。與其他亞型相比，經(jīng)過順鉑治療的管腔Ⅱ型膀胱癌患者對atezolizumab的反應(yīng)更加靈敏[6]，可能因為該亞型基因表達(dá)特征與活化T細(xì)胞表達(dá)相關(guān)。這一結(jié)論在對順鉑治療耐受的管腔型膀胱癌患者中也得到驗證[23]。管腔型可能是潛在的預(yù)測膀胱癌亞型對免疫治療有效的生物標(biāo)志物，但仍需要更大的樣本對這一結(jié)論進(jìn)行驗證。

以上研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了癌細(xì)胞、免疫系統(tǒng)和腫瘤微環(huán)境之間復(fù)雜的相互作用，這一現(xiàn)象在所有類型的癌癥中普遍存在，包括MIBC，提示在研究藥物治療反應(yīng)過程中，對單方面因素進(jìn)行預(yù)判存在結(jié)果偏差，故需對多種因素進(jìn)行綜合考慮。

3 結(jié) 語

近30年來，關(guān)于MIBC的治療方案尚無重大進(jìn)展[54]。免疫治療可延長MIBC患者生存期，療效具有持續(xù)性、低毒性等特點；但不同的患者對PD-1/PD-L1抑制劑的治療效果不同。因此，MIBC患者需更精確的用藥指導(dǎo)。通過對MIBC患者基因突變及表達(dá)等分子信息與藥物療效間的關(guān)系進(jìn)行研究及明確MIBC患者的分子特征圖譜與PD-1/PD-L1抑制劑療效間的關(guān)系，研究結(jié)果表明腫瘤突變抗原、TMB情況、MSI-H或dMMDR特征、PD-L1表達(dá)情況、特定基因表達(dá)情況和基因表達(dá)譜與免疫治療應(yīng)答情況相關(guān)。因此，根據(jù)分子特征圖譜針對性選擇藥物對指導(dǎo)患者進(jìn)行精準(zhǔn)免疫治療具有一定的意義。

但實現(xiàn)PD-1/PD-L1抑制劑對MIBC患者的精準(zhǔn)免疫治療仍面臨一些問題。①目前尚沒有準(zhǔn)確率特別高的單一生物標(biāo)志物對藥效進(jìn)行評估，這可能與免疫檢查點抑制劑的作用機(jī)制相關(guān)，免疫應(yīng)答效果受多種因素的影響，如治療過程中腫瘤細(xì)胞不斷發(fā)展產(chǎn)生新突變抗原；腫瘤組織內(nèi)存在異質(zhì)性；PD-L1檢測方式尚未標(biāo)準(zhǔn)化。②獲取MIBC患者的分子特征圖譜的分析方法尚未統(tǒng)一，準(zhǔn)確性最高的分子特征也未達(dá)成共識，MIBC的分子特征圖譜與MIBC免疫治療效果間的關(guān)系需更大的臨床隊列進(jìn)行驗證。③特征圖譜的準(zhǔn)確模式識別有待進(jìn)一步優(yōu)化，提高其準(zhǔn)確性。通過多種生物標(biāo)志物對MIBC患者分子特征進(jìn)行綜合評估可提高預(yù)測MIBC對PD-1/PD-L1抑制劑治療反應(yīng)的準(zhǔn)確性，同時也需要擴(kuò)大臨床隊列研究對其進(jìn)行驗證，實現(xiàn)對MIBC患者的精準(zhǔn)免疫治療。