周敬華 韓瑞鈺 默 義 劉東科 王樹松

河北省計劃生育科學技術(shù)研究院（國家衛(wèi)計委計劃生育與優(yōu)生重點實驗室）（河北石家莊 050071）

非梗阻性無精子癥（non-obstructive azoospermia,NOA）是男性不育的重要原因之一。近年來，遺傳因素在無精子癥發(fā)病中的影響越來越受到人們的重視。目前已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一系列原發(fā)性無精子癥相關(guān)基因，提示了相應(yīng)的人類同源基因極有可能與男性NOA顯著相關(guān)。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP）是人類基因組序列中最常見的一種變異形式，使造成不同個體罹患疾病的風險不同。因此，通過分子生物學手段發(fā)現(xiàn)NOA相關(guān)的潛在風險遺傳因素，進一步揭示相關(guān)基因多態(tài)性與NOA的密切關(guān)系，可闡述疾病的致病機制。本研究采用實時熒光定量Taqman-MGB探針法對NOA患者進行了8個多態(tài)性基因位點的分布研究，以期為無精子癥相關(guān)易感基因或其有效分子標記提供參考。

資料與方法

一、研究對象

本研究的研究方案通過河北省計劃生育科學技術(shù)研究院醫(yī)學倫理委員會。選自于2016年1月至2017年4月在本院就診的NOA病例作為研究組，并且排除梗阻性無精子癥、染色體異常、隱睪、病毒性睪丸炎、精索靜脈曲張、垂體疾病以及全身性疾病等引起的繼發(fā)性不育。NOA患者的診斷基于標準的臨床檢查程序， 包括病史、體格檢查、精液分析 （3次檢查精子濃度為零）、血清生殖激素分析、超聲評價和遺傳學檢測（包括核型分析、Y 染色體微缺失檢測等）。為了避免樣本選擇偏差，任何 NOA 患者含有核型異常、遺傳學異?；?Y 染色體微缺失，均被排除。對照組選用有正常生育史的健康男性，年齡20～45歲。研究組和對照組均被告知研究目的、方法和意義，并簽署知情同意書。

二、材料與試劑

離心柱型血液基因組DNA提取試劑盒（DP348-02，北京天根生化科技有限公司）；TaqMan SNP基因分型試劑盒包括：2×TaqMan Universal PCR Master Mix（ABI 公司），40×SNP Genotyping Assay Mix（ABI 公司）。DNA 的濃度和純度檢測采用Nanodrop 2000 超微量分光光度計（美國 Thermo Scientific公司）將濃度和純度滿足要求的DNA溶液（OD260／OD280值1.6～2.0、質(zhì)量濃度1～20ng）保存于-80℃超低溫冰箱中備用。

三、全血基因組DNA的提取

采集2mL外周靜脈血于EDTA抗凝管中，放置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。全血基因組DNA提取按照試劑盒說明書進行，并用TE溶解。

四、檢測基因多態(tài)性

候選 SNPs 位點具體基本信息見表1。PCR終反應(yīng)體系（10μL）見表2。在ABI 7500型Fast Realtime PCR儀中進行DNA擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件如下：60℃，1min（預(yù)加熱）→95℃，10min（預(yù)變性）→95℃，15s（變性）→60℃，1min（收集熒光），變性、收集熒光進行40個循環(huán)，最后在60℃收集熒光1min。為保證實驗結(jié)果的準確性，每次加樣設(shè)置一個陰性對照（NTC），加樣品的過程中需嚴格避光，以免探針及相關(guān)試劑降解失效。反應(yīng)完成后， 在 ABI 7500 型熒光定量 PCR 儀上讀取樣品孔中的終點熒光，利用TaqMan Genotyper Software Version 1.0.1分析軟件確定各個樣本的基因分型結(jié)果。

表1 TaqMan?-MGB 探針基本信息表

表2 TaqMan?-MGB 探針法RT-PCR 反應(yīng)體系

五、基因型分析

本實驗根據(jù)ABI公司試劑盒信息，對多態(tài)性位點分型時設(shè)定等位基因?qū)?yīng)FAM熒光為Y軸，VIC熒光為X軸，基因型分型采用雙驗證的方法，即散點圖+擴增曲線兩方面驗證，以確?；蚍中蜏蚀_無誤。

六、統(tǒng)計學分析

利用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析，SNP多態(tài)性位點在兩組間的分布差異利用Chi-square檢驗和Fisher exact檢測。 此外，比值比（OR）及95%可信區(qū)間（95% CI）利用非條件Logistic回歸模型計算。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、研究對象

1 9 2例N O A患者作為研究組，平均年齡（30.08±5.38）歲；124例正常健康男性作為對照組，平均年齡（32.05±5.97）歲。兩組間年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

二、基因型頻率與NOA易感性之間的關(guān)系

研究組與對照組中TEX15基因rs323346位點各基因型分別為TT 85.42% vs76.61，CT 13.54%vs 21.39%，CC1.04% vs 0%，兩組基因型構(gòu)成比具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。與TT基因型相比，攜帶CC基因型的個體患NOA的風險是其1.745倍，攜帶CC+CT基因型的個體患NOA的風險較攜帶TT型的個體低（P＜0.05，OR=0.559，95%CI=0.314～0.996）。其余多態(tài)性位點在兩組中各基因型的分布沒有統(tǒng)計學意義。8個SNP多態(tài)性位點基因型頻率的分布及其與研究組易感的相關(guān)性結(jié)果見表3。

表3 多態(tài)性位點基因型頻率與NOA易感性之間的關(guān)系

三、等位基因頻率與NOA易感性之間的關(guān)系

經(jīng)統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示所測 8個位點等位基因頻率分布在研究組和對照組中比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 多態(tài)性位點等位基因頻率與NOA易感性之間的關(guān)系

討 論

無精子癥可分為梗阻性無精子癥和NOA。梗阻性無精子癥主要原因包括先天性發(fā)育異常、精索靜脈曲張和生殖道感染等, 其約占無精子癥患者的 40%[1]。遺傳因素是導(dǎo)致NOA發(fā)生的主要原因，如染色體核型異常、Y染色體微缺失[2]、基因突變與缺失以及基因的單核苷酸多態(tài)性等[3,4]。一些遺傳學研究通過現(xiàn)代核酸測序技術(shù)和大規(guī)模的基因探針，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致 NOA 疾病新的易感基因。但是，仍然有超過 50% 的無精子癥的致病因素不可知[5]。近年來，人們一直在尋找與精子發(fā)生和生精障礙相關(guān)的基因突變、缺失或單核苷酸多態(tài)性[6]以期能更好地闡述疾病的致病機制。已證實，特定基因的單核苷酸多態(tài)性改變與臨床上的原發(fā)性無精子癥存在關(guān)聯(lián)[7-9]。

TEX15 （testis-expressed 15）基因定位于人類染色體8號染色體上，僅僅在睪丸和卵巢中表達[10]，TEX15 轉(zhuǎn)錄物存在于精原細胞和初級精母細胞中，在調(diào)控DNA 斷裂雙鏈上染色體聯(lián)會、DNA 雙鏈修復(fù)和減數(shù)分裂重組過程中起著重要的作用。對歐洲人群研究顯示 TEX15 基因 rs323344 和 rs323345 多態(tài)性在NOA、嚴重少精子癥、中度少精子癥患者與正常生育對照人群存在著差異[11]，而Ruan等[12]則認為rs323346顯著增加了罹患嚴重少精子癥的風險,但未發(fā)現(xiàn)與無精子癥患病的風險顯著相關(guān)。我們的結(jié)果顯示在NOA組中與對照組中TEX15基因rs323346位點各基因型分布具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。與TT基因型相比，攜帶CC基因型的個體患NOA的風險是其1.745倍，攜帶CC+CT基因型的個體患NOA的風險較攜帶TT型的個體低（P＜0.05，OR=0.559，95%CI=0.314-0.996）。而rs6980502位點基因型頻率以及等位基因頻率則沒有明顯差異。

GPRC6A為G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor, family C, group 6, type A, GPRC6A）位于6q22.31，在腦、骨骼肌、睪丸和白細胞高表達[13,14]。有研究[15]認為GPRC6A基因rs2274911多態(tài)性被證實與睪丸損傷有關(guān)，rs6901250組成的單體型頻率在前列腺癌患者明顯升高。SP011基因定位于20q13.2-13.3，系減數(shù)分裂相關(guān)基因，所編碼的蛋白質(zhì)在減數(shù)分裂染色體斷裂重組中發(fā)揮著重要的作用，已有研究表明SP011基因可能是一個不育易感基因[16]。馮戰(zhàn)啟等[17]研究發(fā)現(xiàn)SP011基因rs28368082位點是原發(fā)性不育患者的遺傳易感因素。RNF8 基因位于人類染色體 6p21.2上，是一種組蛋白泛素化的 E3 連接酶。在精子形成階段，包裹精子 DNA 的組蛋白由組蛋白類似的魚精蛋白代替，而這種轉(zhuǎn)變由 RNF8 依賴性組蛋白泛素化所引起的[18,19]。RNF8基因rs104669等位基因頻率在NOA患者組和對照組間顯示有顯著性差異，可以增加罹患 NOA 風險[20]。睪丸特異性含溴結(jié)構(gòu)域的蛋白（testis-specific bromodomain-containing protein,BRDT）是BET蛋白家族的成員，在精子發(fā)生過程的核染色質(zhì)重組中起關(guān)鍵作用[21]。對不育男性全基因組分析表明 BRDT 的單核苷酸多態(tài)性與歐洲男子的少精子癥和無精子癥相關(guān)[22]。卵丘細胞中的 STAG3是參與卵母細胞第一次減數(shù)分裂的一種調(diào)節(jié)蛋白，而Llano等[23]最新發(fā)現(xiàn)STAG3是人類男性不育一個強有力的候選基因。我們的結(jié)果顯示GPRC6A基因rs2274911, rs6901250；SPO11 基因rs28368082；RNF8基因rs104669；BRDT基因rs3088232和STAG3基因rs1637001位點基因型頻率和等位基因頻率在NOA組和對照組中差異均無統(tǒng)計學意義。

造成研究結(jié)果有差異的原因可能是基因多態(tài)性與精子發(fā)生障礙易感性在不同種族或地域人群中存在的機制目前尚不清楚，并且已有大量報道表明，種族因素、不同的地理及環(huán)境條件，可能會造成遺傳學基礎(chǔ)的差別，進而導(dǎo)致在精子發(fā)生障礙患者中存在不同的發(fā)病機制。因此，推測本研究結(jié)果與上述研究的結(jié)果不同可能是由于研究人群的遺傳學背景或者地理區(qū)域不同有關(guān)。另外，由于受樣本量限制，要使結(jié)果更具有說服力，需要擴大樣本量進一步驗證基因多態(tài)性與NOA的關(guān)系。

目前，研究基因多態(tài)性的方法逐漸增多,但許多方法由于其自身方法學特點存在著各自的優(yōu)缺點，比如PCR-限制性片段長度多態(tài)性、等位基因特異性PCR，這些方法由于均需先經(jīng)過PCR擴增，擴增產(chǎn)物再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后才能區(qū)分基因型，雖然過程操作不復(fù)雜，實驗成本也偏低，但其在靈敏度方面和操作時間上都處于劣勢，且實驗過程易受污染，結(jié)果出現(xiàn)假陽性或假陰性。相比之下，基因堿基序列測序則顯得較為精確和可靠，但它需DNA測序儀等昂貴儀器，并且對測序標本要求嚴格，而Taqman-MGB法則利用MGB探針標記不同基因型的探針，整個實驗過程在實時熒光定量 PCR儀中完成，無需電泳等后處理，在特異性和靈敏度上也優(yōu)于其他[24]。

本文首次應(yīng)用Taqman-MGB法檢測了SPO11 基因rs28368082，TEX15基因rs323346，rs6980502；STAG3基因rs1637001；GPRC6A基因rs2274911，rs6901250；RNF8基因rs104669；BRDT基因rs3088232位點，共8個多態(tài)性基因位點的分布頻率。結(jié)果顯示TEX15基因rs323346多態(tài)性位點與NOA發(fā)病風險存在關(guān)聯(lián)，可能是NOA的遺傳易感基因之一。