王梓萱，周 靜，唐 玥，石 歡，黃曉薇，鄧敬桓，胡曉曉，陳攀紅，李忠杰，戴惠淇，馮 吉，Sayantan CHATTERJEE，盧國棟

（廣西醫(yī)科大學(xué)1.公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，4.國際教育學(xué)院，廣西南寧 530021；2.廣西高校高發(fā)疾病預(yù)防與控制研究重點實驗室，廣西南寧 530021）

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡，機體通過細(xì)胞增殖和凋亡維持動態(tài)平衡，一旦平衡被打破則會引發(fā)一系列疾病，如腫瘤［1］。流行病學(xué)資料表明，世界范圍內(nèi)惡性腫瘤總體發(fā)病率呈現(xiàn)持續(xù)升高趨勢，腫瘤已成為全球主要死因［2］。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是藥物執(zhí)行抗腫瘤效應(yīng)的主要作用方式之一［3］，P53蛋白的失活使細(xì)胞無法感知刺激細(xì)胞凋亡的DNA損傷，突變型p53不僅失去了其抗腫瘤轉(zhuǎn)錄活性，而且還促進腫瘤增殖侵襲，以及提高耐藥性等促癌功能［4］。尋找可作用于p53突變或缺失的腫瘤、且靶點明確以及毒副作用少的新分子意義深遠(yuǎn)。

槲皮素（quercetin）是一種天然存在的多酚類黃酮［5］，具有抗炎、抗氧化等生物活性和藥理作用［6］。已知它在腫瘤細(xì)胞中介導(dǎo)內(nèi)在（線粒體）和外在（Fas/FasL）凋亡性細(xì)胞死亡［7］，通過調(diào)節(jié)FoXo3a活性誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯［8］，對順鉑誘導(dǎo)的線粒體功能障礙具有改善作用［9］。然而槲皮素對腫瘤細(xì)胞的作用機制尚未闡明，尤其是槲皮素對于p53突變或缺失的腫瘤細(xì)胞的作用尚缺乏詳細(xì)而系統(tǒng)的闡述，因此，本實驗以體外腫瘤細(xì)胞為研究對象（其中Hep3B和MDA-MB-231細(xì)胞缺乏正常功能的p53），探討槲皮素對具有不同狀態(tài)p53的腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期為槲皮素應(yīng)用于不同腫瘤的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人肝癌HepG2和Hep3B（自然狀態(tài)下p53缺失）細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫，人乳腺癌MDA-MB-231（自然狀態(tài)下p53突變）細(xì)胞來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC），人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116p53野生型（HCT116 p53WT）和p53敲除型（HCT116 p53KO）由約翰霍普金斯大學(xué)Dr.Vogelstein惠贈。

1.2 試劑和儀器

槲皮素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞95%，貨號Q4951）（美國Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)基（貨號C11995500BT）和胎牛血清（貨號10099141，美國Life Sciences公司）；二甲亞砜（DMSO，貨號：0219605580，美國MP Biomedicals公司）；甲基噻唑基四唑（methyl?thiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT，貨號：C0009，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、碘化丙啶（propidium iodide，PI，貨號：P4170）、辣根過氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記α-微管蛋白單克隆小鼠抗體（貨號：T-5168）和Hoechst33258（貨號：94403，美國Sigma公司）；HRP標(biāo)記胱天蛋白酶3單克隆小鼠抗體（貨號：9668S）、HRP標(biāo)記聚ADP核糖聚合酶〔poly（ADP-ribose）polymerase，PARP〕單克隆兔抗體（貨號：9532）、山羊抗兔IgG二抗（貨號：7074）、山羊抗小鼠IgG二抗（貨號：7076，美國Cell Signaling Technology公司）；HRP標(biāo)記P53單克隆小鼠抗體（貨號：sc-126，美國Santa Cruz公司）；細(xì)胞生物安全柜、細(xì)胞培養(yǎng)箱、MuLTI?SKAN GO型全自動酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；FluorChem HD2凝膠成像系統(tǒng)（美國Proteinsimple公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；cence TDZ5-WS離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；FB124電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

選取腫瘤細(xì)胞于DMEM高糖培養(yǎng)基或MEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）37℃，5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞實驗。

1.4 光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以17×104L-1細(xì)胞接種于6孔板，分成5組處理，分別為空白對照組（只加培養(yǎng)液）、槲皮素12.5，25，50和100 μmol·L-1處理組，24 h后于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞存活

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整每孔細(xì)胞密度為6×103（100 μL），接種于96孔板中，設(shè)空白對照組（加入等體積細(xì)胞培養(yǎng)液）、細(xì)胞對照組（未加槲皮素）和實驗組（加入槲皮素12.5～100 μmol·L-1），每組5復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL MTT，繼續(xù)孵育2 h后棄去孔內(nèi)液體，加入100 μL DMSO，37℃孵育10 min，使用酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度（A490nm）值，實驗重復(fù)3次，計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞存活率（%）＝（實驗組A490nm-空白組A490nm）/（細(xì)胞對照組A490nm-空白組A490nm）×100%

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡

制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為17×104L-1，加入6孔板內(nèi)，每孔2 mL。貼壁后加入不同濃度的槲皮素（12.5，25，50和100 μmol·L-1），同時設(shè)置細(xì)胞對照組（未加槲皮素），將藥物處理24 h的細(xì)胞收集培養(yǎng)液，PBS 0.01 mol·L-1清洗 1 次，加入 0.3 mL 0.25%胰蛋白酶消化3 min，終止消化后收集至15 mL離心管中，1171×g離心5 min，棄去上清液；用PBS 0.01 mol·L-1500 μL重懸細(xì)胞，在混勻機上加入4℃預(yù)冷的75%乙醇4.5 mL固定細(xì)胞，-20℃過夜，加入RNase A和PI后37℃水浴避光孵育30 min，上機檢測，實驗重復(fù)3次。

1.7 Hoechst33258染色檢測細(xì)胞凋亡

制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為17×104L-1，加入6孔板內(nèi)，每孔2 mL。待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的槲皮素（12.5，25，50和100 μmol·L-1），同時設(shè)置細(xì)胞對照組（未加槲皮素），處理24 h后終止培養(yǎng)，用PBS 0.01 mol·L-1漂洗3次，每孔加入0.9 mL培養(yǎng)液和Hoechst33258工作液100 μmol·L-1100 μL，室溫染色30～45 min，熒光顯微鏡觀察。

1.8 Western印跡法檢測胱天蛋白酶3、活化的胱天蛋白酶3、PARP和活化的PARP蛋白表達(dá)水平

制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為26×104L-1，加入60 mm培養(yǎng)皿，每孔4 mL。貼壁后加入不同濃度的槲皮素（12.5，25和50 μmol·L-1），同時設(shè)置細(xì)胞對照組（未加槲皮素），處理24 h后終止培養(yǎng)，收集細(xì)胞，并加入SDS裂解緩沖液于冰上裂解15 min。BCA法測定蛋白濃度并配平至濃度體積一致的樣品，上樣量30 μg，電泳后轉(zhuǎn)膜至 0.2 μm PVDF膜。封閉液封閉1 h，孵育一抗4℃過夜，一抗?jié)舛确謩e為胱天蛋白酶3（1∶1000）、PARP（1∶5000）、α-微管蛋白（1∶5000）和P53蛋白（1∶5000）。洗膜后加 HRP標(biāo)記的對應(yīng)的二抗（1∶5000），室溫?fù)u床孵育1 h，TBST 0.01 mol·L-1洗膜后用ECL顯影，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度比值表示蛋白的相對表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對多種腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響

光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞對照組細(xì)胞貼壁良好，大小均一，形態(tài)規(guī)則，生長旺盛。隨著槲皮素濃度的增加，24 h后腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞體積縮小，連接消失，細(xì)胞變圓，生長遲緩，細(xì)胞空泡化，部分細(xì)胞脫落（圖1）。

Fig.1 Effect of quercetin on cancer cell morphology.The cells were treated with quercetin 12.5-100 μmol·L-1for 24 h.Arrows show typical morphological changes，where cells beceme oblate or even vacuolated.

2.2 槲皮素對多種腫瘤細(xì)胞存活的影響

MTT結(jié)果顯示，槲皮素對腫瘤細(xì)胞的存活率呈濃度（rHepG2=0.972，P＜0.01；rHep3B=0.959，P＜0.01；rMDA-MB-231=0.979，P＜0.01；rHCT116p53WT=0.983，P＜0.01；rHCT116p53KO=0.980，P＜0.01圖2A）和時間（rHepG2=0.974，P＜0.01；rHep3B=0.956，P＜0.01；rMDA-MB-231=0.959，P＜0.01；rHCT116p53WT=0.971，P＜0.01；rHCT116p53KO=0.988，P＜0.01圖2B）依賴性。槲皮素作用48 h對腫瘤細(xì)胞HepG2，Hep3B，MDA-MB-231，HCT116 p53WT和HCT116 p53KO細(xì)胞存活的IC50分別為61.51，70.23，73.65，50.75 和 47.86 μmol·L-1。表明槲皮素隨濃度的增加和作用時間的延長，對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用愈明顯。

2.3 槲皮素對HCT116 p53WT和HCT116 p53KO細(xì)胞周期和凋亡的影響

HCT16 p53WT細(xì)胞中有P53蛋白表達(dá)，而在HCT116 p53KO細(xì)胞中無P53蛋白表達(dá)，說明敲除成功（圖3A）。Hoechst33258染色結(jié)果表明（圖3B），HCT116 p53KO和HCT116 p53WT細(xì)胞中，細(xì)胞對照組均可見均質(zhì)、淡藍(lán)色的熒光，少見或未見明顯的核染色質(zhì)改變，槲皮素50 μmol·L-1作用細(xì)胞24 h后，細(xì)胞均出現(xiàn)核染色質(zhì)固縮、碎裂和溶解等典型的凋亡現(xiàn)象，在加入泛胱天蛋白酶抑制劑Z-VAD-FMK后，逆轉(zhuǎn)了核染色質(zhì)的改變。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期結(jié)果（圖3C，表1）顯示，2種細(xì)胞生長狀態(tài)良好，而不同濃度的槲皮素處理后的HCT116 p53WT細(xì)胞其周期和凋亡率發(fā)生改變。主要表現(xiàn)為在低濃度（0～25 μmol·L-1）作用下，G0/G1期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞增多（P＜0.01）；在高濃度（50～100 μmol·L-1）作用下，槲皮素對腫瘤細(xì)胞的主要作用表現(xiàn)為顯著促進凋亡（P＜0.01）。相應(yīng)濃度的槲皮素作用于HCT116 p53KO細(xì)胞后也有類似變化。

Fig.2 Effect of quercetin on cell viability of different cancer cells by MTT assay.A：the cells were treated with dif?ferent concentrations of quercetin for 24 h；B：the cells were treated with quercetin 50 μmol·L-1for the indicated time.±s，n=3.

Fig.3 Effect of quercetin on cell cycle and apoptosis of cancer cells.A：the knockout effect of p53 was verified；B：cells were treated with indicated concentrations of quercetin for 24 h in the absence or presence of Z-VAD-FMK while Hoechst33258 stain?ing for nuclear chromatin changes；C：cells were treated with quercetin for 24 h，followed by incubation with PI for 30 min，the cell cycle phase distribution as described.Data was analyzed by Modfit software in Tab.1.

2.4 槲皮素對HCT116 p53WT和HCT116 p53KO細(xì)胞胱天蛋白酶3、活化的胱天蛋白酶3、PARP和活化的PARP蛋白表達(dá)的影響

Western印跡檢測結(jié)果顯示（圖4A），與細(xì)胞對照組相比，隨著槲皮素濃度升高，HCT116 p53WT和HCT116 p53KO細(xì)胞胱天蛋白酶3顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），活化的胱天蛋白酶3無顯著變化；PARP明顯降低（P＜0.01），活化的PARP明顯增多（P＜0.01），提示PARP被切割發(fā)生活化（圖4A2和4B2）。與細(xì)胞對照組比較，槲皮素50 μmol·L-1處理的HCT116 p53WT和HCT116 p53KO細(xì)胞，胱天蛋白酶3明顯下降（P＜0.01），活化的胱天蛋白酶3無顯著變化，PARP 顯著降低（P＜0.01），活化的PARP增加（P＜0.01）。與同濃度槲皮素（50 μmol·L-1）單獨作用相比，聯(lián)合泛胱天蛋白酶抑制劑Z-VADFMK作用細(xì)胞24 h，顯著抑制槲皮素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，并逆轉(zhuǎn)了胱天蛋白酶3、PARP和活化的PARP蛋白的改變（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05）（圖4A3和4B3）。

Tab.1 Effect of quercetin on cell cycle and apoptotic rate of HCT116 p53WT and HCT116 p53KO cells

Fig.4 Effect of quercetin on expressions of poly（ADP-ribose）polymerase（PARP），cleaved-PARP，caspase 3 and cleaved-caspase 3 protein in HCT116 p53WT（A1，A2，A3）and HCT116 p53KO（B1，B2，B3）cells by Western blotting.The cells were pretreated with Z-VAD-FMK 25 μmol·L-1for 1 h，followed by treatment with quercetin 50 μmol·L-1for another 24 h.A2 and B2 were the semi-quantitative results of A1 and B1，respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with quercetin 50 μmol·L-1group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素處理腫瘤細(xì)胞24 h后細(xì)胞表現(xiàn)形態(tài)扁圓，胞膜皺縮等明顯變化，細(xì)胞存活率明顯下降。流式分析提示，槲皮素在低濃度下細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，在高濃度下細(xì)胞凋亡率顯著升高。提示槲皮素對腫瘤細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒作用，且這種毒性作用可能通過激活細(xì)胞凋亡通路實現(xiàn)。

胱天蛋白酶3是細(xì)胞凋亡通路的關(guān)鍵酶，作為執(zhí)行者之一激活下游級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)凋亡［10］。PARP作為細(xì)胞凋亡核心成員胱天蛋白酶的底物，它在DNA損傷修復(fù)與細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用［11］。本研究結(jié)果表明，隨槲皮素濃度的增加，胱天蛋白酶3表達(dá)水平顯著降低，活化的胱天蛋白酶3無明顯變化，提示胱天蛋白酶3被激活，PARP被切割部分明顯增加。在加入泛胱天蛋白酶抑制劑后，反轉(zhuǎn)了胱天蛋白酶3和PARP蛋白表達(dá)水平的改變。結(jié)合流式分析和Hoechst33258染色結(jié)果推測，槲皮素可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且該促凋亡作用是胱天蛋白酶依賴的而非P53依賴的。Ong等［12］在鼻咽癌細(xì)胞HK1和CNE2中發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過P53非依賴的線粒體誘導(dǎo)途徑細(xì)胞凋亡。而Gong等［13］發(fā)現(xiàn)，槲皮素聯(lián)合輻射作用加重乳腺癌細(xì)胞OV2008和A2780的DNA損傷并引起典型的凋亡效應(yīng)，而在敲除p53后幾乎逆轉(zhuǎn)了此類聯(lián)合反應(yīng)，提示槲皮素的輻射增敏性依賴于P53。不同腫瘤細(xì)胞中P53作用的差異性可能受細(xì)胞來源的影響，今后將對其分子作用機制做進一步的探討。