陳秀會(huì)，宜 全，肖 青

（廣州醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，廣東廣州 511436）

心肌梗死是由于心臟冠狀動(dòng)脈等主要血管堵 塞或狹窄導(dǎo)致的心肌組織缺血低氧、營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足、代謝產(chǎn)物清除減少，從而造成心肌細(xì)胞凋亡、心肌組織壞死的心血管疾?。?］。自噬是調(diào)節(jié)真核細(xì)胞生長、死亡的重要生物學(xué)機(jī)制，細(xì)胞自噬行使其生物學(xué)功能的前提是自噬流的活化，并且保持自噬流的平衡是維持心肌穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵之一［2］。研究表明，長時(shí)間的心肌缺血低氧會(huì)導(dǎo)致自噬流障礙，并且增強(qiáng)缺血低氧心肌自噬能力能顯著增強(qiáng)心肌細(xì)胞對抗缺血低氧損傷［3］。類泛素樣修飾中蛋白（small ubiquitin-like modifier，SUMO）結(jié)合到目的蛋白的過程稱為SUMO化修飾，SUMO-1是SUMO家族的主要成員之一，SUMO化修飾的泛素綴合酶類 E2I（ubiquitin-conjugating enzyme E21，Ubc9）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的SUMO化修飾靶蛋白過程中唯一的E2結(jié)合酶，在SUMO化修飾過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，增強(qiáng)SUMO化修飾能保護(hù)低溫誘導(dǎo)的缺血神經(jīng)元免受凋亡［4］和抵抗腦缺血損傷的作用［5］。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Ubc9能通過增強(qiáng)自噬從而清除錯(cuò)誤折疊蛋白，提高心臟功能［6］。然而在急性心梗中，Ubc9的作用未知，且Ubc9是否參與急性心梗心肌細(xì)胞的自噬過程，及是否會(huì)調(diào)節(jié)缺血低氧心肌細(xì)胞自噬蛋白的SUMO化修飾水平，進(jìn)而保護(hù)缺血缺氧心肌細(xì)胞并不清楚。本研究擬采用乳大鼠心肌細(xì)胞（neonatal cardiomyocytes，NRCM）行氧葡萄糖剝奪（oxygen and glucose deprivation，OGD）處理，模擬體內(nèi)心肌缺血低氧模型，探討Ubc9在急性心肌細(xì)胞低氧損傷下的作用及其機(jī)制，為治療急性心梗新藥的開發(fā)與利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

純化的大鼠Ubc9基因腺病毒（adenovirus harboring Ubc9，Adv-Ubc9）（序列號：NM_013050.1）委托中國山東維真生物科技有限公司合成并完成滴度測定，Ubc9小干擾RNA（Ubc9-small interfering RNA，Ubc9-siRNA）委托美國賽默飛世爾科技公司合成，達(dá)爾伯克改良伊格爾高糖培養(yǎng)基（4.5 g·L-1D-glucose Dulbecco′s modified Eagle medium，4.5 g·L-1D-glucose DMEM）、無糖DMEM培養(yǎng)基（noD-glucose DMEM）、Hanks平衡鹽溶液（Hanks balanced salt solution，HBSS）、胎牛血清和Ⅱ型膠原酶購于美國Gibco公司；L-15培養(yǎng)液購于中國吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；0.25%胰蛋白酶和青鏈霉素混合液購自中國索萊寶公司；5-溴-2’-脫氧尿苷（5-bromo-2′-deoxyuridine，Brdu）購于美國Sigma公司；Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑和OPTIMEM?1優(yōu)化培養(yǎng)基購于美國賽默飛世爾科技公司；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（terminal deoxynucleo?tidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）試劑盒（12156792910）購于瑞士豪夫邁·羅氏公司；RIPA裂解液（9806S）購于美國Cell Signaling Technology公司；蛋白酶抑制劑和巴伐洛霉素A1（bafilomycin A1，BFA1）購于中國上海藍(lán)木化工有限公司；兔抗大鼠β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（AP0060）購自美國Bioworld公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）抗體（ZB-2301）和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）抗體（ZB-2305）購于中國中杉金橋公司；兔抗Ubc9、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubules-associated protein 1 light chain 3，LC3）、活化的胱天蛋白酶3單克隆抗體購于美國Cell Signalling Technology公司；兔抗P62/SQSTM1（P62）、SUMO-1多克隆抗體購于美國Cell Signalling Technology公司；兔抗Beclin1多克隆抗體和小鼠抗Vps34單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司；蛋白定量試劑盒（23225）和增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液購自美國賽默飛世爾科技公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液購自中國碧云天生物技術(shù)公司；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或者國產(chǎn)分析純。蛋白垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀和低溫離心機(jī)購自美國Beckman公司；5%CO2培養(yǎng)箱和三氣低氧（N2∶CO2∶O2=94%∶5%∶1%）培養(yǎng)箱購于美國NAPCO4520公司；超凈工作臺購于中國蘇州儀器廠；激光共聚焦和熒光顯微鏡購于日本Nikon公司。

1.2 動(dòng)物和乳大鼠心肌細(xì)胞的分離、純化與培養(yǎng)

SPF級1～3日齡新生SD大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量5～7 g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號：44002100015946，許可證號：SCXK（粵）2016-0041）。取新生1～3 d SD乳大鼠，用眼科剪剪開胸腔，用眼科鑷分開胸腔，取下心臟并放入4℃預(yù)冷的HBSS液中洗棄血液3次。移入玻璃培養(yǎng)皿中，去除心耳和非心肌組織，轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿中，將心肌組織剪成糊狀，加入0.25%胰酶和HBSS，使得胰酶終濃度為0.05%，于4℃冰箱消化過夜。翌日，將所有組織及液體轉(zhuǎn)移至無菌50 mL離心管中，加胎牛血清終止消化，使血清終濃度為20%，放入37℃水浴鍋中10 min終止消化，隨后加入Ⅱ型膠原酶并放入37℃水浴鍋中消化組織45 min后，加入適量L-15培養(yǎng)基，輕輕吹打數(shù)下進(jìn)行細(xì)胞分離，將細(xì)胞懸液收集到另一無菌50 mL離心管中，重復(fù)4次。所有的細(xì)胞懸液經(jīng)200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，然后進(jìn)行20 min自由沉降，隨后以201×g離心8 min，棄上清，用含15%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行差速貼壁純化1 h，使成纖維細(xì)胞貼于皿底，然后將純化后未貼壁的心肌細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，用含15%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞接種24 h后更換成含10%胎牛血清和1%Brdu的高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞OGD模型制備和分組

待細(xì)胞接種培養(yǎng)后30 h至細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)，開始進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染或OGD處理，OGD處理步驟為棄原有培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞3遍，加入適量無糖培養(yǎng)基，置于37℃三氣低氧培養(yǎng)箱內(nèi)低氧培養(yǎng)。①細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值為復(fù)感染指數(shù)（multiplicity of infection，moi），細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染含綠色熒光蛋白（green fluoresent protein，GFP）腺病毒（adenovirus harboring GFP，Adv-GFP）25 moi組（作為對照）和Adv-Ubc9 5，10，20，50和100 moi組，篩選出使得Ubc9過表達(dá)的最適moi，檢測乳鼠心肌細(xì)胞中Adv-Ubc9轉(zhuǎn)染效率，熒光顯微鏡觀察各組GFP熒光強(qiáng)度；Western印跡法檢測Ubc9的表達(dá)；②細(xì)胞分為正常對照組和OGD處理不同時(shí)間（0，2，4，6，12和24 h）組，Western印跡法檢測Ubc9、活化的胱天蛋白酶3、LC3和P62的表達(dá)；③細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染Adv-GFP組、Adv-GFP+OGD組、Adv-Ubc9+OGD組，在含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染Adv-GFP 25 moi和Adv-Ubc9 50 moi，轉(zhuǎn)染48 h后再進(jìn)行OGD處理6 h，Western印跡法檢測活化的胱天蛋白酶3、LC3、P62和SUMO-1的表達(dá)，通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測Vps34和Beclin1的SUMO化修飾，TUNEL技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；④細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA（negative controlsiRNA，NC-siRNA）+OGD組和轉(zhuǎn)染Ubc9-siRNA+OGD組，用Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑和OPTI-MEM?1優(yōu)化培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后再進(jìn)行OGD處理6 h；Western印跡法檢測Ubc9、活化的胱天蛋白酶3的表達(dá)；⑤細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染Adv-GFP+OGD組、Adv-GFP+OGD+BFA1 50 nmol·L-1組、Adv-Ubc9+OGD+BFA1 50 nmol·L-1組，在含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染Adv-GFP 25 moi和Adv-Ubc9 50 moi，轉(zhuǎn)染46 h后再給予BFA1 50 nmol·L-1處理2 h，然后再進(jìn)行OGD處理6 h，GOD處理時(shí)繼續(xù)給予BFA1 50 nmol·L-1處理至OGD完成；Western印跡法檢測LC3表達(dá)。

1.4 熒光顯微鏡觀察GFP熒光強(qiáng)度檢測轉(zhuǎn)染效率

按照重組腺病毒操作說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按1.3中①分組處理細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后于熒光顯微鏡10倍鏡下觀察拍照，拍照時(shí)各項(xiàng)參數(shù)均保持一致，以細(xì)胞中GFP熒光強(qiáng)弱表示轉(zhuǎn)染效率。

1.5 Western印跡法檢測Ubc9、SUMO-1、活化的胱天蛋白酶3、LC3和P62的表達(dá)

細(xì)胞處理完成后，加入含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白，離心后取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量，隨后在100℃沸水中煮蛋白10 min，讓蛋白樣品充分變性，取30 μg總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白（先80 V電泳40 min，再120 V電泳至完成），恒流280 mA轉(zhuǎn)印100 min至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫?fù)u床慢搖振蕩封閉PVDF膜1 h，隨后PVDF膜用3%BSA/PBS稀釋的一抗（1∶1000稀釋）4℃孵育過夜，次日PBS-T洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）抗體或山羊抗小鼠IgG二抗（1∶5000稀釋），室溫孵育1 h，PBS-T洗膜3次，加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液，暗室內(nèi)X片曝光，洗膠片，掃描分析條帶，用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)各條帶吸光度值，各目的蛋白表達(dá)水平用各目的蛋白條帶與β肌動(dòng)蛋白酶條帶積分吸光度值比值表示。

1.6 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞接種于含細(xì)胞爬片的小皿中，按1.3中③分組處理細(xì)胞，處理完畢后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，用PBS復(fù)水5 min后用0.1%聚乙二醇辛基苯基醚通透細(xì)胞20 min，用甘氨酸100 mmol·L-1處理20 min，隨后按照TUNEL試劑盒操作說明書進(jìn)行操作，最后用DAPI染色液染細(xì)胞10 min，用超純水洗5次后進(jìn)行封片，操作中注意避光；在共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察及拍照，細(xì)胞核為藍(lán)色，凋亡細(xì)胞為紅色，Merge表示DAPI與TUNEL的擬合。計(jì)數(shù)視野內(nèi)凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.7 蛋白質(zhì)免疫共沉淀法檢測Vps34和Beclin1的SUMO化修飾

將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，按1.3中③分組處理細(xì)胞，細(xì)胞處理完成后，每個(gè)培養(yǎng)皿加入500 μL配制好的裂解液（mmol·L-1：pH7.6的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 50，氯化鈉150，乙二胺四乙酸3.1，0.1%聚乙二醇辛基苯基醚，苯甲基磺酰氟2，N-乙基馬來酰亞胺6.20；1×蛋白酶抑制劑）裂解細(xì)胞，提取蛋白，4℃下15 294×g，離心15 min后取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量，每組取30 μg總蛋白用于Western印跡檢測，總蛋白的印跡結(jié)果記作Input；再每組取500 μg蛋白與相應(yīng)抗體（10 μL）混勻，正常對照組加入相同濃度的IgG，4℃搖床上搖晃過夜，該過程記作免疫沉淀反應(yīng)（immunoprecipitation，IP），第2天每組加入25 μL用預(yù)先結(jié)合固化在瓊脂糖珠上的蛋白A/G，繼續(xù)4℃搖床上搖晃4 h，使得抗原抗體復(fù)合物與蛋白A/G偶聯(lián)，完成后加入4℃預(yù)冷PBS，沖洗管壁上偶聯(lián)有抗原抗體復(fù)合物的蛋白A/G，接著4℃下837×g離心15 min，棄上清，繼續(xù)用4℃預(yù)冷PBS洗瓊脂糖珠3次，4℃下837×g離心5 min，隨后用30 μL 1×上樣緩沖液重懸瓊脂糖珠，100℃煮15 min，瞬時(shí)離心后取上清用于Western印跡檢測，該過程記作免疫印跡反應(yīng)（immunoblot?ting，IB）。用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)各條帶吸光度值，Input中各目的總蛋白表達(dá)水平用各目的蛋白條帶與β肌動(dòng)蛋白條帶積分吸光度比值表示，IB中SUMO化修飾蛋白水平用SUMO化修飾的目的蛋白條帶與Input中相對應(yīng)的總蛋白條帶積分吸光度比值表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Adv-Ubc9的轉(zhuǎn)染效率

如圖1所示，隨著轉(zhuǎn)染Adv-Ubc9 moi增加，GFP熒光強(qiáng)度逐漸增加，當(dāng)moi達(dá)到50和100時(shí)，其熒光強(qiáng)度接近（圖1A）。Western印跡結(jié)果與熒光結(jié)果相符（圖1B），后續(xù)實(shí)驗(yàn)Adv-Ubc9轉(zhuǎn)染50 moi，陰性對照Adv-GFP轉(zhuǎn)染25 moi。

Fig.1 Transfection efficiency of adenovirus harboring ubiquitin-conjugating enzyme E21（Adv-Ubc9）in neonatal rat cardiomyocytes（NRCMs）by confocal microscopy（A）and Western blotting（B）.NRCMs were transfected with 25 multi?plicity of infection（moi）adenovirus harboring green fluorescent protein（Adv-GFP）or Adv-Ubc9（5，10，20，50 and 100 moi）for 48 h，respectively.B2 was the semi-quantitative result of B1.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with Adv-GFP 25 moi group.

2.2 OGD處理對乳大鼠心肌細(xì)胞Ubc9、活化的胱天蛋白酶3、LC3和P62蛋白表達(dá)水平的影響

如圖2所示，與OGD 0 h相比，隨著OGD時(shí)間的延長，Ubc9表達(dá)基本無變化，活化的胱天蛋白酶3表達(dá)，從OGD 4 h開始顯著升高（P＜0.01）；并且OGD會(huì)導(dǎo)致LC3Ⅱ表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），而自噬底物P62在ODG 6和12 h堆積最明顯（P＜0.01），提示自噬流發(fā)生障礙。

Fig.2 Effect of oxygen and glucose deprivation（OGD）on Ubc9，cleaved-caspase 3，microtubules-associated protein 1 light chaint 3（LC3）and P62/SQSTM1（P62）expression in NRCMs by Western blotting.NRCMs were incubated with DMEM of glucose and sodium pyruvate free in hypoxia incubator（N2∶CO2∶O2=94%∶5%∶1%）for 0，2，4，6，12 and 24 h，respectively.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3-7.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with OGD 0 h group.

2.3 過表達(dá)或沉默Ubc9對OGD處理的乳大鼠心肌細(xì)胞活化的胱天蛋白酶3和凋亡的影響

Western印跡結(jié)果顯示，與Adv-GFP+OGD組相比，Adv-Ubc9+OGD組的活化的胱天蛋白酶3表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01）（圖3A），而用Ubc9-siRNA沉默Ubc9后，與NC-siRNA+OGD組相比，活化的胱天蛋白酶3表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）（圖4A，B）。TUNEL檢測結(jié)果表明，與Adv-GFP+OGD組相比，過表達(dá)Ubc9能明顯減少OGD后凋亡心肌細(xì)胞的數(shù)量（P＜0.01）（圖3B）。提示過表達(dá)Ubc9能明顯抑制OGD導(dǎo)致的乳大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

Fig.4 Effect of Ubc9 silenced on cleaved-caspase 3 expression in NRCMs under OGD by Western blot?ting.NRCMs were transfected with negative control-siRNA（NC-siRNA）or Ubc9-siRNA for 48 h and then stimulated by OGD for 6 h.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=5-6.＊＊P＜0.01，compared with NC-siRNA+OGD group.

2.4 過表達(dá)Ubc9對OGD處理的乳大鼠心肌細(xì)胞自噬的影響

如圖5所示，與Adv-GFP+OGD組相比，過表達(dá)Ubc9后能明顯逆轉(zhuǎn)OGD處理后的自噬底物P62堆積（P＜0.01），而對自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ無影響（圖5A，B）。給予BFA1阻斷自噬降解（抑制自噬體與溶酶體融合）后，Adv-GFP+OGD+BFA1 50 nmol·L-1組的 LC3Ⅱ蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01），過表達(dá)Ubc9后LC3Ⅱ蛋白表達(dá)進(jìn)一步明顯上調(diào)（P＜0.01）（圖6A，B）。提示抑制自噬流降解過程后，過表達(dá)Ubc9顯著增加LC3Ⅱ的表達(dá)，表現(xiàn)出自噬流活化。由此可見，Ubc9對自噬的作用可能與同時(shí)促進(jìn)自噬激活和自噬降解過程有關(guān)。

Fig.3 Effect of Ubc9 overexpression on cleaved-caspase 3 expression and apoptosis in NRCMs under OGD by Western blotting（A）and TUNEL（B）.NRCMs were transfected with Adv-Ubc9 50 moi or Adv-GFP 25 moi for 48 h and then stimu?lated by OGD for 6 h.A2 was the semi-quantitative result of A1.B2 was the quantitative analysis result of the TUNEL positive cells.±s，n=4-6.＊＊P＜0.01，compared with Adv-GFP group；##P＜0.01，compared with Adv-GFP+OGD group.

2.5 過表達(dá)Ubc9對OGD處理的乳大鼠心肌細(xì)胞自噬蛋白的SUMO化修飾的影響

如圖7所示，與Adv-GFP組相比，OGD處理后SUMO-1表達(dá)基本無變化，但過表達(dá)Ubc9后，SUMO-1表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）。蛋白免疫共沉淀結(jié)果顯示，OGD處理之后，Vps34和Beclin1的SUMO化修飾明顯減少（P＜0.01）（圖7A，C1），當(dāng)過表達(dá)Ubc9后，Vps34和Beclin1的SUMO化修飾明顯上調(diào)（P＜0.01）（圖 7B1，B2，C2），提示過表達(dá)Ubc9后可能通過提高與自噬激活和自噬降解過程均相關(guān)的Vps34和Beclin1的SUMO化修飾，從而同時(shí)促進(jìn)自噬激活和自噬降解過程改善OGD后的自噬流障礙，進(jìn)而保護(hù)OGD后心肌細(xì)胞免受凋亡。

Fig.5 Effect of Ubc9 overexpression on autophagy in NRCMs under OGD by Western blotting.See Fig.3 for cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=4-10.＊＊P＜0.01，compared with Adv-GFP group；##P＜0.01，com?pared with Adv-GFP+OGD group.

Fig.6 Effect of Ubc9 overexpression on LC3Ⅱ expres?sion in NRCMs after delivery of bafilomycin A1（BFA1）under OGD by Western blotting.NRCMs were transfected with Adv-Ubc9 50 moi or Adv-GFP 25 moi for 46 h，stimulated with BFA1 50 nmol·L-1for 2 h，and then stimulated by OGD for 6 h with BFA1 50 nmol·L-1.1：Adv-GFP+OGD；2：Adv-GFP+OGD+BFA1 50 nmol·L-1；3：Adv-Ubc9+OGD+BFA1 50 nmol·L-1.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=4-8.＊＊P＜0.01，compared with Adv-GFP+OGD group；##P＜0.01，compared with Adv-GFP+OGD+BFA1 50 nmol·L-1.

Fig.7 Effect of Ubc9 overexpression on SUMO-1，Vps34 and Beclin1 expression in NRCMs under OGD by Western blotting（A）and SUMOylated Vps34（B1）and SUMOylated Beclin1（B2）levels in NRCMs under OGD by co-immu?noprecipitation assay.See Fig.3 for cell treatment.Input：total protein for the positive control.Lysate was used for Western blotting before immunoprecipitation（IP）to eliminate false positive interference.IP was used to purificate the target protein；IP：Vps34 repre?sents purification of Vps34 protein；IP：Beclin1 represents purification of Beclin1 protein.Immunoblotting(IB)：Western blotting of purifi?cated target protein.IB：SUMO-1 represents combine of SUMO-1 with purificated target protein through Western blotting.Lane 1：Adv-GFP group；lane 2：Adv-GFP+OGD group；lane 3：Adv-Ubc9+OGD group.C1 was the semi-quantitative result of A，C2 was the quantified result of B1 and B2，which was the fold change of SUMOylated Vps34 or Beclin1 in total Vps34 or Beclin1.±s，n=4-10.＊＊P＜0.01，compared with Adv-GFP group；##P＜0.01，compared with Adv-GFP+OGD group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Ubc9能明顯抵抗乳大鼠心肌細(xì)胞OGD后的凋亡，當(dāng)用Ubc9-siRNA沉默乳大鼠心肌細(xì)胞的內(nèi)源性Ubc9后，OGD導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷進(jìn)一步加劇，表明Ubc9具有抵抗心肌細(xì)胞低氧損傷的作用，對此進(jìn)行了可能的機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)OGD 6 h之后自噬底物P62明顯堆積，提示自噬流發(fā)生障礙，但是LC3Ⅱ的表達(dá)明顯減少，當(dāng)過表達(dá)Ubc9后，能明顯逆轉(zhuǎn)OGD處理導(dǎo)致的自噬底物P62的堆積，但對LC3Ⅱ的表達(dá)無影響，在此基礎(chǔ)上，通過給予BFA1抑制自噬體溶酶體融合即抑制自噬降解過程后，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Ubc9后LC3Ⅱ的表達(dá)顯著增加，表明了Ubc9改善自噬流障礙的作用機(jī)制可能與自噬流整體變化相關(guān)，即同時(shí)促進(jìn)自噬激活和自噬降解過程。OGD后，Vps34和Beclin1的SUMO化修飾明顯減少，當(dāng)過表達(dá)Ubc9后Vps34和Beclin1的SUMO化修飾明顯上調(diào)，提示過表達(dá)Ubc9后可能通過提高與自噬激活和自噬降解過程均相關(guān)的Vps34和Beclin1的SUMO化修飾，從而同時(shí)促進(jìn)自噬激活和自噬降解過程改善OGD后的自噬流障礙，進(jìn)而抵抗OGD后心肌細(xì)胞的凋亡。

眾所周知，急性心肌梗死是危害人類健康的重大疾病，是全球人類的主要死亡原因之一，隨著《美國急性心肌梗死治療指南》的積極推廣，其心肌梗死的患病率和病死率得到有效控制。但在我國，2001-2011年急性心肌梗死人數(shù)增加了4倍［7］。當(dāng)前臨床對急性心肌梗死的治療包括藥物治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療，冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)，其治療核心是對缺血心肌和冠脈進(jìn)行再灌注［8］，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（primary percutaneous coronary intervention，PPCI）是對于缺血性心臟病最好的治療手段［9］，使得高達(dá)95%冠脈血管再通［10-12］，但是研究表明，心?；颊咝性俟嘧⒅委熀?，盡管能成功恢復(fù)心外膜血流，但高達(dá)60%的患者，由于血栓性碎片和受損的內(nèi)皮細(xì)胞及炎性細(xì)胞，還有一些從受損的內(nèi)皮細(xì)胞釋放的血管活性介質(zhì)，它們會(huì)進(jìn)一步的堵塞心內(nèi)膜微血管，造成微循環(huán)障礙，出現(xiàn)“無復(fù)流”現(xiàn)象［13］，長期以往會(huì)繼發(fā)心衰，造成心肌細(xì)胞死亡、心室重構(gòu)或再發(fā)心梗［14］。由此，心梗后心肌組織的有效修復(fù)，是改善微循環(huán)障礙，防止心梗后心衰或再發(fā)心梗的關(guān)鍵。近年來，隨著基礎(chǔ)研究和臨床研究的不斷推進(jìn)和微循環(huán)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)部分中成藥可以降低無復(fù)流和微循環(huán)障礙的發(fā)生率，但高質(zhì)量的循證依據(jù)仍然較少［15-16］。所以，尋求到更加有效靶點(diǎn)修復(fù)心梗后心肌組織，防止心梗后心衰或再發(fā)心梗迫在眉睫。本研究采用大鼠NRCM行OGD處理，模擬體內(nèi)心肌缺血，通過轉(zhuǎn)染腺病毒過表達(dá)Ubc9和轉(zhuǎn)染Ubc9-siRNA沉默Ubc9。結(jié)果顯示，過表達(dá)Ubc9能明顯減少OGD引起的細(xì)胞凋亡，而沉默Ubc9則出現(xiàn)相反的結(jié)果。此結(jié)果首次從正反2個(gè)方面證明了Ubc9在缺血低氧心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮了必不可少的作用，過表達(dá)Ubc9能有效避免心梗后心肌細(xì)胞大量丟失，從而減少心梗后心室重構(gòu)的發(fā)生，也能使得經(jīng)PPCI治療后的缺血心肌組織得到有效修復(fù)，改善心梗治療預(yù)后。

自噬是清除自體細(xì)胞內(nèi)的長壽命錯(cuò)誤折疊蛋白和受損細(xì)胞器的過程，如線粒體等，但其既有保護(hù)性作用又有促凋亡作用［17-19］。在早期研究報(bào)道中，自噬在心衰中發(fā)揮著重要作用，Schips等［20］發(fā)現(xiàn)小鼠中的FoxO3活化會(huì)導(dǎo)致心臟自噬激活，使心輸出量減少，表明自噬的激活可能導(dǎo)致心衰的發(fā)生；然而，據(jù)Nakai等［21］報(bào)道，若在大鼠中敲除自噬相關(guān)基因ATG5造成自噬被抑制，而心肌反而會(huì)顯示出肌節(jié)結(jié)構(gòu)和線粒體紊亂，從而導(dǎo)致左心室擴(kuò)張和收縮功能障礙，最終導(dǎo)致心衰的發(fā)生。由此說明保持自噬的平衡是維持心肌穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵之一。本實(shí)驗(yàn)室前期研究報(bào)道，自噬在小鼠急性心梗早期被迅速激活，急性心梗第3天起自噬底物P62開始堆積，提示在急性心梗發(fā)展過程中自噬流功能障礙，缺血引起的自噬流功能受損加重了急性心梗后心臟功能障礙及心室重構(gòu)［3］。本研究結(jié)果也表明，OGD 6 h后自噬底物發(fā)生明顯堆積，自噬流發(fā)生障礙，同時(shí)，活化的胱天蛋白酶3的表達(dá)和心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量也明顯提高，說明心肌細(xì)胞OGD后的自噬流障礙導(dǎo)致了心肌細(xì)胞凋亡。

Ubc9是目前發(fā)現(xiàn)的SUMO化修飾靶蛋白過程中唯一的E2結(jié)合酶，在SUMO化修飾過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Ubc9參與細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄、代謝過程，具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)間相互結(jié)合、錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)降解和抗氧化應(yīng)激的作用［22］。有研究表明，高表達(dá)Ubc9能增強(qiáng)SUMO化修飾從而保護(hù)缺血神經(jīng)元細(xì)胞免受凋亡［4］和抵抗腦缺血損傷［5］，但在急性心肌梗死中，Ubc9能否參與缺血低氧心肌細(xì)胞自噬過程，及是否會(huì)調(diào)節(jié)缺血低氧心肌細(xì)胞自噬蛋白的SUMO化修飾水平，進(jìn)而保護(hù)缺血心肌細(xì)胞還未知。本研究結(jié)果顯示，隨著OGD時(shí)間的延長，自噬底物P62發(fā)生堆積，LC3Ⅱ發(fā)生明顯下調(diào)，而過表達(dá)Ubc9能明顯逆轉(zhuǎn)自噬底物P62的堆積，但對LC3Ⅱ的改變不顯著。LC3Ⅱ的變化與自噬激活和自噬降解均相關(guān)。當(dāng)給予自噬體溶酶體融合抑制劑BFA1，用以阻斷自噬降解，觀察Ubc9對自噬激活的影響，結(jié)果表明，在BFA1作用的前提下，過表達(dá)Ubc9顯著增加LC3Ⅱ的表達(dá)，說明過表達(dá)Ubc9后自噬激活增強(qiáng)。研究結(jié)果同時(shí)也解釋了在無BFA1作用下過表達(dá)Ubc9后對LC3Ⅱ的改變不顯著，可能是由于過表達(dá)Ubc9后自噬降解增加促進(jìn)了LC3Ⅱ的降解，從而抵消了自噬激活增加導(dǎo)致的LC3Ⅱ的上調(diào)，所以過表達(dá)Ubc9后整體表現(xiàn)為對LC3Ⅱ的表達(dá)無影響。Ubc9會(huì)調(diào)節(jié)蛋白的SUMO化修飾。本研究表明，心肌細(xì)胞在過表達(dá)Ubc9能明顯增強(qiáng)OGD后蛋白的SUMO化修飾水平，然而過表達(dá)Ubc9是否會(huì)調(diào)節(jié)缺血低氧心肌細(xì)胞自噬蛋白的SUMO化水平，進(jìn)而對缺血心肌產(chǎn)生影響卻不得而知。最近有研究報(bào)道，過表達(dá)Ubc9可能促進(jìn)vps34的SUMO化修飾，從而增強(qiáng)自噬清除蛋白質(zhì)毒性心肌內(nèi)的錯(cuò)誤折疊蛋白，提高了蛋白質(zhì)毒性心肌病小鼠的心臟功能［6］。Vps34和Beclin1是與自噬流的自噬激活和自噬降解過程均相關(guān)的磷脂酰肌醇3激酶（classⅢphosphatidylinositol 3-kinase，PI3K-Ⅲ）復(fù)合體的核心組成部分。研究表明，PI3K-Ⅲ復(fù)合體的活性直接影響了自噬激活和自噬降解過程。當(dāng)Vps34的SUMO化修飾增強(qiáng)，會(huì)使得Vps34和Beclin1結(jié)合增強(qiáng)，從而使得PI3KⅢ復(fù)合體活性增強(qiáng)［23-24］。本研究通過蛋白免疫共沉淀檢測到OGD之后Vps34和Beclin1的SUMO化修飾明顯減少，當(dāng)過表達(dá)Ubc9后Vps34和Beclin1的SUMO化修飾明顯上調(diào)，提示過表達(dá)Ubc9后可能通過提高與自噬激活和自噬降解過程均相關(guān)的Vps34和Beclin1的SUMO化修飾，從而同時(shí)促進(jìn)自噬激活和自噬降解過程改善OGD后的自噬流障礙，使自噬得以保持平衡，最終減少了OGD后心肌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，過表達(dá)Ubc9酶具有保護(hù)OGD后心肌細(xì)胞免受損傷的作用，且該作用可能與增強(qiáng)自噬流的PI3K-Ⅲ復(fù)合體的核心組分Vps34和Beclin1的SUMO化修飾水平，從而同時(shí)促進(jìn)自噬激活和自噬降解過程改善OGD后的自噬流障礙有關(guān)。Ubc9對急性心肌梗死后細(xì)胞具有保護(hù)作用及其可能的自噬靶點(diǎn)作用機(jī)制，為增強(qiáng)急性心肌梗死后心臟功能，減少介入術(shù)后并發(fā)癥如無復(fù)流和微循環(huán)障礙的發(fā)生率，使得經(jīng)PPCI治療后的缺血心肌組織得到有效修復(fù)，提供了新靶點(diǎn)和新思路，為新藥的開發(fā)與利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。