沈曉玲，楊志宏

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京 100193）

多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）常發(fā)生在腫瘤、局灶性癲癇和乙型肝炎等疾病治療過(guò)程中，是指細(xì)胞長(zhǎng)期接觸一種藥物后不僅對(duì)該藥物產(chǎn)生耐藥性，也對(duì)結(jié)構(gòu)和功能不同的多種治療藥產(chǎn)生交叉耐藥性［1-3］。MDR的出現(xiàn)使得藥物治療效果不佳，患者生存期縮短，死亡率升高，因此開發(fā)MDR逆轉(zhuǎn)劑十分必要。

ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)和功能的異常是造成MDR的重要因素。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)48個(gè)基因編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，根據(jù)基因同源性及結(jié)構(gòu)相似性分為7個(gè)亞家族，分別為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A~G［4］。其廣泛分布于人體中，依靠水解ATP釋放的能量逆濃度梯度進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，介導(dǎo)人體眾多重要的生理過(guò)程，如營(yíng)養(yǎng)吸收、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脂質(zhì)代謝等，起到維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的重要作用［5］。在MDR中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)藥物攝取減少同時(shí)增加藥物泵出量，使得細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，無(wú)法達(dá)到預(yù)期治療效果。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）和MDR相關(guān)蛋白（MDR-associated protein，MRP）為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白成員，其表達(dá)上調(diào)是造成MDR的重要原因。下調(diào)這3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)是逆轉(zhuǎn)MDR的關(guān)鍵。

目前MDR逆轉(zhuǎn)劑的臨床試驗(yàn)結(jié)果并不盡如人意，其研發(fā)難點(diǎn)在于如何選擇合適作用位點(diǎn)，在達(dá)到逆轉(zhuǎn)MDR的同時(shí)減少對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白正常生理功能的影響。若其結(jié)合位點(diǎn)不具有特異性，可能導(dǎo)致藥物毒性或不良反應(yīng)；若其作用位點(diǎn)單一，由于不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在代償現(xiàn)象且有多條信號(hào)通路調(diào)控同一轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，會(huì)使作用效果不佳。因此研究上述3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可更好了解其作用機(jī)制，尋找新的作用靶點(diǎn)以開發(fā)高效MDR逆轉(zhuǎn)劑。研究發(fā)現(xiàn)，多種內(nèi)源性和外源性刺激因子，可激活NF-κB信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）級(jí)聯(lián)信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信號(hào)通路和音猬因子（sonic hedgehog，Shh）信號(hào)通路等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而調(diào)節(jié)上述3種蛋白的表達(dá)。

1 多藥耐藥相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基本結(jié)構(gòu)和功能

1.1 P-糖蛋白

人P-gp由Mdr1基因編碼，在Mdr1啟動(dòng)子及其鄰近區(qū)域存在著多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)，包括反向CCAAT盒、激活蛋白1（activator protein 1，AP-1）結(jié)合位點(diǎn)、GC豐富區(qū)、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB結(jié)合域和孕烷X受體反應(yīng)元件等。Mdr1基因含29個(gè)外顯子，編號(hào)為-1～28，上游啟動(dòng)子位于外顯子-1的起始位置，下游啟動(dòng)子位于外顯子1內(nèi)，存在28個(gè)內(nèi)含子，其中26個(gè)可中斷蛋白質(zhì)編碼序列［6-7］。P-gp是典型的ABC類載體，由2個(gè)同源區(qū)段組成，每個(gè)區(qū)段含6個(gè)α螺旋構(gòu)成的疏水跨膜區(qū)和1個(gè)ATP結(jié)合域。跨膜區(qū)可形成藥物結(jié)合位點(diǎn)和藥物輸運(yùn)通道，底物與跨膜區(qū)結(jié)合后，2個(gè)ATP結(jié)合域相互靠近并與ATP結(jié)合，形成“三明治”結(jié)構(gòu)，中間形成孔道，將底物泵出細(xì)胞外［8］。在人體中，P-gp主要表達(dá)于腸、腎、肝、腦血管、睪丸和胎盤等，成為血腦屏障、血睪屏障和胎盤屏障的重要部分。P-gp特異性較差，外排底物廣泛，可外排分子結(jié)構(gòu)差異較大的親脂性或兩親性藥物［9］。

1.2 乳腺癌耐藥蛋白

BCRP由655個(gè)氨基酸組成，是半ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為72.6 ku［10］。其基因定位在4號(hào)染色體長(zhǎng)2區(qū)2帶（4q22）上，基因長(zhǎng)度為66 kb，含16個(gè)外顯子和15個(gè)內(nèi)含子，缺乏標(biāo)準(zhǔn)的TATA盒，但在CpG島的下游含5個(gè)激活轉(zhuǎn)錄因子1結(jié)合位點(diǎn)和若干AP-1結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)還包括若干雌激素、孕激素結(jié)合元件和低氧反應(yīng)元件，提示激素和低氧可能調(diào)控BCRP的表達(dá)［11-13］。BCRP在結(jié)構(gòu)上與一般ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不同，僅有1個(gè)由6條肽鏈組成的跨膜區(qū)和1個(gè)ATP結(jié)合域，常以二聚體或多聚體形式發(fā)揮作用［14］。BCRP在胎盤、腦、前列腺、小腸、睪丸、卵巢、結(jié)腸和肝中高度表達(dá)，是血腦屏障、血睪屏障和胎盤屏障的重要組成部分。BCRP對(duì)米托蒽醌、拓?fù)涮婵岛投嗳岜刃堑犬a(chǎn)生交叉耐藥性，會(huì)影響乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和白血病等疾病的化療效果［15-16］。

1.3 多藥耐藥相關(guān)蛋白

MRP是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的C亞族，目前發(fā)現(xiàn)9種具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能的 MRP，分別為 MRP1～MRP9［17］。其結(jié)構(gòu)與P-gp類似，具有2個(gè)跨膜區(qū)和2個(gè)ATP結(jié)合域。MRP家族成員根據(jù)其跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)分為2類，MRP1，MRP2，MRP3，MRP6和MRP7除有2個(gè)由5～6個(gè)α螺旋構(gòu)成的跨膜區(qū)外，其-NH2端還有5個(gè)跨膜螺旋。而MRP4，MRP5，MRP8和MRP9的-NH2端只有約200個(gè)氨基酸，保守性低。MRP家族廣泛分布于肺、腎、睪丸和心等臟器中，各亞型的結(jié)構(gòu)、分布和轉(zhuǎn)運(yùn)底物都存在較大差異。MRP介導(dǎo)的MDR機(jī)制可能為抗癌藥物與谷胱甘肽結(jié)合后，從細(xì)胞核移至細(xì)胞質(zhì)囊泡中，由MRP排出細(xì)胞［18］。

2 多藥耐藥相關(guān)信號(hào)通路對(duì)相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控作用

MDR相關(guān)蛋白表達(dá)與功能主要由NF-κB信號(hào)通路、MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路和Shh信號(hào)通路等調(diào)控，許多內(nèi)源性或外源性刺激都可激活這些通路（圖1），且不同信號(hào)通路間存在相互影響和交疊作用。

2.1 NF-κB信號(hào)通路對(duì)相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控作用

NF-κB常以p50/p65二聚體的形式存在，在機(jī)體正常生理狀態(tài)和疾病模式下都起著重要的調(diào)節(jié)作用。通常NF-κB及其抑制蛋白（inhibitor of κappaB，IκB）在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合，不具有生物活性，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，IκB發(fā)生磷酸化繼而被降解，NF-κB釋放，進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因結(jié)合，調(diào)控多種基因表達(dá)，因此與腫瘤MDR發(fā)生有密切關(guān)系［19］。

2.1.1對(duì)P-糖蛋白的調(diào)控作用

NF-κB可在內(nèi)源性和外源性刺激下激活，如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、MAPK以及內(nèi)毒素、致癌物輻射和化學(xué)治療劑等［20］。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后可與Mdr1基因第1個(gè)內(nèi)含子中NF-κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)Mdr1基因的表達(dá)，通常情況下可上調(diào)Mdr1mRNA和P-gp的表達(dá)［21］。

TNF-α和白細(xì)胞介素17（interleukin 17，IL-17）等內(nèi)源性刺激通過(guò)不同途徑激活NF-κB信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞P-gp的表達(dá)與功能增強(qiáng)，在加入NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸銨后，TNF-α對(duì)P-gp的誘導(dǎo)作用減弱，推測(cè)TNF-α可能通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路上調(diào)P-gp表達(dá)與功能［22］。而IL-17可能通過(guò)激活信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）/NF-κB通路誘導(dǎo)P-gp的表達(dá)上調(diào)［23］。當(dāng)人體穩(wěn)態(tài)失調(diào)，出現(xiàn)腫瘤病變時(shí)，這些內(nèi)源性因子釋放量會(huì)增加，由于其能上調(diào)部分ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)，導(dǎo)致MDR加重，削弱化療效果，在治療過(guò)程中值得注意。腫瘤細(xì)胞在自身分裂增殖過(guò)程中也可激活NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)P-gp表達(dá)增加，G2/M期阻滯引起檢測(cè)點(diǎn)激酶2的激活，隨后增加p53并促進(jìn)細(xì)胞核中的p65積聚，最終上調(diào)P-gp表達(dá)［24］。

氯離子通道（chloride channel，ClC）3是電壓門控ClC蛋白家族的成員，在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，與癌細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移相關(guān)。ClC-3在人胃癌組織中過(guò)表達(dá)，敲除其基因后可在體外抑制細(xì)胞增殖和遷移［25-26］。已有研究表明，ClC-3參與腫瘤MDR形成，減弱化療藥治療效果。ClC-3過(guò)表達(dá)可減弱順鉑對(duì)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的抑制作用［27］。ClC-3可加速囊泡酸化，降低藥物在細(xì)胞內(nèi)濃度，此外其也可對(duì)P-gp產(chǎn)生影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ClC-3可通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路上調(diào)MDR1 mRNA和P-gp的表達(dá)。在乳腺癌耐細(xì)胞株MCF-7/DOX 中，IκB激酶α（IκB kinase α，IKKα），IKKβ和NF-кB/P65蛋白的表達(dá)顯著高于MCF-7細(xì)胞。通過(guò)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/ClC-3載體，MCF-7細(xì)胞中ClC-3的表達(dá)顯著上調(diào)，并且增加了IKKα，IKKβ，NF-кB/P65以及磷酸化IкBα/Ser32的表達(dá)。此外，MCF-7細(xì)胞中ClC-3表達(dá)的上調(diào)導(dǎo)致p65從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，啟動(dòng)P-gp表達(dá)［28］。在IL-1β或TNF-α激活NF-κB信號(hào)通路過(guò)程中，ClC-3也起著必不可少的作用。IL-1β或TNF-α可激活細(xì)胞內(nèi)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinu?cleotide phosphate，NADPH）氧化酶1進(jìn)而產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)重要介質(zhì)，可激活NF-κB，但這一過(guò)程需要ClC-3來(lái)中和NADPH氧化酶1在信號(hào)傳導(dǎo)內(nèi)膜上產(chǎn)生的電子流［29］。ClC-3是一個(gè)非常重要的信號(hào)調(diào)控節(jié)點(diǎn)，有成為MDR逆轉(zhuǎn)劑靶點(diǎn)的潛在可能，抑制ClC-3一方面可降低腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，另一方面可降低P-gp表達(dá)，增強(qiáng)化療藥療效，同時(shí)還可在一定程度上降低NF-κB對(duì)IL-1β或TNF-α刺激的響應(yīng)，達(dá)到逆轉(zhuǎn)MDR，治療腫瘤的目的。

除內(nèi)源性物質(zhì)外，外源性藥物也可影響該信號(hào)通路。近期研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥性，作用機(jī)制可能為減少細(xì)胞核內(nèi)p65含量，抑制IκBα磷酸化，從而抑制NF-κB的激活，最終下調(diào)P-gp的表達(dá)［30］。這一發(fā)現(xiàn)提示我們可從已有藥物入手，對(duì)已有藥物進(jìn)行二次開發(fā)，挖掘藥物新的藥理作用以逆轉(zhuǎn)MDR。

但也有研究表明，NF-κB活化，p65核轉(zhuǎn)位增加可減少P-gp mRNA和蛋白的表達(dá)。在人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞LS-174T細(xì)胞中，蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的特異性激動(dòng)劑佛波酯可顯著降低細(xì)胞中P-gp mRNA和蛋白的表達(dá)，其作用機(jī)制可能為佛波酯活化PKC，進(jìn)而磷酸化IKKα/β和IκBα，使得NF-κB被激活，引起p65核轉(zhuǎn)位增加。細(xì)胞核內(nèi)的p65與孕烷X受體/維A酸X受體復(fù)合物結(jié)合，阻礙該復(fù)合物與Mdr1基因上調(diào)控序列結(jié)合從而下調(diào)P-gp的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)［31］。

圖1多藥耐藥相關(guān)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路.Nrf-2：核因子E2相關(guān)因子2；Keap1：胞質(zhì)接頭蛋白；ARE：抗氧化反應(yīng)元件；STAT3：信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)因子3；RPTK：受體蛋白酪氨酸激酶；Ras：大鼠肉瘤蛋白；Raf：絲裂原活化蛋白激酶激酶；Smo：抑制跨膜蛋白；AP-1：激活蛋白1；ERK：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶；GFR：生長(zhǎng)因子受體；PIP2：二磷酸肌醇；P38：相對(duì)分子質(zhì)量為38 ku絲裂原活化蛋白激酶；IL-17：白細(xì)胞介素17；IκB：NF-κB抑制蛋白；NF-κB：活化B細(xì)胞核因子κ-輕鏈增強(qiáng)子；Nox-1：NADPH氧化酶1；ROS：活性氧；PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶；PDK：磷酸肌醇依賴蛋白激酶；PIP3：三磷酸肌醇；MEK：絲裂原活化蛋白激酶激酶；PTCH1：跨膜受體蛋白1；AKT：蛋白激酶B；JNK：c-Jun氨基端激酶（應(yīng)激活化蛋白激酶）；ClC-3：氯離子通道3.

2.1.2對(duì)乳腺癌耐藥蛋白和多藥耐藥相關(guān)蛋白的調(diào)控作用

在耐多柔比星乳腺癌細(xì)胞株MCR-7/ADR中，人第10號(hào)染色體缺失磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）可抑制NF-κB信號(hào)通路活化，miR-132/-212通過(guò)抑制PTEN從而激活NF-κB信號(hào)通路，上調(diào)BCRP表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)多柔比星敏感性降低，還發(fā)現(xiàn)miR-132和miR-212過(guò)表達(dá)至少部分歸因于NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的反式激活［32-33］。NF-κB 還可與雌激素協(xié)同作用，調(diào)控BCRP基因的表達(dá)。雌激素受體（estrogen receptor，ER）和雌激素應(yīng)答元件（estrogen response element，ERE）在BCRP表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮作用。促炎因子以NF-κB依賴方式增強(qiáng)ER活性。ER允許NF-κB家族成員p65訪問(wèn)位于ERE附近的潛在NF-κB應(yīng)答元件。NF-κB的募集反過(guò)來(lái)穩(wěn)定雌激素與ER和ERE的結(jié)合率。ER和p65在相鄰反應(yīng)元件上的這種協(xié)同結(jié)合的結(jié)果導(dǎo)致Abcg2mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的顯著增加［34］。以MDR相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白信號(hào)通路上的相關(guān)目的基因元件為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)基因藥物，可以恢復(fù)耐藥性細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性。

機(jī)體內(nèi)部環(huán)境的改變有可能影響ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)與功能，造成MDR。在高氨血癥中，血氨水平異常升高可在體內(nèi)外激活NF-κB信號(hào)通路，增加MRP2mRNA和蛋白表達(dá)，這種作用可被NF-κB抑制劑改變［35］。共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變（ataxia telangiectasia-mutated，ATM）基因參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)，在化療藥物誘導(dǎo)的MDR形成中起重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，喜樹堿和順鉑在治療小細(xì)胞肺癌時(shí)可激活A(yù)TM基因，其編碼的蛋白磷酸化后可刺激IκBα和P65的磷酸化，增加P65的核轉(zhuǎn)位，從而上調(diào)MRP2和ABCG2的表達(dá)，導(dǎo)致MDR［36］。

NF-κB信號(hào)通路可被多種因素激活，激活后可上調(diào)P-gp，BCRP和MRP在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，NF-κB活化是整個(gè)信號(hào)通路的關(guān)鍵點(diǎn)，可開發(fā)其抑制劑，以達(dá)到改善MDR的目的，但仍需注意其可能帶來(lái)的毒性及副作用。

2.2 MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路對(duì)相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控作用

MAPK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在接受細(xì)胞外信號(hào)刺激后可通過(guò)三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)傳遞信號(hào)。炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及一些細(xì)胞外信號(hào)刺激先后激活MAPK激酶激酶（MAPK kinase kinase，MKKK/Raf）和 MAPK 激酶（MAPK kinase，MKK/MEK），然后通過(guò)絲氨酸和蘇氨酸雙位點(diǎn)磷酸化激活MAPK，活化的MAPK進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)多種結(jié)構(gòu)蛋白及酶類，維持細(xì)胞正常生理狀態(tài)［37］。

MAPK主要有4個(gè)亞族，分別是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、P38和ERK5，分別介導(dǎo)4條不同的信號(hào)通路［38］。其中ERK，JNK和P38介導(dǎo)的通路在MDR機(jī)制中研究較多。

2.2.1 ERK信號(hào)通路對(duì)相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控作用

Raf/MEK/ERK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路是參與調(diào)節(jié)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞增殖、存活和分化的關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)途徑。它將來(lái)自細(xì)胞表面受體的信號(hào)通過(guò)磷酸化方式逐級(jí)傳遞至細(xì)胞核調(diào)節(jié)眾多基因表達(dá)。大鼠肉瘤蛋白（rat sarcoma protein，Ras）是該條信號(hào)通路的關(guān)鍵上游激活劑。生長(zhǎng)因子與其受體結(jié)合后激活酪氨酸激酶，通過(guò)銜接蛋白將信號(hào)傳遞至Ras蛋白，使其活化，活化的Ras使Raf絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化而激活MEK1/2雙特異性蛋白激酶，然后磷酸化并激活ERK1/2?；罨腅RK是信號(hào)傳導(dǎo)模塊的下游組分，可易位至細(xì)胞核，磷酸化和調(diào)節(jié)各種轉(zhuǎn)錄因子，包括AP-1，最終導(dǎo)致基因表達(dá)的變化［39-40］。

近期研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）可參與腫瘤微環(huán)境形成，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，其外泌體可在體內(nèi)外增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的化學(xué)抗性。雖MSC外泌體攜帶P-gp蛋白，但這并不是其發(fā)揮抗藥性的主要機(jī)制。MSC外泌體主要依靠鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶（calcium/calmodulin-dependent protein kinases，CaM-Ks）/Raf/MEK/ERK軸的激活上調(diào)MDR1，MRP和LRP基因表達(dá)從而產(chǎn)生MDR。MSC外泌體可能通過(guò)受體與胃癌細(xì)胞相互作用，導(dǎo)致鈣通道的激活和細(xì)胞內(nèi)鈣的流入，形成鈣/鈣調(diào)蛋白復(fù)合物激活CaM-Ks。CaM-Ks激活后，Raf1，MEK1/2和ERK1/2活化增加，從而上調(diào)相關(guān)基因表達(dá)，表明Raf/MEK/ERK激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)是CaM-Ks的下游之一。且CaM-Ks特異性抑制劑KN-93阻斷了MSC外泌體對(duì)Raf/MEK/ERK激酶的活化［41］。MSC外泌體可能是MDR逆轉(zhuǎn)劑的潛在作用靶點(diǎn)，開發(fā)其抑制劑不僅可改善腫瘤細(xì)胞微環(huán)境也可通過(guò)阻斷信號(hào)通路下調(diào)MDR相關(guān)基因表達(dá)。

另有研究表明，Ras-Raf-ERK信號(hào)通路下游的效應(yīng)因子不同，對(duì)BCRP的調(diào)控作用不同。激活MEK-ERK-RSK途徑可使BCRP轉(zhuǎn)錄下調(diào)，而激活MEK-ERK-non-RSK途徑后BCRP轉(zhuǎn)錄上調(diào)。雖ERK的直接下游效應(yīng)因子仍有待闡明，但這些研究提供了BCRP表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制的新見解，有助于BCRP特異性調(diào)節(jié)劑的研發(fā)［42］。

2.2.2 JNK信號(hào)通路對(duì)相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控作用

JNK信號(hào)通路可被多種細(xì)胞因子激活，激活后參與多種生理活動(dòng)，包括細(xì)胞的增殖分化、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等。MDR的產(chǎn)生也與該通路有著密切的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，JNK信號(hào)通路影響人肝癌耐藥細(xì)胞株Bel-7402/FUMDR1基因和P-gp的表達(dá)。耐藥細(xì)胞中JNK蛋白含量并不增加，但p-JNK蛋白增加，抑制JNK信號(hào)通路后，MDR1 mRNA和P-gp表達(dá)均下降［43］。研究發(fā)現(xiàn)，JNK信號(hào)通路被激活后，c-Jun和c-Fos蛋白表達(dá)增加，由二者組成的異二聚體AP-1含量增加，與Mdr1上AP-1結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合增強(qiáng)，從而上調(diào)MDR1表達(dá)［44］。JNK信號(hào)通路也可調(diào)節(jié)MRP表達(dá)，龍葵堿可通過(guò)抑制JNK信號(hào)通路下調(diào)MRP1表達(dá)使得抗性人髓系白血病細(xì)胞系K562/ADM對(duì)注射用鹽酸多柔比星恢復(fù)敏感［45］。

JNK信號(hào)通路對(duì)MDR相關(guān)蛋白表達(dá)和功能的調(diào)控除與基因結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子類型相關(guān)外，還受腫瘤細(xì)胞所處環(huán)境影響。在常氧狀態(tài)下，JNK信號(hào)通路激活可誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HOP-62中MDR1表達(dá)下調(diào)，其機(jī)制是增加c-Jun與MDR啟動(dòng)子中AP-1位點(diǎn)的結(jié)合，這一過(guò)程需要組蛋白去乙?；?來(lái)共同作用。但在細(xì)胞低氧狀態(tài)下JNK通路誘導(dǎo)MDR1上調(diào)是通過(guò)增加低氧誘導(dǎo)因子1與MDR1啟動(dòng)子中低氧應(yīng)答元件的結(jié)合實(shí)現(xiàn)，同時(shí)需要轉(zhuǎn)錄共激活因子P300/CBP參與［46］。由于腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中普遍存在由于供血不足和癌細(xì)胞增殖能量消耗導(dǎo)致的組織低氧，故而激活JNK信號(hào)通路往往可使腫瘤細(xì)胞的Mdr1基因表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)腫瘤MDR現(xiàn)象。因此，在開發(fā)MDR逆轉(zhuǎn)劑時(shí)也可從改善腫瘤內(nèi)部環(huán)境著手。

2.2.3 P38MAPK信號(hào)通路對(duì)相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控作用

P38蛋白由360個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為38 ku。在其一級(jí)結(jié)構(gòu)上存在含蘇氨酸和酪氨酸“T環(huán)結(jié)構(gòu)”，是決定P38MAPK活性的關(guān)鍵區(qū)域。生理應(yīng)激、細(xì)胞炎性因子如TNF-α、IL-1、藥物等因素均可經(jīng)過(guò)三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)使“T環(huán)結(jié)構(gòu)”上蘇氨酸和酪氨酸雙磷酸化，激活P38MAPK，活化的P38信號(hào)通路可調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄活性，如NF-κB、熱休克轉(zhuǎn)錄因子等［47］。Mdr1基因作為其下游基因亦受P38信號(hào)通路調(diào)節(jié)，P38過(guò)度活化可上調(diào)P-gp表達(dá)，導(dǎo)致MDR。從藤黃木材中分離出的3種化合物藤黃酮K（guttiferone K）、嶺南山竹子素C（oblongi?folin C）和異巴西紅厚殼素（isojacareubin）可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控P-gp表達(dá)，使用P38MAPK特異性抑制劑SB202190可逆轉(zhuǎn)上述3種化合物對(duì)P-gp表達(dá)的上調(diào)，表明P38MAPK信號(hào)通路確實(shí)參與P-gp表達(dá)調(diào)控［48］。積雪草酸可增加抗順鉑肺癌細(xì)胞A549/DDP細(xì)胞株對(duì)順鉑敏感性，其機(jī)制可能為抑制P38磷酸化，進(jìn)而抑制Y-盒結(jié)合蛋白1核轉(zhuǎn)位，從而下調(diào)P-gp表達(dá)［49］。P38MAPK信號(hào)通路的激活也可增加難治性癲癇大鼠腦內(nèi)MRP1的表達(dá)，與P-gp產(chǎn)生外排抗癲癇藥物的協(xié)同效應(yīng)［50］。“T環(huán)結(jié)構(gòu)”上蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)可考慮作為MDR逆轉(zhuǎn)劑作用靶點(diǎn)，可從天然藥物篩選合適結(jié)構(gòu)母體。

細(xì)胞在氧化應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生過(guò)量ROS，ROS也參與MDR形成。ROS可同時(shí)激活ERK，JNK和P38MAPK信號(hào)通路，上調(diào)K562/ADR細(xì)胞中P-gp表達(dá)，使用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸后可顯著抑制P-gp表達(dá)水平，且效果優(yōu)于MAPK抑制劑［51］。這一發(fā)現(xiàn)提示可開發(fā)抗氧化劑從而達(dá)到逆轉(zhuǎn)MDR的目的。

2.3 PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控作用

PI3K/AKT通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能。生長(zhǎng)因子與細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合，活化PI3K，活化的PI3K將二磷酸肌醇轉(zhuǎn)化成三磷酸肌醇，作用于磷酸肌醇依賴蛋白激酶（phosphoinositide-dependent protein kinase，PDK）使其具有活性，活化的PDK通過(guò)PH結(jié)構(gòu)區(qū)使與細(xì)胞膜上三磷酸肌醇緊密結(jié)合的AKT磷酸化，活化的AKT轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)［52-53］。

研究發(fā)現(xiàn)，IκB作為PI3K/AKT信號(hào)通路的下游蛋白，在該信號(hào)通路激活后磷酸化增加，導(dǎo)致進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB增多，繼而激活轉(zhuǎn)錄，P-gp表達(dá)增加［54］。HOX基因家族（homeotic gene）的成員HOXB4與人白血病的發(fā)生、發(fā)展、不良預(yù)后和耐藥性有關(guān)，HOXB4的高表達(dá)可激活PI3K/AKT信號(hào)通路，上調(diào)P-gp、MRP1和BCRP蛋白表達(dá)，增加抗癌藥物的外排作用［55］。在耐藥人慢性髓系白血病細(xì)胞株K562/ADR中，細(xì)胞PI3K/AKT途徑被激活，P-gp含量增加，導(dǎo)致化療藥物作用不佳，白藜蘆醇可通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，減少AKT磷酸化從而下調(diào)P-gp表達(dá)，且作用效果與特異性抑制劑LY294002相似［56］。PI3K/AKT途徑除可在基因水平調(diào)控MDR相關(guān)蛋白外，還可影響其在細(xì)胞膜上定位。BCRP在細(xì)胞表面的相對(duì)表達(dá)受到PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)且在極化細(xì)胞中呈正相關(guān)，AKT活性的改變可能通過(guò)影響B(tài)CRP在細(xì)胞膜上定位而影響B(tài)CRP底物的外排［57］。

2.4 Shh信號(hào)通路對(duì)相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控作用

Shh是機(jī)體發(fā)育過(guò)程中重要的分泌蛋白，其在腦和脊髓發(fā)育以及下丘腦的神經(jīng)發(fā)生中起著很好的作用［58］。Shh信號(hào)通路已被證明與癌細(xì)胞對(duì)化療藥物抵抗有關(guān)［59］?？缒な荏w蛋白-碎片蛋白（patched，PTCH）在無(wú)Shh配體的情況下抑制跨膜信號(hào)蛋白-潤(rùn)滑蛋白（Smoothened，Smo）的活性，作為該途徑的效應(yīng)子起作用的轉(zhuǎn)錄因子Gli被蛋白水解加工成Gli阻遏物形式，使得Shh靶基因關(guān)閉。當(dāng)Shh配體與PTCH-1結(jié)合后，PTCH-1從細(xì)胞表面移出，Smo蛋白磷酸化激活Shh信號(hào)傳導(dǎo)途徑，Gli阻遏物加工被阻斷，轉(zhuǎn)錄因子Gli活化，激活靶基因的表達(dá)［60-61］。在抗多柔比星人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，Shh信號(hào)通路被激活，P-gp和BCRP蛋白表達(dá)上調(diào)，表明Mdr1和ABCG2基因可能為該通路的下游靶基因［62］。在多發(fā)性骨髓瘤抗性細(xì)胞系RPMI 8226/R細(xì)胞中，Shh，Smo和Gli2的表達(dá)顯著增強(qiáng)，在使用Gli2轉(zhuǎn)錄抑制劑GANT61后，Gli2的表達(dá)顯著下降，細(xì)胞對(duì)多柔比星敏感性增強(qiáng)，耐藥指數(shù)由5.51降至1.69［63］。在該通路中Smo和Gli有成為MDR逆轉(zhuǎn)劑作用位點(diǎn)的可能，開發(fā)這2個(gè)位點(diǎn)的單一或雙位點(diǎn)抑制劑可下調(diào)Shh信號(hào)通路對(duì)MDR相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控作用。

2.5 其他信號(hào)通路對(duì)相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控作用

在細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞損傷/應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的Notch信號(hào)通路也參與了腫瘤MDR形成。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中該信號(hào)通路由Notch基因、Notch受體、Notch配體和C啟動(dòng)結(jié)合因子1（C promoter binding factor 1，CBF1）組成。當(dāng)Notch受體與配體結(jié)合后，notch胞內(nèi)域（notch intracellular domain，NICD）被激活，經(jīng)Notch活化/解聚素金屬蛋白酶 17（a disintegrin and metalloprotease 17，ADAM17）剪切，從細(xì)胞膜解離并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與CBF1結(jié)合形成NICD-CBF1復(fù)合體，NICD與CBF1蛋白的結(jié)合使CBF1蛋白由轉(zhuǎn)錄抑制物轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄激活物，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄［64-65］。異常Notch表達(dá)有助于各種惡性腫瘤的發(fā)展，降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。在原發(fā)性肝癌中，Notch信號(hào)的激活使得細(xì)胞對(duì)化療藥物索拉非尼、依托泊苷和紫杉醇敏感性降低，在使用Notch活化/裂解酶ADAM17抑制劑后，增強(qiáng)了索拉非尼在荷瘤裸鼠模型中抑制腫瘤生長(zhǎng)作用［66］。新近研究發(fā)現(xiàn)，Notch1參與了肺腺癌MDR產(chǎn)生，其作用機(jī)制可能是通過(guò)Notch1/AP-1/miR-451/MDR1信號(hào)軸影響肺腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性［67］。綜上，在Notch信號(hào)通路中，ADAM17可作為抑制劑開發(fā)的潛在作用靶點(diǎn)。

MRP2受核因子E2相關(guān)因子2（nuclear erythroid-2 related factor-2，Nrf-2）和抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）調(diào)控。在正常生理狀態(tài)下Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）結(jié)合處于非活性狀態(tài)，以維持在生理狀態(tài)下Nrf2的低表達(dá)與轉(zhuǎn)錄活性。在低氧刺激下，多種蛋白激酶（如p38和p53）可直接誘導(dǎo)Nrf2磷酸化或修飾Keap1的半胱氨酸殘基使其構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致Nrf2與Keap1解離而活化?；罨腘rf2進(jìn)入細(xì)胞核與ARE結(jié)合，啟動(dòng)ARE下游的MRP2的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。在小鼠MRP2基因5’端發(fā)現(xiàn)2個(gè)ARE結(jié)合區(qū)域，即ARE-1（-95～-85）和ARE-2（-1391～-1381），凝膠遷移和超遷移測(cè)定表明Nrf2蛋白復(fù)合物優(yōu)先結(jié)合ARE-1序列［68-69］。而腫瘤細(xì)胞中通常存在微低氧環(huán)境，在一定程度上可激活Nrf2信號(hào)通路，誘導(dǎo)MDR發(fā)生。

在人胎盤細(xì)胞中，環(huán)加氧酶2/前列腺素E2/E-前列腺素受體信號(hào)通路的激活可改變ABCB1和ABCG2基因的表達(dá)。前列腺素E2是環(huán)加氧酶2的主要產(chǎn)物，可通過(guò)位于胎盤的前列腺受體1和3上調(diào)BCRP的表達(dá)。有趣的是前列腺素E2可上調(diào)MDR1轉(zhuǎn)錄，但對(duì)P-gp的表達(dá)和功能并無(wú)影響［70］。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

成功的MDR逆轉(zhuǎn)劑應(yīng)具有良好的體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，較小的毒副作用，并可同時(shí)阻斷多條信號(hào)通路以達(dá)到下調(diào)多種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的目的。同時(shí)阻斷多條信號(hào)通路有2種策略，一是找到各信號(hào)通路相互之間的調(diào)控節(jié)點(diǎn)，如NF-κB，AP-1，c-Jun和AKT等，開發(fā)對(duì)應(yīng)的抑制劑。二是開發(fā)多位點(diǎn)抑制劑，同時(shí)抑制多個(gè)位點(diǎn)，阻斷各位點(diǎn)介導(dǎo)的信號(hào)通路。

P-gp，BCRP和MRP的表達(dá)均受到多條信號(hào)通路調(diào)節(jié)，且不同信號(hào)通路之間存在相互影響。程序性細(xì)胞死亡配體1是在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的免疫抑制分子，通過(guò)與T細(xì)胞上的程序性細(xì)胞死亡受體1結(jié)合，同時(shí)激活PI3K/AKT和MAPK/ERK途徑，上調(diào)P-gp表達(dá)［71］。血管生成素樣蛋白4不僅可同時(shí)激活PI3K/AKT，NF-κB和MEK/ERK途徑上的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)從而上調(diào)P-gp，BCRP和MRP基因表達(dá)，還可提高處于上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化期癌細(xì)胞中ATP供應(yīng)以增強(qiáng)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白外排能力［72］。IL-6和TNF-α等多種細(xì)胞因子都可激活MDR相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的信號(hào)通路，往往可上調(diào)上述3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)，而轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)增加后又可促進(jìn)某些炎癥因子分泌，如MRP1通過(guò)谷胱甘肽化修飾IL-1β增加其分泌，形成正反饋調(diào)節(jié)，加重疾病的發(fā)展［73］。可根據(jù)這一特點(diǎn)開發(fā)上游刺激因子抑制劑，阻斷信號(hào)通路激活，從而下調(diào)相關(guān)基因表達(dá)，達(dá)到逆轉(zhuǎn)MDR的目的。除此之外，NF-κB，AP-1，c-Jun和AKT等是多條信號(hào)通路的調(diào)控節(jié)點(diǎn)，可開發(fā)下游響應(yīng)因子抑制劑，阻斷其與目的基因結(jié)合。兩者均可通過(guò)單一位點(diǎn)抑制達(dá)到阻斷多條信號(hào)通路效果，從而降低MDR逆轉(zhuǎn)劑的開發(fā)難度。

近年來(lái)，中藥成分對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制作用成為研究熱點(diǎn)。原花青素是一種類黃酮類化合物，可能通過(guò)抑制JNK，p38，ERK1/2和NF-κB多條信號(hào)通路下調(diào)P-gp的表達(dá)［74］。黃芩素可能通過(guò)抑制P38 MAPK和NF-κB信號(hào)通路來(lái)逆轉(zhuǎn)BCRP介導(dǎo)的MCF-7/MX細(xì)胞的MDR［75］。半枝蓮的乙醇提取物可能通過(guò)抑制PI3K/AKT通路從而逆轉(zhuǎn)結(jié)腸直腸癌的化療耐藥性［76］。中藥多成分、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)與MDR機(jī)制的復(fù)雜性相契合，因此，對(duì)中藥成分進(jìn)行深入研究有助于開發(fā)多效抑制劑。

研究MDR相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有助于研發(fā)更加高效的調(diào)節(jié)劑，以達(dá)到增加藥物在病變細(xì)胞中分布與累積，增強(qiáng)藥物療效逆轉(zhuǎn)MDR的目的。但ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在正常生理狀態(tài)下具有維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)，保護(hù)機(jī)體免受內(nèi)源性或外源性有毒物質(zhì)損害的作用，如何在增強(qiáng)調(diào)節(jié)劑逆轉(zhuǎn)MDR的同時(shí)，降低其對(duì)機(jī)體穩(wěn)態(tài)造成的影響，找到兩者的平衡點(diǎn)，尚需深入研究。