葛東升 朱麗莉 王鶯語(yǔ) 羅 嘉 吳國(guó)勝** 馮寧翰, **

1. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫第二醫(yī)院泌尿外科（江蘇 214002）2. 江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院

內(nèi)分泌的去勢(shì)治療（androgen deprivation therapy，ADT）是目前前列腺癌主要的治療方法，大多數(shù)患者早期對(duì)其比較敏感，但經(jīng)過(guò)1～2年治療后，最終會(huì)進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌（castrationresistant prostate cancer，CRPC），這類(lèi)前列腺癌預(yù)后較差，是臨床治療的難點(diǎn)[1]。

多西他賽（docetaxel, DTX）是半合成紫杉醇的衍生物, 也是一種典型的細(xì)胞毒性藥物，具有廣譜高效的抗腫瘤活性。它可通過(guò)加強(qiáng)微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，使細(xì)胞形成穩(wěn)定的非功能性微管束，因而破壞腫瘤細(xì)胞的有絲分裂,并阻滯細(xì)胞于G2/M期，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)，DTX可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中抑制凋亡的B細(xì)胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）磷酸化、提高游離BAX（Bcl-2 Associated X Protein, BAX）蛋白水平并最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡。DTX在1998年獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，是被FDA批準(zhǔn)用于治療CRPC的首個(gè)藥物，以其為主的抗腫瘤藥物聯(lián)合治療是目前CRPC治療標(biāo)準(zhǔn)方案。

桔梗皂苷D（Platycodin D, PD）是從桔梗中提取的活性成分，它具有免疫刺激、抗炎、止痛、抗肥胖和抗動(dòng)脈粥樣硬化等功能[2-4]。還可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，如白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌以及前列腺癌[5]。

基于上述研究基礎(chǔ)，我們提出PD與DTX聯(lián)合應(yīng)用治療非雄依賴(lài)的前列腺癌的設(shè)想。本研究選取非雄激素依賴(lài)的細(xì)胞株P(guān)C3細(xì)胞，通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)觀(guān)察PD及DTX單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)PC3細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并進(jìn)一步探討其內(nèi)在分子機(jī)制，以明確PD聯(lián)合DTX對(duì)非雄激素依賴(lài)前列腺癌的潛在治療效果。

材料和方法

一、材料

PD為澳門(mén)大學(xué)中華醫(yī)藥研究院陸金鍵博士饋贈(zèng)，將PD粉末完全溶于二甲基亞砜，配制為20 mmoL溶液。DTX購(gòu)于江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，將DTX用二甲基亞砜稀釋1000倍，得到濃度為49.5 nmoL溶液。多聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase,PARP）、凋亡相關(guān)蛋白（Cleaved PARP）、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR，ser2448）、磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體（p-EGFR，tyr1068）、Bcl-2、BAX、酵母Agt-6同系物（Beclin-1）、自噬相關(guān)蛋白-5（Autophagy-related protein-5，Agt-5）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅰ/Ⅱ（microtubuleassociatedprotein1 light chain 3-Ⅰ/Ⅱ, LC3-Ⅰ/Ⅱ）以及β微管蛋白（β-tubulin）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。蛋白定量試劑盒（BCA試劑盒）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scienti fi c公司。噻唑藍(lán)（MTT），4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（FITC-Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit）購(gòu)于美國(guó)BD pharmingen公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

PC3購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection，ATCC），用RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素）培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2～4天傳代一次。

三、MTT法細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，均勻種入96孔板，每個(gè)孔約為10 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h完全貼壁后，按照每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行孔，將孔板分為4組，第四組作為對(duì)照組，先向第一、三組加入PD濃度為2.5 μmoL、5 μmoL、10 μmoL、20 μmoL、40 μmoL和80 μmoL的預(yù)配好的培養(yǎng)基，培養(yǎng)6h后， 棄去細(xì)胞上層藥液，向第一組加入完全培養(yǎng)基，第二和第三組分別加入DTX濃度為2.5 nmoL、5 nmoL、10 nmoL、20 nmoL、40 nmoL和80 nmoL的預(yù)配好的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，棄去培養(yǎng)基，加入用培養(yǎng)基稀釋至1mg/mL的MTT溶液，放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h，小心吸棄上清，向每個(gè)孔加入二甲基亞砜150 μL溶解甲臜晶體，采用BioTek Synergy H4 全功能微孔板檢測(cè)儀在波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)各孔吸光度（OD）值，并計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。

四、Western blot

將PD和DTX處理好的細(xì)胞用PBS洗兩次，加入適量細(xì)胞裂解液，刮下細(xì)胞，移入1.5 mL EP管中，超聲破碎，然后冰上孵育20min，之后于4℃，4 000×g離心20 min，取上清，得到細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)蛋白濃度，蛋白樣品上樣量為每孔30 μg。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移印跡到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1h，TBST洗3次，每次10min，放入相應(yīng)抗體中（體積稀釋比例都是1：1000），4℃搖床上孵育過(guò)夜，TBST洗膜后，于辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1：2000）室溫孵育1h，TBST洗3次，每次10min。然后用ECL試劑盒曝光顯色。

五、DAPI 染色

將經(jīng)過(guò)PD和DTX處理好的細(xì)胞吸棄培養(yǎng)基，PBS洗兩次，每個(gè)孔加入800 μL多聚甲醛固定，10min后吸棄上清，用PBS洗兩次，避光，加入配置好的DAPI溶液，并將孔板用錫紙嚴(yán)密包好，置于水平搖床孵育10min，用ZEISS全自動(dòng)正置熒光顯微鏡進(jìn)行熒光拍照。

六、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

將六孔板中用PD和DTX處理好的細(xì)胞全部分別收集至15mL離心管（包括上清中的細(xì)胞和PBS洗下的細(xì)胞），200×g，4℃離心5min，用預(yù)冷的PBS洗兩次，于100 μL 的1×Binging Buffer中重懸，每個(gè)樣品中加入5 μL 依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白（FITCAnnexinV）和5 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI）避光染色30min，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡情況。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和檢驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，多個(gè)組別間比較運(yùn)用單因素方差分析（One-way ANOVN）。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PD和DTX協(xié)同抑制PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)

PD和DTX均能抑制PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)，且PD呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴(lài)性（圖1）。在PD和DTX聯(lián)合作用之后可以顯著抑制PC3細(xì)胞生長(zhǎng)。圖1A為聯(lián)合用藥的加藥方案，即在PD作用6h之后撤藥，然后加入DTX繼續(xù)作用24h，單獨(dú)用藥為PD組只加PD處理6h，DTX組只用DTX處理24h。圖1B為不同濃度的PD和DTX作用于PC3，對(duì)其增殖的影響，表1顯示在PD和DTX濃度分別在2.5 μmoL和2.5 nmoL，5 μnmoL和5 nmoL，10 μmoL和10 nmoL，20 μmoL和20 nmoL時(shí)聯(lián)合用藥對(duì)PC3細(xì)胞增殖具有協(xié)同抑制作用，且在20 μmoL PD和20 nmoL DTX聯(lián)合使用時(shí)，協(xié)同作用最為顯著，與PD組相比差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），與DTX組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 比較PD、DTX單獨(dú)和聯(lián)合用藥對(duì)PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

表1 PD和DTX對(duì)PC3的抑制率以及協(xié)同系數(shù)

二、 PD和DTX聯(lián)合用藥促進(jìn)PC3細(xì)胞凋亡

PC3細(xì)胞種于六孔板中，分別以20μmoL PD處理6h，20nmoL DTX處理24h以及20μmoL PD處理6h后撤藥再用20nmoL DTX處理24h，觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，進(jìn)行DAPI染色，凋亡率檢測(cè)，以及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

觀(guān)察PD，DTX和PD聯(lián)合DTX，對(duì)PC3細(xì)胞形態(tài)的影響，由圖2A可見(jiàn)，PD和DTX均可導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生一定程度的變化，在PD聯(lián)合DTX用藥中發(fā)現(xiàn)細(xì)

胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，絕大多數(shù)細(xì)胞由梭形變?yōu)閳A形，并且內(nèi)部產(chǎn)生空泡狀結(jié)構(gòu)，貼壁細(xì)胞數(shù)量也有所降低。在圖2B中能觀(guān)察到PD、DTX和PD聯(lián)合DTX作用于PC3細(xì)胞的DAPI染色結(jié)果，DAPI作為一種DNA染料，可以檢測(cè)細(xì)胞凋亡，對(duì)照組和PD組染色核形完整，染色質(zhì)均勻，說(shuō)明未發(fā)生凋亡；DTX組中發(fā)現(xiàn)少量的細(xì)胞核固縮，說(shuō)明有部分細(xì)胞發(fā)生了早期凋亡；而在PD和DTX聯(lián)合用藥組發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核進(jìn)一步固縮，形成顆粒物，甚至細(xì)胞核破裂形成碎片，說(shuō)明多量的細(xì)胞發(fā)生凋亡。 為進(jìn)一步明確PC3細(xì)胞的凋亡率，運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)PD，DTX和PD聯(lián)合DTX作用過(guò)的PC3細(xì)胞進(jìn)行AnnexinV和PI雙染，然后運(yùn)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，如圖2C所示，PD和DTX聯(lián)合用藥組凋亡率均高于PD和DTX單獨(dú)用藥組。并且在Western blot的結(jié)果顯示（圖2D），在PD和DTX聯(lián)合用藥組中Cleaved PARP表達(dá)量顯著增高，說(shuō)明PD聯(lián)合DTX作用于PC3細(xì)胞可以顯著增加PC3細(xì)胞凋亡。

三、PD聯(lián)合DTX協(xié)同誘導(dǎo)PC3細(xì)胞凋亡的機(jī)制

PD可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬[5]，在圖2A中，PD組細(xì)胞產(chǎn)生多量空泡狀結(jié)構(gòu)，推測(cè)PD和DTX聯(lián)合使用的協(xié)同效應(yīng)可能與PD誘導(dǎo)PC3細(xì)胞發(fā)生自噬有關(guān)，在圖3A中，PD組以及PD和DTX聯(lián)合用藥組LC3-II表達(dá)量較其他組增多，表明在PD處理6h后PC3細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生自噬。在圖3B中，DTX組和PD聯(lián)合DTX組均可導(dǎo)致p-mTOR（ser2448）和p-EGFR（tyr1068）表達(dá)量明顯減低，這可能與細(xì)胞發(fā)生凋亡的具體機(jī)制相關(guān)。

圖3 PD和DTX對(duì)PC3細(xì)胞凋亡機(jī)制的探究

討 論

前列腺癌是男性前列腺泡或?qū)Ч苌掀?lái)源的惡性腫瘤，其發(fā)病率具有明顯的地理和種族差異。在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)，它是男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其死亡率居各種癌癥的第二位；在亞洲尤其是我國(guó)，前列腺癌發(fā)病率雖低于西方國(guó)家，但近年來(lái)呈顯著增長(zhǎng)且年輕化趨勢(shì)[6,7]。目前認(rèn)為，前列腺癌發(fā)病率的持續(xù)增高和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移依賴(lài)于雄激素受體傳導(dǎo)信號(hào)，因此ADT療法是除外科手術(shù)與放射治療外的標(biāo)準(zhǔn)前列腺癌治療方法，可以暫時(shí)抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，延緩疾病的惡化進(jìn)展。盡管80%～90%的早期前列腺癌患者都會(huì)對(duì)ADT治療有效果，但幾乎所有患者都會(huì)在1～2年內(nèi)復(fù)發(fā)并由雄激素依賴(lài)性前列腺癌發(fā)展成高度惡化且廣泛轉(zhuǎn)移的雄激素非依賴(lài)性前列腺癌，使常規(guī)的ADT療法失去效果，成為臨床治療的難點(diǎn)。目前臨床用于治療前列腺癌的藥物雖已顯示出強(qiáng)大的功效，但也存在一些弊端，單獨(dú)用藥劑量大、副作用大（如耐藥性、不良反應(yīng)等），而且抗癌治療藥物一般價(jià)格昂貴，大大增加了患者的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。因此，發(fā)現(xiàn)新的高效藥物成為現(xiàn)階段臨床治療亟待解決的問(wèn)題。有鑒于此，本研究試圖從藥物協(xié)同作用入手，將傳統(tǒng)中藥有效成分與臨床一線(xiàn)化療藥物結(jié)合，優(yōu)化治療方案，降低治療成本，提高治療效果，探索前列腺癌疾病新的藥物治療策略。

紫杉烷是一種典型的細(xì)胞毒藥物，具有高效廣譜的抗腫瘤活性，可與微管蛋白的亞基結(jié)合抑制微管動(dòng)力學(xué)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生G2/M期周期阻滯[8]，亦可通過(guò)激活多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[9-12]。DTX是第2代紫杉烷衍生物，由歐洲紅豆杉提取的非細(xì)胞毒性前體化合物10-脫乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-DAB Ⅲ）經(jīng)半合成而成，1998年獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市[13]。與紫杉醇相比，DTX有更強(qiáng)的微管蛋白親和力和更長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)停留時(shí)間，對(duì)腫瘤細(xì)胞的破壞力更強(qiáng)。它有一定的靶向性和具有減少藥物劑量、降低毒副作用，尤其是減少過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生的特點(diǎn)。然而因患者自身耐受差、藥物選擇性弱等原因亦導(dǎo)致化療失敗或復(fù)發(fā)，使其療效欠佳。因此，為降低DTX的毒副作用，增強(qiáng)其療效，尋找有效的輔助治療藥物成為亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

桔梗，俗稱(chēng)氣球花，是一種傳統(tǒng)中草藥，味苦、辛，平。歸肺經(jīng)。其主要功能為宣肺，利咽，祛痰和排膿。在中國(guó)、日本及韓國(guó)桔梗被廣泛用作飲食來(lái)源以及治療呼吸系統(tǒng)疾病的藥物。PD是從桔梗中提取的活性成分，它具有免疫刺激、抗炎、止痛、抗肥胖和抗動(dòng)脈粥樣硬化等功能[2-4,14-16]。Chun等通過(guò)對(duì)人胃癌細(xì)胞（AGS）的研究表明，PD可顯著性地抑制其增殖并介導(dǎo)失巢凋亡，這種細(xì)胞凋亡與外源性的Fas受體通路及內(nèi)源性的線(xiàn)粒體Bcl-2家族通路有關(guān)[17]；同時(shí)，PD介導(dǎo)的p38等應(yīng)激活化蛋白激酶的磷酸化可能是其引起AGS凋亡的一個(gè)原因。Kim等通過(guò)研究人白血病細(xì)胞（U937,THP-1及K562），發(fā)現(xiàn)PD可在體外抑制白血病細(xì)胞的增殖，并介導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制是為降低c-Myc和Spl蛋白的表達(dá)水平，并下調(diào)其與DNA的結(jié)合能力，通過(guò)Ark途徑抑制hTERT的磷酸化和核轉(zhuǎn)位，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用[18]；此外，Shin等報(bào)道，PD通過(guò)抑制Egr-1的活化、ROS的產(chǎn)生、MMP的分解，及活化Caspase-3，在誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞（U937）凋亡的過(guò)程中發(fā)揮作用[19]。近年來(lái)，有許多研究表明PD在誘導(dǎo)細(xì)胞自噬中也發(fā)揮重要作用，如PD能夠誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞BEL-7402形成脂質(zhì)空泡，提高細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ水平，使細(xì)胞自噬[20]；在非小細(xì)胞肺癌中，PD可通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)途徑并激活JNK和p38-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)自噬[21]。本研究中，在PD處理細(xì)胞6h后可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的自噬（圖2A和圖3A），符合上述文獻(xiàn)的報(bào)道。在后續(xù)DTX處理24h后，明顯促進(jìn)了DTX介導(dǎo)的凋亡?；诖私Y(jié)果，我們推斷PD介導(dǎo)的PC3自噬使細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞通過(guò)自噬的作用一方面提供細(xì)胞生長(zhǎng)的能量物質(zhì)，另一方面保證細(xì)胞的存活。在此基礎(chǔ)上，加入細(xì)胞毒藥物DTX打破了細(xì)胞內(nèi)部的能量平衡，使細(xì)胞更傾向于發(fā)生凋亡。在具體分子機(jī)制研究方面，我們檢測(cè)了與細(xì)胞能量代謝相關(guān)的EGFR和mTOR的激活情況，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥后，進(jìn)一步抑制了相關(guān)信號(hào)通路，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。

總之，通過(guò)本研究，我們揭示PD與DTX協(xié)同作用這一用藥方案對(duì)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡的優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步挖掘了傳統(tǒng)中藥中的單體化合物通過(guò)協(xié)同用藥在前列腺癌治療中的潛力，為有效醫(yī)治前列腺癌提供新的藥理學(xué)參考。