齊睿娟，孫桂波，侯 睿，高 源，費(fèi)巧玲，韓宜芯，周 鴻，齊 云

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.中國中醫(yī)科學(xué)研究院西苑醫(yī)院老年病中心，北京 100091）

燈盞花素（breviscapine，BS）是從菊科植物短葶飛蓬〔Erigeron breviscapus（Vant.）Hand.-Mazz.〕干燥全草中提取出的黃酮類成分，其中含量最高的是燈盞乙素。由于其在治療心腦血管疾病方面有確切的療效，已被開發(fā)為片劑、顆粒劑、注射劑和注射粉針劑等多種劑型應(yīng)用于臨床［1］，最主要適應(yīng)癥是冠心病、心絞痛和腦缺血等。據(jù)報(bào)道，BS中幾種黃酮生物利用度極低，因此其注射劑的臨床療效更為顯著［2］。近幾年，臨床上除將BS用于治療缺血性疾病外，也將其用于治療與炎癥密切相關(guān)的疾病。研究表明，BS均可降低缺血再灌注損傷和腦損傷大鼠腦組織中炎癥因子如白細(xì)胞介素6（interleu?kin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis fac?tor-α，TNF-α）的水平［3-5］。BS對脂多糖（lipopoly?saccharides，LPS）誘導(dǎo)的膿毒癥性急性肺損傷［6］和腎損傷［7］模型大鼠肺、腎組織內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、TNF-α和IL-1β均有明顯抑制作用，并可改善肺、腎組織損傷。不僅如此，BS還能通過抑制炎性凋亡及減少活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生，改善CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷［8］。這些研究結(jié)果拓寬了對BS通過改善缺血器官的供血、抗脂質(zhì)過氧化、清除自由基并減輕細(xì)胞凋亡等保護(hù)缺血器官的認(rèn)識［9］，提示其可能具有直接的抗炎和抗氧化作用。

LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要致病成分，是巨噬細(xì)胞等細(xì)胞膜上Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）的配體，通過TLR4轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號可活化巨噬細(xì)胞并產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)和ROS［10］。LPS活化的巨噬細(xì)胞模型主要用于考察受試物對TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞內(nèi)、激活NF-κB和轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白1（activator protein-1，AP-1）產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)的作用，是評價(jià)抗炎藥物最經(jīng)典的體外模型。鑒于BS在炎癥疾病，包括在LPS誘導(dǎo)膿毒癥中的使用，本研究采用LPS活化巨噬細(xì)胞模型和致內(nèi)毒素血癥小鼠模型觀察BS注射液（BS injection，BSI）的抗炎作用及對巨噬細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)，以期闡釋BSI在炎癥疾病中的應(yīng)用價(jià)值，為臨床合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞、藥物、試劑和主要儀器

健康雄性ICR小鼠，20～23 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號SCXK（京）2016-0006。小鼠常規(guī)飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號為SYXK（京）2017-0020，室溫20～25℃，濕度55%～70%，12/12 h光照/黑暗，自由飲水?dāng)z食。

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購自美國ATCC細(xì)胞庫。RAW264.7細(xì)胞用含10%（V/V）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d傳代1次。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

BSI（國藥準(zhǔn)字 Z20053907，批號 2014090H，含燈盞乙素96.6%），購自昆明龍津藥業(yè)股份有限公司，預(yù)先用無菌生理鹽水配制成濃度為10 g·L-1的儲(chǔ)備液，用時(shí)稀釋。

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；LPS、光澤精（lucigenin）、磺胺和N-1-萘乙二胺基二鹽酸鹽購自美國Sigma-Aldrich公司；還原型輔酶二鈉（NADHNa2）和吩嗪二甲基硫酸鹽（PMS）購自美國Fluka公司；氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）購自上海前進(jìn)試劑廠；EDTA·2H2O購自美國Bio Basic公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）購自美國Amresco公司；亮肽素（leupeptin）購自瑞士Roche公司；L-012探針購自日本和光純藥株式會(huì)社；JC-1線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ATP檢測試劑盒購自北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司；小鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子（mouse colony-stimulating factor，M-CSF）購自北京義翹神州科技有限公司；小鼠TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒購自美國Biolegend公司。

Napco 5410型二氧化碳孵箱購自美國NAPCO公司；Multiskan Ascent酶標(biāo)儀購自美國Thermo Electron公司；Infinite M1000微孔板檢測系統(tǒng)購自瑞士Tecan公司；微孔板恒溫振蕩器購自杭州奧盛儀器有限公司；雷磁PHS-3B型精密pH計(jì)購自上海精密科學(xué)儀器有限公司；LD5-2A離心機(jī)購自北京醫(yī)用離心機(jī)廠；細(xì)胞培養(yǎng)板和酶標(biāo)板購自美國Corning公司。

1.2 小鼠髓源巨噬細(xì)胞的制備

小鼠髓源巨噬細(xì)胞的制備參考文獻(xiàn)［11］。將小鼠處死取股骨，用DMEM培養(yǎng)基沖洗，過濾骨渣并除紅細(xì)胞后離心，以完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。加入終濃度為100 μg·L-1的M-CSF，分化培養(yǎng)5 d。其間每24 h補(bǔ)充終濃度為100 μg·L-1的M-CSF，第6～9天分化好的細(xì)胞（由不貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁細(xì)胞）用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法測定巨噬細(xì)胞存活率［12］

取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞以每孔2×105接種于96孔板中，加入BSI 6.25～400 mg·L-1（終濃度），細(xì)胞對照組加等體積培養(yǎng)基，本底組加等體積培養(yǎng)基代替細(xì)胞懸液（調(diào)零孔）。37℃孵育20 h后，加入MTT 20 μL（5 g·L-1），37℃繼續(xù)孵育4 h，吸除上清，加入DMSO 100 μL，振蕩10 min，在540 nm處測吸光度值（A540nm）。細(xì)胞存活率（%）=給藥組A540nm/細(xì)胞對照組A540nm×100%。

1.4 LPS活化巨噬細(xì)胞體外模型的制備及上清中炎癥因子的測定［12］

取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞按每孔2×105接種于96孔板，或小鼠髓源巨噬細(xì)胞按每孔6×105接種于48孔板；模型組加入LPS（終濃度40 μg·L-1），BSI組加入LPS（40 μg·L-1）和BSI（終濃度1.5625～50 mg·L-1），對照組用等體積培養(yǎng)基替代BSI和LPS，于37℃孵育24h后取上清，Griess法測定上清中NO2-的含量，以代表NO分泌水平，按照ELISA試劑盒說明書測定TNF-α和IL-6水平。

1.5 LPS致內(nèi)毒素血癥小鼠模型的制備及血清中炎癥因子的測定［13］

將雄性ICR小鼠隨機(jī)分為5組：正常對照組、模型對照組和模型+BSI 2.5，5和10 mg·kg-1組，每組8只。除正常和模型對照組外，其余各組小鼠一次性ip給予BSI，正常和模型對照組給予等量生理鹽水。給予BSI 0.5 h后，模型對照組和模型+BSI組小鼠尾靜脈注射LPS 5 mg·kg-1，正常對照組給予等量生理鹽水。給予LPS后3 h，各組小鼠眼球取血，4℃靜置過夜，4℃下1600×g離心10 min，收集血清備用。

采用改良的Griess法［14］測定血清中NO。將氯化釩（VCl3）溶于1 mol·L-1HCl中，與待測血清按1∶1比例混合，室溫避光反應(yīng)30 min。按原血清體積與混合液〔甲醇∶乙醚=3∶1（V/V）〕1∶9比例進(jìn)行混合，于4℃靜置過夜。4℃條件下1600×g離心10 min，取上清液與Griess試劑等體積混合，室溫振蕩孵育5 min，測定A540nm。以亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定其亞硝酸鹽含量。血清中TNF-α和IL-6含量按照ELISA試劑盒說明書測定。

1.6 RAW264.7細(xì)胞ROS，MMP和ATP水平的測定

取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞按每孔2×105（ROS）或3×106（MMP和ATP）分別接種于96孔板或48孔板，模型組加入LPS（終濃度40 μg·L-1），BSI組給予LPS（40 μg·L-1）和BSI（終濃度1.5625～50 mg·L-1），細(xì)胞對照組用等體積培養(yǎng)基替代BSI和LPS。37℃孵育24 h后，L-012熒光染色法測定細(xì)胞內(nèi)ROS濃度［15］，JC-1熒光染色法檢測細(xì)胞內(nèi)MMP水平［16］，熒光素酶催化底物熒光素發(fā)光反應(yīng)檢測RAW264.7胞內(nèi)ATP水平［17］。

1.7 NADH-PMS體系NBT法測定超氧陰離子清除能力［18］

用PBS 0.1 mol·L-1（pH7.4）稀釋BSI至終濃度為1.5625～ 50 mg·L-1，按每孔50 μL加入96孔酶標(biāo)板，陰性對照組加等體積PBS代替BSI。依次加入 150 μmol·L-1PMS 溶液、1.2 mmol·L-1NADH?Na2溶液和360 μmol·L-1NBT溶液各50 μL（本底組以等體積0.1 mol·L-1PBS代替），在微型振蕩器上振蕩30 s，室溫反應(yīng)5 min，在酶標(biāo)儀540 nm處測A540nm。

1.8 化學(xué)發(fā)光法測定RAW264.7細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶活性［19］

取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，以每孔3×106細(xì)胞接種于12孔板中，模型組加入LPS（終濃度40 μg·L-1），BSI組給予LPS（40 μg·L-1）和BSI（終濃度1.5625～50 mg·L-1），細(xì)胞對照組用等體積培養(yǎng)基替代BSI和LPS。37℃繼續(xù)孵育6 h，冰上超聲破碎細(xì)胞得到溶胞液。加入NADPH（10 mmol·L-1）10 μL，室溫避光反應(yīng)15 min，加5 mmol·L-1光澤精80 μL溶液，混勻后立即測定化學(xué)發(fā)光值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。IC50通過量效曲線回歸方程計(jì)算。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BSI對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7存活率的影響

MTT法測定結(jié)果（圖1）表明，BSI在6.25～100 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，對RAW264.7細(xì)胞存活無明顯影響；BSI 200和400 mg·L-1明顯抑制RAW264.7細(xì)胞存活（P＜0.01）。為此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)BSI的終濃度均＜100 mg·L-1。

Fig.1 Effect of breviscapine injection（BSI）on cell viability of RAW264.7 macrophages by MTT assay.The cells were incubated with BSI for 24 h.Cell viability（%）=A540 nmof BSI group/A540 nmof cell control group×100%.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.2 BSI對LPS活化RAW264.7巨噬細(xì)胞和小鼠髓源巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的作用

圖2A結(jié)果顯示，與細(xì)胞對照組比較，LPS孵育RAW264.7細(xì)胞24 h可顯著增加細(xì)胞上清中NO（以上清中NO2-含量反映），TNF-α和IL-6含量（P＜0.01）；BSI 25和50 mg·L-1組NO含量較LPS組顯著降低（P＜0.01）；BSI 1.5625～50 mg·L-1組TNF-α含量較LPS組無明顯變化，IL-6含量較LPS組明顯升高（P＜0.01）。BSI 1.5625～50 mg·L-1對小鼠髓源巨噬細(xì)胞上清NO，IL-6和TNF-α也無明顯的抑制作用（圖2B），與上述結(jié)果基本一致。提示BSI體外抗炎作用不明顯。

2.3 BSI對LPS誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥模型小鼠血清中炎癥因子的作用

圖3結(jié)果所示，LPS 5 mg·kg-1可顯著增加小鼠血清中NO，IL-6和TNF-α水平（P＜0.01），給予BSI 2.5，5和10 mg·kg-1對該模型小鼠血清中3種炎癥因子水平均無顯著影響，表明BSI體內(nèi)抗炎作用不明顯。

Fig.2 Effect of BSI on supernatant nitric oxide（NO），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin-6（IL-6）in lipo?polysaccharides（LPS）-primed RAW264.7 macrophages（A）and mouse bone marrow derived macrophages（B）.The cells were treated with BSI 1.5625-50 mg·L-1with or without LPS（40 μg·L-1）for 24 h.Nitrite level（A1 and B1）in the culture medium was measured by the Griess reaction.Supernatant TNF-α（A2 and B2）and IL-6（A3 and B3）levels were determined by ELISA.±s，n=3.＊＊P＜ 0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with LPS group.

Fig.3 Effect of BSI on serum NO（A），TNF-α（B）and IL-6（C）levels in LPS-induced endotoxemia mice.Mice were ip given BSI 30 min before LPS 5 mg·kg-1intravenous injection.Three hours after LPS challenge，the mice were sacrificed and the serum NO，TNF-α and IL-6 were measured.±s，n=8.＊＊P＜0.01，compared with normal control；#P＜0.05，compared with LPS group.

2.4 BSI對LPS活化RAW264.7巨噬細(xì)胞ROS，MMP和ATP水平的影響

如圖 4A 所示，LPS 40 μg·L-1可顯著升高RAW264.7細(xì) 胞 內(nèi) ROS 水 平（P＜0.01），BSI 1.5625～50 mg·L-1可顯著抑制LPS致細(xì)胞ROS水平的升高（P＜0.01），顯示出良好的抗氧化作用。

如圖4B 所示，LPS 40 μg·L-1處理RAW264.7細(xì)胞24 h，可使胞內(nèi)綠色/紅色熒光比值明顯升高（P＜0.01），提示此時(shí)細(xì)胞MMP發(fā)生了去極化；BSI 6.25～50 mg·L-1則能顯著減少綠色/紅色熒光比值（P＜0.01），提示BSI可有效減緩LPS誘導(dǎo)的MMP去極化作用。

圖4C 顯示，LPS 40 μg·L-1可致RAW264.7細(xì)胞內(nèi) ATP 含量明顯下降（P＜0.01），BSI 3.125～50 mg·L-1能顯著升高胞內(nèi)ATP含量（P＜0.01），提示BSI能有效對抗LPS所導(dǎo)致胞內(nèi)ATP下降。

Fig.4 Effect of BSI on levels of reactive oxygen species（ROS）（A），mitochondrial membrane potential（MMP）（B）and ATP（C）in LPS-primed RAW264.7 macrophages.See Fig.2 for the cell treatment.ROS，MMP and ATP were deter?mined by L-012 assay，JC-1 assay and firefly luciferase reaction，respectively.±s，n=3.＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with LPS group.

2.5 BSI對超氧陰離子的直接清除作用

圖5所示，BSI在3.125～ 50 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，具有明顯的直接清除超氧陰離子的作用，且呈良好的濃度效應(yīng)關(guān)系（R2=0.999，P＜0.05）。IC50為118.55 mg·L-1。

Fig.5 Effect of BSI on scavenging activity of super?oxide anion.The scavenging activity of BSI on superoxide anion was determined by NADH-NBT-PMS reaction.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control（0）group.

2.6 BSI對LPS活化RAW264.7細(xì)胞NADPH氧化酶活性的作用

圖6結(jié)果顯示，與細(xì)胞對照組比較，LPS可致RAW264.7細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶活性明顯增高（P＜0.01）；與LPS組比較，BSI則能顯著抑制LPS活化的NADPH活性（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.6 Effect of BSI on intracellular NADPH oxidase activity in LPS-primed RAW264.7 cells.See Fig.2 for the cell treatment.The NADPH oxidase activity was determined by chemiluminescence after six-hour cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with LPS group.

3 討論

臨床上BS主要用于治療卒中及其后遺癥、冠心病和心絞痛等疾病。近年其臨床應(yīng)用逐步擴(kuò)大，尤其是在一些與炎癥密切相關(guān)的病癥上應(yīng)用漸多，如骨性關(guān)節(jié)炎［20］、慢性阻塞性肺?。?1］、肺纖維化［22］、急性胰腺炎［23］、病毒性心肌炎［24］和慢性腎小球腎炎［25］等，或聯(lián)用或單用。據(jù)報(bào)道，鞘內(nèi)給予燈盞乙素（BSI中最主要成分），可明顯抑制甲醛誘導(dǎo)的大鼠炎癥疼痛反應(yīng)、脊髓NOS的表達(dá)及NO水平，顯示其可能的抗炎作用［26］。但由于炎癥種類繁多，所涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及細(xì)胞因子各異，BS對LPS誘導(dǎo)膿毒癥急性腎損傷的保護(hù)［7］等作用是通過抑制炎癥還是保護(hù)細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的均不甚清楚。

巨噬細(xì)胞活化是宿主防御致病微生物的關(guān)鍵過程，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)的開始和炎性介質(zhì)的釋放［27］。作為革蘭陰性菌壁的主要成分，LPS可與巨噬細(xì)胞膜上TLR4的識別結(jié)合，觸發(fā)下游信號接頭蛋白MyD88的募集，后者又引起一系列信號級聯(lián)反應(yīng)使得IκB激酶（inhibitory kappa B kinase，IKK）或絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的激活［28］。IKK使IκB發(fā)生磷酸化，進(jìn)而釋放轉(zhuǎn)錄因子如P65等入核，而MAPK包括P38，ERK1/2和JNK，激活后會(huì)使轉(zhuǎn)錄因子c-FOS等活化入核。核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)特異性序列結(jié)合，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，產(chǎn)生如iNOS，TNF-α和IL-6等促炎因子［29-30］?？寡姿幬锿峭ㄟ^抑制NF-κB/AP-1來發(fā)揮抗炎作用的。

在不影響細(xì)胞存活的濃度范圍內(nèi)，BSI對LPS活化巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6無抑制作用，提示其可能對NF-κB/AP-1信號通路無相應(yīng)的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，BSI在25和50 mg·L-1時(shí)對LPS活化的RAW264.7細(xì)胞上清中NO含量有抑制作用，但在原代巨噬細(xì)胞并未顯示該作用。再綜合BSI對該2種細(xì)胞TNF-α和IL-6分泌無抑制作用，推測BSI對TLR4信號通路無抑制作用。

值得一提的是，BSI在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，對LPS活化RAW264.7細(xì)胞（不包括原代巨噬細(xì)胞）上清中IL-6，不僅無抑制作用，反而可促進(jìn)其生成。但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)并不支持BSI升高LPS活化RAW264.7細(xì)胞IL-6結(jié)果?？傊?，無論是體外LPS活化巨噬細(xì)胞模型，還是體內(nèi)內(nèi)毒素血癥模型，BSI均未顯示出其抗炎作用，此結(jié)果3個(gè)模型是一致的。

在LPS活化細(xì)胞膜TLR4通路轉(zhuǎn)導(dǎo)炎癥信號的同時(shí)，它還能活化細(xì)胞膜上NADPH氧化酶等引起胞內(nèi)ROS增加［31］。BSI抗炎作用不明顯，臨床卻將其用于與炎癥相關(guān)的病癥，包括膿毒癥，推測BSI在這些病癥中發(fā)揮了抗炎以外的作用。考慮到BS在治療缺血性疾病中突出的抗氧化作用，推測其有可能通過抗氧化來實(shí)現(xiàn)對炎癥相關(guān)細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等）的保護(hù)作用。

LPS刺激RAW264.7細(xì)胞除可引起經(jīng)典的炎癥因子釋放以外，還可引起細(xì)胞的其他損傷，如MMP水平的下降和胞內(nèi)ATP被大量耗損等。細(xì)胞內(nèi)的這些病理現(xiàn)象主要源于LPS能誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。對此，BSI既能直接清除超氧陰離子，又能抑制NADPH氧化酶以減少ROS的生成，通過抑制胞內(nèi)ROS的升高來改善因ROS引起的MMP下降和ATP耗損以達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用。

綜上，BS雖無明顯抗炎作用，卻在炎癥相關(guān)疾病中有應(yīng)用，這可能與其阻止炎癥損傷所致細(xì)胞內(nèi)ROS升高、消除因ROS升高引起的MMP下降和ATP耗損，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞（組織）作用有關(guān)。與本研究一致的是，近年來臨床也越來越多地將BS聯(lián)合抗炎藥物用于炎癥相關(guān)疾?。?-4］。本研究可能為擴(kuò)大BS的臨床適應(yīng)癥范圍以及指導(dǎo)其在炎癥相關(guān)疾病的臨床使用方面提供實(shí)驗(yàn)支撐。