王雨潔，范小琴，宋 健，吳漢偉,王宇洋，陸 璐，聶國輝

(1.中山大學附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科，廣州 510080； 2.深圳市第二人民醫(yī)院耳鼻喉科，轉化醫(yī)學研究院，廣東 深圳 518035)

鼻咽癌作為中國南方高發(fā)癌癥，其治療方式主要以放療為主，輔以化療，鮮有靶向治療在鼻咽癌中的應用，而對于鼻咽癌晚期、復發(fā)及轉移的患者，常規(guī)治療收效甚小，靶向治療在鼻咽癌中的應用研究極具價值。B細胞淋巴瘤/白血病2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)家族蛋白在細胞凋亡過程中起關鍵作用，根據(jù)其功能該家族蛋白分為兩類：一類是抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL、髓細胞白血病1(myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)等；另一類是促凋亡蛋白，包括Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、Bcl-2同源拮抗劑/殺傷劑(Bcl-2 homologous antagonist/killer，Bak)、Bcl-2樣蛋白11(Bcl-2-like protein 11，Bim)、佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯誘導的蛋白質1(phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1，PMAIP1/Noxa)等[1]。之前的研究表明，多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)抗凋亡蛋白(包括Bcl-2、Bcl-xL及Mcl-1)的高表達，在腫瘤細胞的無限增殖中起重要作用[2]。目前，以腫瘤中異常高表達的抑凋亡蛋白為靶點的藥物研究成為抗癌藥物的研究熱點，多種Bcl-2家族抑制劑處于臨床及臨床前研究中[3]。Bcl-2家族抗凋亡蛋白在鼻咽癌細胞系及腫瘤組織中均呈現(xiàn)高表達，且該蛋白的高表達可能是導致鼻咽癌細胞對于化療藥物抗性的原因之一[4]。

ABT-263是由雅培制藥公司研發(fā)的一種口服型Bcl-2小分子抑制劑，其在實體瘤治療上已有多項臨床試驗，并且對Bcl-2、Bcl-xL及Bcl-2樣蛋白2等抑凋亡蛋白的抑制作用可以緩解B淋巴細胞瘤選擇性抑制產生的抗性問題[5]。本研究擬探討ABT-263對鼻咽癌增殖及凋亡的影響，以助于闡明ABT-263誘導鼻咽癌細胞凋亡的具體作用機制，為B淋巴細胞瘤家族蛋白靶向抑制劑在鼻咽癌治療中的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1材料 人鼻咽癌細胞系5-8F來自深圳市第二人民醫(yī)院李澤松課題組；RPMI(洛斯維·帕克紀念研究所)-1640細胞培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液購自美國Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；細胞計數(shù)試劑盒8(cell counting Kit-8，CCK-8)購自日本同仁化學研究所；Annexin V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-fluoresceine isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI)雙染試劑盒購自美國BD公司；兔抗人Bcl-2、胱天蛋白酶3(caspase-3)抗體購自美國Proteintech公司；兔抗人Mcl-1、Bcl-xL、Bak、Bax、Bim、Actin抗體購自美國CST公司；鼠抗人Noxa抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的鼠源、兔源二抗購自美國Abcam公司。

1.2細胞培養(yǎng) 人鼻咽癌細胞5-8F使用含有10% 胎牛血清及100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3CCK-8法檢測鼻咽癌細胞的增殖活力 在96孔板每孔中種植1×104個5-8F細胞，培養(yǎng)過夜后換不含血清的培養(yǎng)基饑餓4 h，隨后根據(jù)加入ABT-263藥物濃度的不同分為0、0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 μmol/L組,每組設有6個平行實驗。孵育培養(yǎng)24 h后，每孔加入含有10 μLCCK-8后孵育2 h，在不含細胞的100 μL培養(yǎng)基中加入10 μL CCK-8作為空白對照，隨后使用酶標儀檢測450 nm的吸光值。細胞存活率%=(實驗組吸光值-空白對照吸光值)/(對照組吸光值-空白對照吸光值)×100%。

1.4Annexin V-FITC/PI法檢測鼻咽癌細胞的凋亡 將5-8F細胞以1×106每孔的密度種植于6孔板中，培養(yǎng)過夜后換為不含血清的培養(yǎng)基饑餓4 h，根據(jù)加入ABT-263藥物濃度的不同分為0、0.5、1 μmol/L組，細胞使用0、0.5 μmol/L及1 μmol/L ABT-263處理24 h，隨后消化收集細胞，計數(shù)，調整細胞濃度，均使用Annexin V-FITC/PI染液染色15 min后，在1 h內使用流式細胞儀檢測。凋亡率為Q1-UR和Q1-LR兩個象限細胞數(shù)的合計。

1.5免疫印跡法檢測目的蛋白的表達 將5-8F細胞以3×106的密度鋪于10 mm培養(yǎng)皿中，同樣培養(yǎng)過夜后換不含血清的培養(yǎng)基饑餓4 h，隨后根據(jù)加入ABT-263藥物濃度的不同將細胞分為0、0.5、1 μmol/L組。分別使用0、0.5、1 μmol/L ABT-263處理24 h后，收集細胞，每皿細胞加入200 μL含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰上放置40 min，隨后4 ℃，18 800×g，離心15 min，將上清轉移至新的EP管。測定細胞裂解液中的蛋白濃度后調整至濃度一致，隨后使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離，每孔加入20 μg蛋白，電泳完畢后，將蛋白轉印至聚偏氟乙烯膜。轉印后的聚偏氟乙烯膜使用5%的脫脂牛奶封閉1 h，隨后與一抗(1∶1 000)在4 ℃孵育過夜，使用洗滌緩沖液洗膜3次，每次15 min，然后與二抗(1∶5 000)孵育2 h，再使用洗滌緩沖液洗膜3次，每次15 min，最后利用化學發(fā)光液在顯影儀上進行曝光。曝光結果通過Amersham Imager儀器(美國)采集，使用Image J軟件計算蛋白條帶灰度，最后以Actin蛋白作為內標計算蛋白濃度變化。

2 結 果

2.1ABT-263抑制鼻咽癌細胞5-8F的增殖 各組ABT-263處理后細胞吸光值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 μmol/L組吸光值低于0 μmol/L組(P<0.05)，見表1。

組別 吸光值0 μmol/L組0.856±0.0170.031 25 μmol/L組0.883±0.0240.062 5 μmol/L組0.812±0.0200.125 μmol/L組0.696±0.020a0.25 μmol/L組0.527±0.015a0.5 μmol/L組0.465±0.022a1 μmol/L組0.323±0.010a2 μmol/L組0.133±0.004a4 μmol/L組0.057±0.002a8 μmol/L組0.028±0.002aF值 444.582P值 <0.001

a與0 μmol/L組比較，P<0.05

2.2ABT-263誘導鼻咽癌細胞5-8F的凋亡 Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡實驗結果顯示，加入0.5 μmol/L ABT-263后引起約6% 5-8F細胞凋亡，1 μmol/L ABT-263能誘導約10%的細胞凋亡，見圖1A。同時免疫印跡實驗結果顯示，在0.5 μmol/L ABT-263的作用下，較0 μmol/L組caspase-3剪切體蛋白含量升高約28%，1 μmol/L ABT-263引起約30% caspase-3剪切體蛋白的增加，見圖1B。

2.3ABT-263影響B(tài)cl-2家族蛋白的表達 將ABT-263處理5-8F細胞后，使用免疫印跡法檢測Bcl-2家族蛋白的結果顯示，與0 μmol/L 組相比，0.5 μmol/L與1 μmol/L ABT-263處理后鼻咽癌細胞中抑凋亡蛋白的表達變化：兩種濃度下Bcl-xL蛋白表達升高20%～30%，Mcl-1蛋白的表達量約升高為原來的2倍，Bcl-2的表達量為其80%左右；促凋亡蛋白的表達變化：Bak的表達量在兩種濃度下略有增加，Bim相關蛋白表達量變化不大，在兩種濃度處理下Noxa表達量分別升高為0 μmol/L 組的3.3倍及7倍。見圖2、表2。

A:流式細胞術分析ABT-263處理后引起5-8F的細胞凋亡；B:ABT-263處理后引起caspase-3蛋白的切割激活

圖1ABT-263誘導5-8F細胞的凋亡

圖2 免疫印跡法檢測ABT-263處理后5-8F細胞中Bcl-2家族蛋白的表達量變化表2 不同濃度ABT-263處理后引起B(yǎng)cl-2家族蛋白表達的相對變化

蛋白0 μmol/L0.5 μmol/L1 μmol/LMcl-111.651.80Bcl-xL11.331.23Bcl-210.880.79Bim(EL)11.191.15Bim(L)12.152.05Bim(S)11.271.23Noxa13.326.87Bak11.261.26Bax10.891.06

3 討 論

鼻咽癌是中國南方地區(qū)高發(fā)癌癥，常見于男性，發(fā)病率可達(10～30)/100 000，在各類頭頸癌中具有較高的轉移率，嚴重威脅人們身體健康[6]。多數(shù)鼻咽癌患者早期無明顯癥狀或癥狀不典型，所以早期診斷率低，在其發(fā)展過程中通常伴隨著腫瘤的遠端轉移，包括骨轉移、肺轉移、肝轉移及遠端淋巴結轉移，增加了鼻咽癌的治療難度，患者5年生存率仍停留在60%～70%[7-8]。目前，鼻咽癌的治療方案以放療為主，輔以化療。但對于復發(fā)及發(fā)生轉移的鼻咽癌患者，放療方案治療的存活率顯著下降且不良反應發(fā)生率較高，而靶向治療由于不良反應較小，在癌癥治療中逐漸發(fā)揮越來越重要的作用。但目前靶向治療在鼻咽癌治療方面的研究尚不成熟，尋找可以作為鼻咽癌治療靶點的蛋白及靶向藥物將有助于提高鼻咽癌患者的生存期及生活質量[9]。

凋亡是一種人體清除由外界刺激造成的基因異變細胞的程序性死亡途徑。越來越多的研究表明，凋亡途徑的異常是很多癌癥發(fā)病的重要原因之一，包含促凋亡及抑制凋亡蛋白的Bcl-2蛋白家族是凋亡的關鍵開關[10-12]。Bcl-2家族中抑凋亡作用蛋白(Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1等)在很多腫瘤組織的表達量增高，且抑制這些蛋白可以促進腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤生長[13]?；谶@一現(xiàn)象，多種Bcl-2家族蛋白抑制劑進入臨床研究。這些抑制劑包括翻譯核苷酸類oblimersen(G3139)[14]、天然產物類(Gossypol)[15]及基于蛋白結構合成的小分子化合物，其中艾伯維公司研究的一系列小分子抑制劑(ABT-263、ABT-737、ABT-199等)效果較為良好。其中，Bcl-2蛋白的選擇性抑制劑ABT-199第一個通過美國食品藥品管理局批準用于臨床治療17p缺失的慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞白血病，并取得了較好的療效。然而，該抑制劑在實體瘤治療中效果欠佳，研究該類抑制劑在實體瘤中的治療作用，將有助于基礎研究及腫瘤治療的臨床應用[16]。

80%的鼻咽癌細胞中Bcl-2蛋白表達量高于正常鼻咽上皮細胞。中國華南地區(qū)鼻咽癌患者中，95%以上伴隨有EB病毒感染，機制研究表明EB病毒蛋白潛伏膜蛋白1及B-Raf原癌基因，絲氨酸/蘇氨酸激酶1是導致鼻咽癌細胞中Bcl-2蛋白高表達及癌變的可能原因[17]。Zhen等[18]研究表明程序性死亡因子4的低表達與鼻咽癌中Bcl-2蛋白的高表達具有相關性。研究表明該蛋白的高表達可能是導致鼻咽癌細胞對化療藥物抗性的原因之一[4]。Bcl-2蛋白的選擇性抑制劑對鼻咽癌細胞的單獨殺滅效果并不明顯[2]，所以研究工作多集中在該類抑制劑聯(lián)合順鉑等化療藥物的應用上。單獨使用Bcl-2家族蛋白靶向藥物抑制鼻咽癌生長的研究較少[19]。針對這一空白，本課題組在之前的研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2抑制劑ABT-199單獨使用也可以有效促進鼻咽癌細胞的凋亡，且與Mcl-1抑制劑聯(lián)合具有協(xié)同效應，為Bcl-2蛋白家族蛋白靶向抑制劑在鼻咽癌治療中的應用提供了基礎[20]。然而以往的研究中單獨應用Bcl-2抑制劑對于鼻咽癌細胞殺滅效果不佳,究其原因可能是給藥后Bcl-2家族其他互補蛋白(Bcl-xL、Mcl-1)的高表達中和了抑制效果。在之前的研究中[20]，使用選擇性Bcl-2蛋白抑制劑ABT-199時同樣伴有Bcl-xL及Mcl-1高表達。ABT-199可以通過正調控Noxa高表達來促進腫瘤細胞凋亡，而化療藥物順鉑同樣是通過正調控Noxa來殺滅腫瘤細胞的[21]。這一結果表明該類分子具有實現(xiàn)鼻咽癌治療的潛力且可以不必與細胞毒性較高的化療藥物聯(lián)用。并且Bcl-2與Mcl-1抑制劑聯(lián)用可以達到更好的鼻咽癌抑制效果[22]。

本研究以ABT-263作為研究對象，相對于ABT-199，ABT-263不僅對Bcl-2有良好的抑制作用，對該家族抑凋亡蛋白Bcl-2樣蛋白2(Bcl-w)及Bcl-xL的抑制活性也在微摩爾以下，對其他促凋亡蛋白，如Bcl-2相關蛋白A1(>1 μmol/L)及Mcl-1(>0.55 μmol/L)也有抑制作用。在其他腫瘤的研究中ABT-263通過抑制Bim與抗凋亡蛋白之間的結合，促進Bax移位、細胞色素C的釋放及caspase-3激活[23]。然而本研究結果顯示，在鼻咽癌細胞系中雖然Bim在ABT-263處理后表達量略有增加，但ABT-263處理后的鼻咽癌細胞中促凋亡蛋白Noxa的表達顯著增高，在0.5 μmol/L及1 μmol/L給藥濃度下Noxa的表達量升高了約3.3及7倍。Noxa可以與抑凋亡蛋白Mcl-1結合釋放游離的Bim。而給藥后Mcl-1的表達量雖增加為0 μmol/L組的 2倍左右，但其表達可以被Noxa的過表達中和。同時研究中caspase-3剪切體表達量在ABT-263給藥后增高，證實了該分子可促進鼻咽癌細胞的凋亡。

綜上所述，ABT-263對于正常細胞的低毒性及對于Bcl-2家族蛋白的靶向性，使其在鼻咽癌治療中具有較高的潛力。由于Bcl-xL是人體血小板生存的必需蛋白[24]，所以進一步臨床應用中ABT-263的用藥需盡量避免對血小板的損傷，發(fā)展新的給藥途徑或聯(lián)合用藥降低劑量進一步減少其對血小板的傷害將會進一步提高該分子在鼻咽癌治療中的應用潛力。