余 怡 王家雄 綜述 楊慎敏 審校

南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院生殖遺傳中心（江蘇蘇州 215002）

全世界目前約有8%～15%的夫婦婚后一年不育，其中男性因素導(dǎo)致的不育占到所有病例的50%。另外，弱精子癥也是導(dǎo)致男性不育的一個(gè)重要因素，弱精子癥的精子總數(shù)和濃度正常，但前向運(yùn)動(dòng)精子＜32%或精子總活力＜40%[1]。

部分弱精子癥與精子尾部特異性的超微結(jié)構(gòu)異常有關(guān)，如原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙（primary ciliary dyskinesia, PCD）、精子鞭毛多發(fā)形態(tài)異常（multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,MMAF）和常染色體顯性多囊腎?。╝utosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD）等，它們與弱精子癥的關(guān)系越來(lái)越受到學(xué)者的關(guān)注。臨床上，與遺傳缺陷有關(guān)的弱精子癥采取經(jīng)驗(yàn)性治療往往收效甚微。光鏡下的精子形態(tài)學(xué)分析和透射電鏡觀察能夠甄別由于精子鞭毛畸形導(dǎo)致的精子運(yùn)動(dòng)障礙，為診斷和治療提供重要依據(jù)。而該類患者的生育結(jié)局也是目前關(guān)注的重點(diǎn)。

一、弱精子癥的部分病因

（一）精子鞭毛的超微結(jié)構(gòu)概述

精子尾部又稱鞭毛，長(zhǎng)徑約55μm，超微結(jié)構(gòu)分4個(gè)部分：頸、中、主、末段。各段組成由內(nèi)向外一般為軸絲、外周致密纖維、線粒體鞘和細(xì)胞膜。正常精子軸絲由中央兩根單獨(dú)的微管與周邊9對(duì)雙聯(lián)微管組成，稱9+2結(jié)構(gòu)。動(dòng)力蛋白臂存在著ATP酶，為A管與B管的滑動(dòng)提供能量，帶動(dòng)鞭毛的運(yùn)動(dòng)。線粒體鞘螺旋盤繞在精子中段，參與能量代謝。這些結(jié)構(gòu)中，主段最長(zhǎng)，約50μm，但該段不含線粒體鞘。主段外周致密纖維周圍有纖維鞘包繞，內(nèi)有糖酵解酶，與精子能量的產(chǎn)生有關(guān)[2,3]。具體結(jié)構(gòu)示意如圖1。

圖1 正常精子鞭毛橫截面結(jié)構(gòu)示意圖[3]

（二）纖毛/鞭毛缺陷導(dǎo)致的弱精子癥

1. 原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙（PCD）：哺乳動(dòng)物的纖毛種類包括初級(jí)纖毛與運(yùn)動(dòng)纖毛兩大類，纖毛主要由纖毛膜、基質(zhì)、軸絲三部分組成，當(dāng)動(dòng)力蛋白臂不能參與纖毛與鞭毛軸絲的組裝時(shí)即引起PCD[2]。PCD主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，如慢性中耳炎、鼻竇炎、支氣管擴(kuò)張和肺部感染等，內(nèi)臟反位（Kartagener綜合征）、腦積水等，部分男性因精子受累而導(dǎo)致弱精子癥和不育[4]。PCD患者呼吸道纖毛透射電鏡下的超微改變主要為外側(cè)動(dòng)力蛋白臂或內(nèi)側(cè)動(dòng)力蛋白臂缺陷等，少數(shù)患者纖毛超微結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)異常[4]。PCD的超微結(jié)構(gòu)缺陷除動(dòng)力蛋白臂外，還包括中心復(fù)合體（central complex，CC）的結(jié)構(gòu)缺陷[5]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過(guò)30個(gè)基因與PCD的發(fā)生有關(guān)，其編碼的蛋白主要影響纖毛動(dòng)力蛋白臂、軸絲、內(nèi)部細(xì)胞骨架的組裝[5]。由于運(yùn)動(dòng)纖毛和精子鞭毛具有共同的軸絲結(jié)構(gòu)，大多數(shù)PCD的男性同時(shí)存在不育癥[6]。法國(guó)的一項(xiàng)多中心多樣本研究發(fā)現(xiàn)，其統(tǒng)計(jì)的49例PCD男性患者中有37例同時(shí)伴有不育，不育男性中精子鞭毛超微結(jié)構(gòu)的改變又以內(nèi)側(cè)動(dòng)力蛋白臂缺陷與微管結(jié)構(gòu)紊亂最常見(jiàn)，達(dá)到43.2%（16/37），其次為內(nèi)側(cè)、外側(cè)動(dòng)力蛋白臂結(jié)構(gòu)缺陷共存，比例為24.3%（9/37）[7]。PCD導(dǎo)致的嚴(yán)重弱精子癥或100%不活動(dòng)精子，其精子鞭毛的光鏡下形態(tài)大致正常，超微結(jié)構(gòu)可見(jiàn)動(dòng)力蛋白臂缺損[8]，但并非所有PCD患者都存在精子鞭毛超微結(jié)構(gòu)異常，部分PCD伴不育的患者透射電鏡觀察正常[8,9]。

越來(lái)越多的PCD致病基因突變被鑒定出，相關(guān)蛋白定位于軸絲微管的放射輻頭部、動(dòng)力蛋白臂、中央微管等結(jié)構(gòu)中，基因突變最終導(dǎo)致相關(guān)結(jié)構(gòu)組裝異常，纖毛/鞭毛運(yùn)動(dòng)功能喪失或嚴(yán)重受損[10]。Olcese等[11]研究發(fā)現(xiàn)PIH1D3的點(diǎn)突變，是導(dǎo)致早期軸絲動(dòng)力蛋白臂組裝中斷的原因之一，P1H1D3蛋白的缺失會(huì)影響內(nèi)側(cè)動(dòng)力蛋白臂相關(guān)結(jié)構(gòu)的組裝，從而引起PCD。部分DNAH11基因突變個(gè)體的纖毛超微結(jié)構(gòu)在透射電鏡下可表現(xiàn)為正常， Shoemark等[12]通過(guò)電子斷層掃描發(fā)現(xiàn)，攜帶DNAH11突變基因的患者的近側(cè)的外側(cè)動(dòng)力蛋白臂體積要比正常對(duì)照組小，提示DNAH11基因主要影響外側(cè)動(dòng)力蛋白臂的組裝。EL等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，并非所有的PCD患者均存在纖毛動(dòng)力蛋白臂的結(jié)構(gòu)缺損，其樣本研究發(fā)現(xiàn)約有15%的PCD患者動(dòng)力蛋白臂正常，而表現(xiàn)為中心復(fù)合體的結(jié)構(gòu)異常，對(duì)其中一位患者測(cè)序發(fā)現(xiàn)了DNAJB13基因突變，該基因編碼熱休克蛋白40（heat shock protein40,HSP40），其同源蛋白在鞭毛蟲體內(nèi)定位于放射輻。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該基因突變后，熱休克蛋白40家族的保守區(qū)域的殘端蛋白穩(wěn)定性下降，同時(shí)還誘發(fā)了溶酶體的降解，這一結(jié)果解釋了該患者精子鞭毛動(dòng)力蛋白臂正常而CC異常的現(xiàn)象。Vanaken等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，在其研究的PCD伴隨不育的病例中，CCDC39、CCDC40基因突變所致的不育比例最高，約為43.2%（16/37），其主要影響內(nèi)側(cè)動(dòng)力蛋白臂與微管結(jié)構(gòu)的組裝，引起鞭毛活力下降，其余的致病基因包括LLRC6、DNAH11、DNAI1等，其中DNAH11突變的精子鞭毛在透射電鏡下并未觀察到超微結(jié)構(gòu)的改變。后期Tang等[14]在中國(guó)MMAF患者中鑒定出了CCDC39突變，提示CCDC39基因在PCD與MMAF的致病中可能有共同的機(jī)制。

2. 精子鞭毛多發(fā)形態(tài)異常（MMAF）：精子鞭毛多發(fā)形態(tài)異常，也稱作精子纖維鞘發(fā)育不良。MMAF患者的精液體積和pH值大都在正常范圍，但出現(xiàn)嚴(yán)重的精子鞭毛畸形和精子運(yùn)動(dòng)障礙。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[15]，患者光鏡下正常尾部精子僅占0.5%～20.5%，異常尾部表現(xiàn)包括無(wú)尾、短尾，尾 部卷曲、彎折、粗細(xì)不規(guī)則等，其中以短尾最多見(jiàn)，約占40.5%～52%，前向運(yùn)動(dòng)精子率0%～3.6%。

透射電鏡觀察可進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MMAF病變精子超微結(jié)構(gòu)，中心微管缺失是MMAF的特征性表現(xiàn)之一，伴隨線粒體鞘缺陷、纖維鞘增厚及動(dòng)力蛋白臂缺失[15-17]。對(duì)MMAF的致病基因的研究近年來(lái)得益于測(cè)序技術(shù)而進(jìn)展[18]。本課題組通過(guò)全外顯子組測(cè)序的方法鑒定出中國(guó)MMAF患者的致病基因DNAH1、CCDC39、CFAP43、CFAP44和CFAP65[14]。其中DNAH1是最為常見(jiàn)的致病基因。DNAH1基因影響精子鞭毛的內(nèi)側(cè)動(dòng)力蛋白臂結(jié)構(gòu)，DNAH1敲除后的純合小鼠表現(xiàn)為精子活動(dòng)力下降、內(nèi)側(cè)動(dòng)力蛋白臂缺失，而外側(cè)動(dòng)力蛋白臂存在，這與人類DNAH1突變的表型一致[19]。CFAP43和CFAP44等位基因敲除小鼠精子鞭毛表現(xiàn)為短尾、卷曲、缺失，與人類MMAF類似[14,16]，Coutton等[16]的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CFAP43和CFAP44基因主要影響Dnah5、Dnali1、Rsph1、Rsph4、Gas8、Spef2的蛋白合成，而這些蛋白分別是動(dòng)力蛋白臂、放射輻、nexin鏈接的組成部分，這為CFAP43和CFAP44基因缺失導(dǎo)致的分子學(xué)水平缺陷提供了證據(jù)。該課題組還使用布氏錐蟲這一模式生物驗(yàn)證了CFAP43、CFAP44蛋白的定位與功能，兩者共同定位于PFR（para flagellar rod），該結(jié)構(gòu)類似與哺乳動(dòng)鞭毛的外周致密蛋白與纖維鞘，連接著雙聯(lián)微管，在鞭毛的運(yùn)動(dòng)中起到重要作用[16,20]。CEP135也是中國(guó)MMAF的致病基因[21]。Akap4、Tekt3、Tekt4和Cabyr的突變導(dǎo)致小鼠鞭毛的結(jié)構(gòu)缺陷，CatSper1、Pgk2、Gapdhs和Ldhc突變會(huì)導(dǎo)致鞭毛的運(yùn)動(dòng)功能缺陷[21,22]。SPEF2基因影響精子尾部附屬器官如軸絲、外周致密蛋白、線粒體鞘等的正常合成與組裝，精子的活力進(jìn)而受到影響[23,24]。Lorès等[25]的近期研究發(fā)現(xiàn)L673P錯(cuò)義突變會(huì)引發(fā)MMAF與男性不育，暫未發(fā)現(xiàn)其能導(dǎo)致PCD。

3. 常染色體顯性多囊腎病（ADPKD）：常染色體顯性多囊腎病是一種遺傳疾病，雙側(cè)腎臟出現(xiàn)廣泛的囊性改變，其發(fā)病多出現(xiàn)在成年時(shí)期的40歲以后，臨床表現(xiàn)為血尿、腎結(jié)石、尿路感染、夜尿增多等，疾病的進(jìn)展往往導(dǎo)致嚴(yán)重的腎功能損傷，發(fā)病率約千分之一，其腎臟外表現(xiàn)可累及男性生殖器官，包括睪丸、附睪、精囊和前列腺的囊腫[26]。男性不育患者中伴有ADPKD的病例已被廣泛報(bào)道[27]，但ADPKD導(dǎo)致男性不育的具體機(jī)制尚未完全明確，而不僅僅是因?yàn)榫映⒔Y(jié)構(gòu)缺陷（動(dòng)力蛋白臂結(jié)構(gòu)缺陷、微管結(jié)構(gòu)缺失或排列紊亂等）。其產(chǎn)生的機(jī)制可能包括：異常的多囊蛋白可能會(huì)對(duì)精液產(chǎn)生異常，ADPKD患者伴發(fā)精囊腺囊腫引起梗阻性少精或無(wú)精子癥，ADPKD患者發(fā)生終末期腎病時(shí)導(dǎo)致不育，ADPKD患者精子鞭毛軸絲缺乏中心微管、多胱氨酸缺陷、PKD基因突變和AZF基因微缺失[28-31]。腎臟上皮細(xì)胞初級(jí)纖毛上有多囊蛋白（polycystin-1、2，PC-1、2）的存在，兩者形成受體通道復(fù)合物,參與上皮細(xì)胞增殖分化的信號(hào)調(diào)控有關(guān)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，編碼兩種蛋白的PKD基因突變后，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)了過(guò)度增殖、管腔增大的多囊腎病理表現(xiàn)。進(jìn)一步遺傳研究發(fā)現(xiàn)，多囊蛋白調(diào)節(jié)未知的纖毛信號(hào)通路（cilia-dependent cyst activation, CDCA），該信號(hào)通常是腎單位結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)維持的一部分，ADPKD發(fā)生是由于完整纖毛缺乏多囊蛋白而失調(diào)時(shí)發(fā)生的，此時(shí)CDCA能夠驅(qū)動(dòng)囊腫的生長(zhǎng)[32]，而該通路是否在維持精子鞭毛超微結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中起作用目前依然未知。

A D P K D的發(fā)生主要與多囊腎致病基因（polycystic kidney disease gene 1、2，PKD1、2,）有關(guān)。GANAB基因，其主要編碼葡萄糖苷酶II亞基α（GIIα）對(duì)PC-1和PC-2的成熟和表面的纖毛定位是絕對(duì)需要的，GANAB基因敲除細(xì)胞中可見(jiàn)成熟PC-1減少，因此GANAB是ADPKD候選基因的一個(gè)重要補(bǔ)充[33]。

二、精子鞭毛缺陷所致弱精子癥的輔助生殖治療

卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）是鞭毛缺陷所致弱精子癥的有效助孕手段[30,34]。對(duì)于射精中100%無(wú)活動(dòng)精子的情況，低滲腫脹試驗(yàn)、精子鞭毛靈活性測(cè)試、激光輔助篩選等技術(shù)可以挑選出活精子，采取睪丸精子也不失為一種有效方式[35,36]。PCD伴有不育的患者可通過(guò)輔助生殖技術(shù)使妻子成功妊娠，妊娠成功率可達(dá)到40.5%（15/37）[7]。MMAF患者可以通過(guò)ICSI使妻子成功妊娠[37,38]，本中心MMAF患者ICSI受精率為51.5%（34/66），短期觀察后代未見(jiàn)異常[38]。伴有ADPKD的嚴(yán)重弱精子癥患者行ICSI治療成功受孕的病例早在上世紀(jì)九十年代已有報(bào)道[30]，蘇煌等[34]報(bào)道的伴有ADPKD的嚴(yán)重弱精子癥患者行ICSI治療結(jié)局回顧性分析結(jié)果顯示15例患者行28個(gè)ICSI周期后有10例取得了臨床妊娠，但單周期妊娠成功率較低，且子代可能面臨一定的遺傳學(xué)風(fēng)險(xiǎn)，采取胚胎植入前遺傳學(xué)診斷可以最大程度地降低后代患病的幾率，目前已有成功案例報(bào)道[39]。

三、展望

對(duì)于嚴(yán)重的男性不育，往往存在明確的病理因素，需要仔細(xì)了解患者病史，并通過(guò)適當(dāng)?shù)妮o助檢查明確病因。PCD、MMAF和存在精子鞭毛結(jié)構(gòu)缺陷的ADPKD，用非特異性治療往往無(wú)效，而這些疾病與男性不育的關(guān)系以及其在男性不育中的機(jī)制依然沒(méi)有得到深入研究。目前大多認(rèn)為PCD、MMAF、ADPKD的共同病理機(jī)制為纖毛/鞭毛結(jié)構(gòu)異常，但這三者在弱精子癥的致病過(guò)程中的是否存在交叉因素依然未知。且當(dāng)今對(duì)這三種疾病導(dǎo)致弱精子癥的研究多局限于纖毛/鞭毛形態(tài)結(jié)構(gòu)與遺傳學(xué)分析，因此亟需更多研究從精子發(fā)生的角度去評(píng)判疾病發(fā)生的分子機(jī)制。日益更新的分子生物學(xué)技術(shù)將逐步揭示這些疾病發(fā)病的分子學(xué)機(jī)制，同時(shí)為選擇合適的治療方式提供理論依據(jù)。PCD、MMAF和存在精子鞭毛結(jié)構(gòu)缺陷的多囊腎的弱精子癥患者，通常選擇ICSI得到受孕，但術(shù)前的遺傳咨詢尤為重要，子代的健康狀況需要更多隨訪。