左亞軍 艾熱提·阿皮孜 邵為民 張金可 陳滌平

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科中心（烏魯木齊 830000）

近些年有關(guān)研究表明育齡中約有15%男女受到不孕不育的困擾，其中男女患病比例基本相等，大約各占一半[1]。雖然目前各種診斷手段不斷出現(xiàn)，但仍有約40%～50%的男性不育原因不明[2]。精液質(zhì)量決定著男性的生育能力，近年來基因與精液質(zhì)量的關(guān)系是臨床學(xué)者研究的熱點。現(xiàn)研究表明，亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）在機體內(nèi)不可逆的催化葉酸發(fā)生生化反應(yīng)，其可直接影響機體對葉酸的利用及代謝，葉酸的代謝對于細(xì)胞的正常功能是至關(guān)重要的，其參與了甲硫氨酸的生產(chǎn)過程及嘌呤和嘧啶的合成。因此合成該酶的相關(guān)基因的改變可能會影響精子的發(fā)生。同時也有一些研究提示MTHFR基因多態(tài)性可能有民族或地理上的差異，而這種多態(tài)性對男性生育能力的影響也可能受到某些其他因素的制約，比如環(huán)境因素、飲食習(xí)慣以及營養(yǎng)狀況等[3,4]。本次研究主要分析新疆地區(qū)MTHFR基因C677T多態(tài)性與嚴(yán)重少精子癥不育男性患者是否存在關(guān)聯(lián)，探討該基因多態(tài)性對嚴(yán)重少精子癥患者的影響。

資料與方法

一、研究對象

1. 病例組：選取2017年上半年就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖助孕與泌尿男科的中重度少精子癥患者154人，漢族，年齡22～45歲；對照組：以同一時間段就診于我院經(jīng)精液分析且精液質(zhì)量正常的294例男性。

2. 納入標(biāo)準(zhǔn)為：禁欲2～7d，手淫取精，精液常規(guī)分析確定為中重度少精子癥（5×106/mL＜精子密度＜10×106/mL為中度少精子癥；精子密度＜5×106/mL為重度少精子癥）。

3. 排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）染色異常（包括核型、Y染色體微缺失）；（2）存在精索靜脈曲張；（3）有隱睪的病史；（4）生殖系統(tǒng)嚴(yán)重感染或手術(shù)史；（5）病毒性腮腺炎的病史；（6）長期吸煙史；（7）明顯的環(huán)境污染物暴露（重金屬接觸、放射化學(xué)物質(zhì)等接觸）史。

二、基因分析方法

1. 標(biāo)本采集：對所有研究對象抽取靜脈血，裝于特定的抗凝管（含有乙二胺四乙酸二鈉（EwDTA-2NA）中， 并全血保存于特定溫度的冰箱里。

2. 血液基因組DNA提取：購買上海百敖科技股份有限公司生產(chǎn)的血液基因組DNA抽提試劑盒提取全血基因組DNA。

3. 純度和濃度檢測：使用瓊脂糖凝膠電泳的方法估計所提取DNA的濃度和純度。

4. 購買相關(guān)試劑盒：采用PCR（購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）一熒光探針法定性檢測MTHFR C677T多態(tài)性位點基因型。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 22.0軟件，將計算的兩組等位基因和基因型頻率進行比較并采用x2檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。檢驗水準(zhǔn)（α）為0.05，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

MTHFR C677T在病例組與對照組基因型及等位基因頻率比較[n(%)]，見表1。

表1 MTHFR C677T在病例組與對照組基因型及等位基因頻率比較[n(%)]

表1中顯示：病例組和對照組TT基因型構(gòu)成比及等位基因分布及頻率比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對照組中CC型基因頻率（32.3%）明顯高于病例組（21.4%），對照組TT型基因頻率（20.8%）明顯小于病例組（42.3%)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05；OR=2.926，95%CI=1.721～4.975）；兩組等位基因C、T進行比較[視CC型基因（野生型）為2個C等位基因，CT型基因（雜交型）為1個C等位基因和1個T等位基因，TT型基因（純合突變型）為2個T等位基因]，差異也均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05；OR=1.847，95%CI=1.396-2.443）。在基因型為CT的病例組與對照組比較（P＞0.05，OR=1.231，95%CI=0.747～2.029），差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。OR是暴露因素與疾病發(fā)生之間的聯(lián)系強度，其數(shù)值越大，提示該基因與嚴(yán)重少精子癥發(fā)生之間的相關(guān)性越強。本研究分析結(jié)果提示：MTHFR基因多態(tài)性的TT型基因及T等位基因可能是嚴(yán)重少精子癥的危險因素。

討 論

人類MTHFR基因首先由Montjean等[5]成功克隆，并且被定位于第1號染色體短臂（1p36.3)，cDNA長2.2 kb，該基因包含著約有21個基因編碼序列，包括外顯子11個和內(nèi)含子10個，全長為7105 bp的tuRNA，其氨基酸序列高度保守。在目前發(fā)現(xiàn)的MTHFR基因10余種基因突變的類型中，基因C677T的點突變最為常見，即突變基因外顯子中的第677個核苷酸由C突變?yōu)門，該基因編碼改變致使體內(nèi)該基因密碼子編輯的的丙氨酸變?yōu)槔i氨酸，該突變可產(chǎn)生3種基因類型：野生型（即CC基因型）、雜交型（即CT基因型）和純合突變型（即TT基因型），也有一些相關(guān)研究表明，該基因的突變致使MTHFR的活性存在不同程度的降低[6,7]，使葉酸在甲硫氨酸代謝循環(huán)中的作用喪失或降低。

MTHFR在體內(nèi)葉酸代謝中的生化作用主要是影響DNA合成與甲基化。在全球人類基因組677 T的甲基化低于677 C基因[8]，而DNA低甲基化從而引起相關(guān)基因的表達，而且會誘導(dǎo)尿嘧啶在DNA合成發(fā)生錯誤，最終導(dǎo)致DNA的修復(fù)出現(xiàn)錯誤、DNA鏈的斷裂及出現(xiàn)染色體異常。在葉酸利用的過程中也維持體內(nèi)同型半胱氨酸的動態(tài)平衡，從而避免同型半胱氨酸在體內(nèi)堆積，而引起高同型半胱氨酸血癥（hyperhornocysteinemia，Hhcy）[9]。Zetterberg等[10]研究同樣表明，MTHFRC677T的多態(tài)性的純合子（TT基因型）與雜合子（CT基因型）分別和野生型相比，更可能存在高同型半胱氨酸血癥。在細(xì)胞生理學(xué)上的MTHFR突變是自動氧化的，導(dǎo)致有毒活性氧代謝物的產(chǎn)生，人類精子極易受到氧化損傷及抗氧化劑的影響，葉酸的充分利用可克服氧化應(yīng)激對精子的損害，以保持DNA的完整性。因此，除了甲基化作用外，同型半胱氨酸介導(dǎo)的DNA氧化損傷可能是男性不育的另一種機制。同時有些研究表明，MTHFR基因多態(tài)性有可能通過基因多態(tài)性影響酶的活性[11]引起高同型半胱氨酸血癥而導(dǎo)致睪丸生精功能受損導(dǎo)致男性不育[12]。

目前有很多項目對MTHFR基因都有著很深刻的研究，在動物實驗中，Zhou等研究[13]顯示該基因在睪丸的表達明顯高于肝臟等其他器官，提示該基因的表達可能與精子的發(fā)生有密切的關(guān)系，同時也有一些對MTHFR基因敲除后的實驗[14]，基因敲除后的小鼠出現(xiàn)了精子生成嚴(yán)重受到影響，并喪失了生育的能力，證實了MTHFR基因參與了雄性生殖過程，并在其中起到重要作用。有些關(guān)于MTHFR基因的多態(tài)性的研究表明，該基因的多態(tài)性可能通過影響精原細(xì)胞DNA復(fù)制過程的甲基化而影響精子的發(fā)生。如Song等[15]通過外界給予生物制劑脫氧胞苷類似物抑制小鼠的DNA甲基化，發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸產(chǎn)生的精子活力及受孕能力有著顯著的下降。Chan 等[16]運用小鼠建立的動物模型發(fā)現(xiàn)，MTHFR敲除的白色變種實驗室雄性小鼠出現(xiàn)了睪丸功能障礙的癥狀及無法生育，檢測發(fā)現(xiàn)其精子中印跡基因的甲基化出現(xiàn)了嚴(yán)重的混亂。這也更加驗證了精子的發(fā)生與MTHFR基因相關(guān)。

同時，一些研究還發(fā)現(xiàn)MTHFR基因的多態(tài)性中各基因型的分布頻率在不同國家也有所不同[17,18]。在對于MTHFRC677T多態(tài)性與男性不育相關(guān)性的研究中，亞洲人群與歐洲人群的報道結(jié)果不盡相同，亞洲部分國家[19]和我國部分地區(qū)[20]相關(guān)研究中提示存在相關(guān)性，而歐洲部分國家的相關(guān)性研究[21]顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義，無相關(guān)性，其中原因還需要進一步的探討。

本研究結(jié)果提示：男性嚴(yán)重少精子癥患者與對照組TT基因型和等位基因分布及頻率比較，差異具統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。MTHFR的TT基因型及T等位基因可能是嚴(yán)重少精子癥的危險因素。這與國內(nèi)的一些研究[22,23]結(jié)果一致。本研究對于MTHFR基因的多態(tài)性與男性不育的相關(guān)性做了初步的研究，其作用的機制還需要更進一步的探討，此次研究為疾病診斷提供了初步思路和線索，對疾病治療方案的制定有一定的幫助。但本次的研究所收集的病例較少，且未進行分層分析，故具有一定局限性，此后還需進一步深入探討。