劉 蔚，李椿方，石全波

（北京市工業(yè)技師學(xué)院環(huán)境保護(hù)與生物制藥系，北京 100124）

煙草特有亞硝胺（tobacco-specific nitrosa?mines，TSNA）是公認(rèn)的煙草中致癌性極強(qiáng)的化合物［1-3］，其中4-（N-甲基-亞硝胺）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮〔4-（methylnitrosamino）-1-（3-pyridyl）-1-buta?none，NNK〕和N′-亞硝基去甲煙堿（N′-nitrosonor?nicotine，NNN）對(duì)人的致癌性證據(jù)充分，被國(guó)際癌癥研究署（International Agency for Research on Cancer，IARC）列為1類致癌物［4］。另外2種化合物N′-亞硝基新煙草堿（N′-nitrosoanatabine，NAT）和 N′-亞硝基假木賊煙堿（N′-nitrosoanabasine，NAB）由于弱致癌性，被IARC列為3類致癌物［4］，甚至有報(bào)道NAT無(wú)致癌性［1］。煙堿是煙草中的主要生物堿，是導(dǎo)致吸煙成癮的主要化學(xué)成分。生物堿是TSNA的前體物，煙堿是NNK和NNN的共有前體物，去甲煙堿是NNN的主要前體物，新煙堿是NAT的主要前體物，假木賊堿是NAB的主要前體物。盡管這些化合物之間分子結(jié)構(gòu)相似，但它們?cè)诩?xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶催化代謝反應(yīng)中的交互作用機(jī)制不甚清楚。

已有研究表明，多種CYP450酶，如CYP450 2A13，2A6，2B6，1A1，1A2，2D6，2E1和3A4，參與了TSNA和煙堿的代謝［1，5］。其中，有不同化合物被同一種酶催化，也有同一種化合物被不同酶催化［5-7］。如 von Weymarn 等［8］研究表明，CYP450 2A13可同時(shí)催化NNK和煙堿的代謝。盡管CYP450酶催化單一化合物的代謝反應(yīng)已有研究，但對(duì)混合物的代謝反應(yīng)研究很少，體內(nèi)和體外反應(yīng)條件下的交互作用機(jī)制報(bào)道不多。事實(shí)上，煙堿和TSNA是作為整體煙氣中的一部分?jǐn)z入吸煙者體內(nèi)，在復(fù)雜基質(zhì)條件下不同煙氣成分存在交互作用（相加、協(xié)同或拮抗）［3］。體外研究報(bào)道，煙堿代謝產(chǎn)物對(duì)CYP450酶代謝NNK產(chǎn)生抑制作用［9］。目前，關(guān)于煙堿對(duì)CYP450酶介導(dǎo)的NNK和NNN代謝影響的報(bào)道較少。另外，不同CYP450酶催化NNK和NNN反應(yīng)的效率不同，然而未見(jiàn)關(guān)于反應(yīng)效率比較的報(bào)道。

NNK和NNN代謝過(guò)程中可產(chǎn)生活性較強(qiáng)的中間產(chǎn)物，這些產(chǎn)物會(huì)與DNA的堿基對(duì)進(jìn)行加合反應(yīng)，形成DNA加合物，導(dǎo)致基因突變，最終可能引起癌變。因此，NNK和NNN只有被CYP450酶激活代謝時(shí)，才會(huì)產(chǎn)生致癌作用。鑒于CYP450酶是NNK和NNN發(fā)揮強(qiáng)致癌效應(yīng)的前提條件，有必要研究不同CYP450酶催化NNK和NNN的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。同時(shí)，需要研究分子結(jié)構(gòu)相似的煙堿是否會(huì)對(duì)CYP450酶代謝NNK和NNN產(chǎn)生影響，從而為體內(nèi)高濃度煙堿是否會(huì)抑制NNK和NNN的代謝提供方向，最終為研究吸煙者體內(nèi)高濃度煙堿是否會(huì)拮抗TSNA的致癌性提供線索。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

標(biāo)準(zhǔn)品〔NNK、NNK、4-羰基-4-（3-吡啶基）-丁醛（4-oxo-4-（3-pyridyl）butanal，OPB）、4-羥基-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（4-hydroxy-1-（3-pyridyl）-1-buta?none，HPB）、4-羰基-4-（3-基吡啶）-氧代丁酸（4-oxo-4-（3-pyridyl）butanoic acid，OPBA）、4-羥基-4-（3-吡啶基）-氧代丁酸（4-hydroxy-4-（3-pyridyl）butanoic acid，HA）和煙堿〕及其各自內(nèi)標(biāo)（加拿大Toronto Research Chemicals公司），重組人源CYP4502A13，2A6、2D6和2E1（英國(guó)Cypex Ltd.公司），重組人源CYP4501A1，1A2、2B6和3A4（美國(guó)Cayman化學(xué)公司），煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二鈉鹽（triphosphopyridine nucleotide disodium salt trihydrate，NADP+）（美國(guó)Amresco LLC公司），D-葡萄糖-6-磷酸二鈉（D-glucose 6-phosphate disodium salt，G6P）（日本 Wako Pure Chemical Industries Ltd.公司），葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phos?phate dehydrogenase，G6PDH）（日本 Wako Pure Chemical Industries Ltd.公司），其他色譜純?cè)噭绹?guó)Sigma-Aldrich Inc.公司）。液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（AB SCIEX QTRAP?5500，美國(guó)Applied Biosystems公司）。

1.2 不同CYP450酶對(duì)NNK和NNN的代謝

按Jalas等［10］方法，進(jìn)行NNK和NNN代謝穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)溶液中各成分及其終濃度見(jiàn)表1，于pH 7.4，37℃孵育30 min。反應(yīng)完成后，加入等體積4℃預(yù)冷乙腈中止反應(yīng)。采用液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)NNK和NNN水平，并以此為依據(jù)選擇對(duì)NNK和NNN催化效率最高的CYP450酶。在酶空白對(duì)照組中，以去離子水代替相應(yīng)的CYP450酶。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了針對(duì)CYP4502A13酶的底物陽(yáng)性對(duì)照組，采用香豆素作為底物，檢測(cè)底物和產(chǎn)物（7-羥基-4-甲基香豆素）含量，以保證CYP450酶的活性。由于不同的酶針對(duì)不同的最佳底物，本實(shí)驗(yàn)無(wú)法對(duì)所有的酶進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)基于CYP4502A13酶，因此僅對(duì)該酶進(jìn)行了陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.3 NNK和NNN代謝產(chǎn)物檢測(cè)

按1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果，CYP4502A13催化NNK和NNN代謝的效率最高，逐將CYP4502A13作為后續(xù)研究的催化酶。代謝產(chǎn)物鑒定實(shí)驗(yàn)中，除了CYP4502A13 的濃度設(shè)定為10～200 pmol·L-1，其他反應(yīng)條件同表1。反應(yīng)結(jié)束后，采用液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀定量檢測(cè)NNK和NNN的代謝產(chǎn)物，并比較其差異。

Tab.1 Reaction conditions for different cytochrome P450（CYP450）enzymes

1.4 煙堿對(duì)NNK和NNN體外代謝反應(yīng)抑制的測(cè)定

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究，CYP4502A13酶促代謝NNK和NNN的初速度反應(yīng)時(shí)間為5min，初速度反應(yīng)的CYP4502A13濃度為12.5 pmol·L-1，抑制反應(yīng)中的底物NNK和NNN終濃度設(shè)定為1～100μmol·L-1，煙堿及其他成分終濃度見(jiàn)表2，反應(yīng)條件為pH 7.4，37℃孵育5 min。

1.5 定量檢測(cè)NNK和NNN及其代謝產(chǎn)物的方法

參考Zhang等［11］方法定量檢測(cè)NNK和NNN。檢測(cè)NNK和NNN代謝產(chǎn)物的方法如下：以乙腈將酶促反應(yīng)溶液稀釋至所需檢測(cè)濃度，并保證上機(jī)樣品中乙腈比例≥90%。采用Waters Atlantis HILIC silica 液相色譜柱（2.1 mm×150 mm，id 5.0 μm）實(shí)現(xiàn)代謝產(chǎn)物的良好分離（圖1），于40℃醋酸銨（10 mmol·L-1）∶乙腈=5∶95的環(huán)境中平衡，梯度程序（時(shí)間，醋酸銨%）為：① 0～2 min，5%～15%；② 2～6 min，15%～25%；③ 6～6.1 min，25%～5%；④ 6.1～9 min，95%。流速：0.5 mL·min-1，進(jìn)樣體積10 μL。質(zhì)譜采用多反應(yīng)掃描模式（表3）。

Tab.2 Conditions of inhibitory reactions induced by nicotine

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用美國(guó)Systat公司的Sigma Plot kinetics program軟件進(jìn)行Km和Vmax值的計(jì)算，采用該軟件中非線性回歸計(jì)算Ki值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)隨機(jī)分布于95%置信區(qū)間，且符合競(jìng)爭(zhēng)性抑制模型V0=Vmax［S］/（Km（1+（［I］/Ki））+［S］），R2≥0.98，則可認(rèn)為該反應(yīng)屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制。其他數(shù)據(jù)采用SPSS v17.0軟件單因素方差分析判定顯著性水平差異，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同CYP450酶催化NNK和NNN的比較

如表4所示，相對(duì)于酶空白對(duì)照組，CYP450 2A13與底物共孵育后，NNK濃度下降58.4%，NNN濃度下降41.3%（P＜0.01）。相對(duì)于酶空白對(duì)照組，CYP4502A6與底物共孵育后，NNN濃度降低37.4%（P＜0.01），而NNK濃度無(wú)明顯變化。從表4中可以看出，相對(duì)于酶空白對(duì)照組，CYP4501A2，2B6和2E1對(duì)NNK僅略有降低，但遠(yuǎn)低于CYP4502A13。由此可以看出，在同等反應(yīng)條件下，CYP4502A13對(duì)NNK和NNN降低率最大，催化效率最高，為此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇CYP4502A13作為NNK和NNN的體外代謝反應(yīng)的催化酶。

Fig.1 Chromatograms of 4-oxo-4-（3-pyridyl）butanal（OPB），4-hydroxy-1-（3-pyridyl）-1-butanone（HPB），4-oxo-4-（3-pyridyl）butanoic acid（OPBA）and 4-hydroxy-4-（3-pyridyl）butanoic acid（HA）in CYP450 enzyme-catalyzed reaction sample.cps：counts per seconds.

Tab.3 Multiple reaction monitoring analysis of metabolic products and their respective internal standard

Tab.4 Changes of NNK and NNN levels with different CYP450 enzymes

2.2 NNK和NNN代謝產(chǎn)物的比較

分別以NNK和NNN為反應(yīng)底物，采用HPLCMS/MS定量檢測(cè)CYP4502A13酶促反應(yīng)后的產(chǎn)物。如表5所示，在不同濃度CYP4502A13酶條件下，檢測(cè)了NNK酶促反應(yīng)的3種產(chǎn)物OPB，HPB和OPBA的濃度，檢測(cè)了NNN酶促反應(yīng)的3種產(chǎn)物HPB，HA和OPB的濃度。從表5也可以看出，HPB和OPB是NNK和NNN體外代謝的共有產(chǎn)物。同時(shí)HPB是2種底物代謝的主產(chǎn)物，OPBA和OPB分別是NNK和NNN代謝中最少的產(chǎn)物。比較NNK和NNN代謝，發(fā)現(xiàn)NNK代謝產(chǎn)物濃度遠(yuǎn)高于NNN，說(shuō)明CYP4502A13更容易催化NNK反應(yīng)。

2.3 NNK和NNN反應(yīng)的酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)

根據(jù)米氏方程，計(jì)算出CYP4502A13催化NNK和NNN反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。如表6所示，對(duì)產(chǎn)物HPB而言，NNK酶促反應(yīng)的Km值大于NNN，而Vmax值小于NNN；對(duì)產(chǎn)物OPB而言，NNK酶促反應(yīng)的Km值小于NNN，Vmax值大于NNN。上述結(jié)果表明，CYP4502A13代謝NNK更易生成OPB，而代謝NNN則更易生成HPB。

Tab.6 Kinetic parameters of enzymatic reaction of NNK and NNN

2.4 抑制反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

CYP4502A13催化NNK的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線和不同濃度抑制劑的抑制反應(yīng)曲線（圖2）表明，煙堿對(duì)CYP4502A13催化的NNK代謝反應(yīng)有一定的抑制作用，抑制劑濃度越高，對(duì)CYP4502A13的抑制效應(yīng)越明顯。將終濃度為10 μmol·L-1煙堿加入NNK反應(yīng)液中，生成OPB，HPB和OPBA的Km值相應(yīng)地增加到7.4，13.1和11.0 μmol·L-1，而Vmax值卻保持不變，由此說(shuō)明煙堿的抑制類型屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

Tab.5 Metabolic products of CYP4502A13-catalyzed NNK and NNN enzymatic reaction

對(duì)NNN而言，單獨(dú)底物的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線和加入抑制劑的酶促反應(yīng)曲線（圖3）表明，煙堿對(duì)CYP4502A13催化NNN的代謝反應(yīng)存在抑制作用，且抑制劑濃度越高，抑制作用越大。將終濃度5 μmol·L-1的煙堿加入NNN反應(yīng)液中，生成HPB，HA和OPB的Km值相應(yīng)地增加到35.46，16.51和28.19 μmol·L-1，而Vmax值保持不變，由此可以看出，與NNK的代謝抑制相似，煙堿對(duì)NNN的代謝抑制類型屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

Fig.2 Enzymatic reaction curves of NNK with CYP4502A13 with or without nicotine.The incubation conditions of the NNK enzyme reaction were shown in Tab.2.±s，n=5.

Fig.3 Enzymatic reaction curves of NNN with CYP4502A13 with or without nicotine.The incubation conditions of the NNK enzyme reaction were shown in Tab.2.±s，n=5.

3 討論

本研究采用人源重組CYP450酶進(jìn)行NNK和NNN的體外代謝研究，比較了不同CYP450酶2種致癌物的代謝差異，發(fā)現(xiàn)CYP4501A2，2A13，2B6和2E1可不同程度地代謝NNK，CYP4501A2，2A6，2A13和2E1可不同程度地代謝NNN。上述結(jié)果與Patten等［12］和Smith等［13-15］研究結(jié)果基本一致。Smith等通過(guò)HepG2細(xì)胞來(lái)源的CYP4501A2和人肺組織微粒體來(lái)源的CYP4502A6進(jìn)行NNK代謝研究，發(fā)現(xiàn)兩者是代謝NNK最為有效的Ⅰ相代謝酶。Patten等分別從病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、穩(wěn)定表達(dá)的CHO細(xì)胞和B淋巴母細(xì)胞中獲得CYP450酶，進(jìn)行NNK體外代謝實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CYP4502A6和3A4對(duì)NNK各個(gè)通路的代謝均有激活，而CYP4501A2，2E1和2D6僅激活了NNK的α-甲基羥基化代謝通路。Penman等［16］將CYP4502D6穩(wěn)定表達(dá)于人細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)NNK有選擇性代謝。另外，研究證實(shí)，人肝來(lái)源的CYP4501A2可催化NNK代謝反應(yīng)［14］，CYP4502E1和2A6可催化NNN代謝反應(yīng)［17］。最近的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)體系證實(shí)，在所有CYP450酶中，CYP4502A13是NNK代謝反應(yīng)中活性最高的一種酶［18-19］。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)體系也證明了CYP4502A13是催化NNK代謝反應(yīng)的高效酶，同時(shí)也是NNN代謝反應(yīng)的高效酶。當(dāng)然，也有部分研究結(jié)果不一致。如Smith等［13］以12個(gè)CYP450酶為研究對(duì)象，以HPB為檢測(cè)指標(biāo)時(shí)，發(fā)現(xiàn)CYP4501A2催化NNK生成HPB最多，而CYP4502A6，2B7，2E1，2F1和3A5僅代謝產(chǎn)生了較少的HPB。上述研究結(jié)果的不一致，除與CYP450酶的不同來(lái)源有關(guān)，也與采用的底物濃度不同相關(guān)。

考慮到煙堿在卷煙煙氣中的高釋放量，本研究選擇煙堿對(duì)2種典型煙草致癌物NNK和NNN進(jìn)行了酶促動(dòng)力學(xué)研究。結(jié)果顯示，煙堿可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制NNK和NNN的代謝激活。目前，已有部分研究支持本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。von Weymarn等［8］報(bào)道，煙堿在自身代謝轉(zhuǎn)化過(guò)程中，CYP4502A13和2A6參與煙堿代謝，而煙堿代謝后又導(dǎo)致該酶活性的失活，進(jìn)而減少了CYP450酶對(duì)NNK和NNN的代謝。關(guān)于β-二烯煙堿對(duì)CYP450酶的影響，Denton等［7］和Kramlinger等［20］的研究均證實(shí)了該化合物對(duì)CYP4502A6的抑制，從而認(rèn)為β-二烯煙堿間接影響了TSNA的代謝激活。Van Vleet等［21］研究NNK和N-二甲基亞硝胺的致突變作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)煙堿和可替寧（cotinine）可抑制CYP4502E1的活性，進(jìn)而影響了NNK和N-二甲基亞硝胺的致突變作用。Bao等［6］報(bào)道，煙堿和NNN可抑制NNK的代謝，并假設(shè)煙堿和NNN可作為CYP4502A13的底物。Ordonez等［9］進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)煙堿可通過(guò)抑制CYP450酶的催化活性，進(jìn)而降低NNK導(dǎo)致的DNA雙鏈斷裂。

綜上所述，本研究對(duì)CYP450酶體外代謝煙堿及亞硝化產(chǎn)物的交互作用進(jìn)行了研究，表明非致癌物煙堿對(duì)NNK和NNN的體外代謝有抑制作用，提示卷煙煙氣中的化學(xué)成分可通過(guò)抑制Ⅰ相生物代謝階段的CYP450酶活性，引起化學(xué)成分間的相互作用。