趙彤彤，趙微，王丹，趙國芬*，劉揚，張和平，包秋華

1(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018) 2(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018)

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是多種含有共軛雙鍵十八碳二烯酸的總稱，它具有多種營養(yǎng)和保健功能，如抗癌、抗動脈粥樣化和延緩機體免疫力衰退、減肥等[1-3]。目前合成CLA的方法主要有化學法和生物法2種?；瘜W法合成的CLA產(chǎn)品中各種異構體形式并存，而且產(chǎn)品還存在溶劑殘留問題[4]。生物法轉(zhuǎn)化CLA產(chǎn)物中具有生理活性的異構體形式含量較高，產(chǎn)品安全性較高。目前研究表明，一些瘤胃微生物、丙酸桿菌、乳酸菌和雙歧桿菌能夠?qū)営退?linoleic acid，LA)轉(zhuǎn)化為CLA[5]。相比于嚴格厭氧且生長較慢而難以用于大規(guī)模生產(chǎn)的瘤胃菌、具有致病性的痤瘡丙酸桿菌，乳酸菌具有易大規(guī)模培養(yǎng)、食品級微生物等優(yōu)點，所以利用乳酸菌轉(zhuǎn)化CLA已經(jīng)是當前的研究熱點[6-7]。

研究表明，大部分乳酸菌將LA轉(zhuǎn)化為CLA的通路是先將LA水合為10-羥基-順 12-十八碳烯酸(10-hydroxy-cis 12-octadecenoic acid,10-HOE)，后經(jīng)脫氫、雙鍵移位、水合、脫水等多步反應而轉(zhuǎn)化為CLA，需要脂肪酸水合酶(fatty acid hydratase,CLA-HY)、羥基脂肪酸脫氫酶(hydroxy fatty acid dehydrogenase,CLA-DH)與乙酰乙酸脫羧酶(fatty acid isomerase,CLA-DC)組成的亞油酸異構酶系共同參與代謝過程[8]。CLA-DH在亞油酸在乳酸菌的代謝中起著重要的作用，可以將10-HOE轉(zhuǎn)化為10-氧代-順-12-十八碳烯酸。很多羥基脂肪酸都可以作為良好底物被轉(zhuǎn)換為相應的氧代脂肪酸[9]，并且很多氧代脂肪酸也被發(fā)現(xiàn)有獨特的生理功能，例如10-氧代-順-12-十八碳烯酸激活過氧化物酶體增生激活受體(peroxisome proliferative activated receptor, PPARg)誘導脂肪細胞分化，13-氧代-9,11-十八碳二烯酸可以改善肥胖癥引起的血脂異常和肝脂肪變性等[10]。

圖1 部分乳酸菌中LA轉(zhuǎn)化為CLA的過程

Fig.1 The process of LA conversion to CLA inLactobacillus plantarum

內(nèi)蒙古是乳制品生產(chǎn)研發(fā)大省，植物乳桿菌P-8是源自內(nèi)蒙古烏拉特中旗的優(yōu)良發(fā)酵菌種，經(jīng)研究表明該菌具有產(chǎn)生CLA的能力，但產(chǎn)量較小且具體機制尚不清楚[11]。本研究對植物乳桿菌P-8中的羥基脂肪酸脫氫酶基因進行了克隆和生物信息學分析，并將其在大腸桿菌中表達，經(jīng)誘導表達后得到有活性的重組酶CLA-DH。為進一步研究植物乳桿菌P-8中羥基脂肪酸脫氫酶的性質(zhì)和功能提供了必要條件，為提高植物乳桿菌P-8轉(zhuǎn)化CLA的產(chǎn)量并將其應用于食品、保健品奠定了重要理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和載體質(zhì)粒

本實驗所用植物乳桿菌P-8和pET-28a(+) Vector由本實驗室保藏，大腸桿菌E.coliDH5α Chemically Competent Cell購自北京天根生化科技有限公司，大腸桿菌E.coliTransetta (DE3) Chemically Competent Cell購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 酶和試劑

本實驗所用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、T4連接酶均購自于北京全式金生物技術有限公司；高保真DNA聚合酶KOD plus購自Toyobo公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；亞油酸購自Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

利用Primer 5.0軟件，根據(jù)NCBI中已知的植物乳桿菌P-8的CLA-DH序列以及pET-28a(+)載體的多克隆位點，設計了1對特異性引物(表1)，由華大基因完成。

表1 引物序列

注：劃線部分為引入的酶切位點。

1.2.2CLA-DH基因的擴增與序列分析

以植物乳桿菌P-8基因組為模板用高保真KOD plus酶進行PCR擴增，PCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，50℃退火40 s，68℃延伸1 min，30個循環(huán)；68℃保溫10 min。產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，并將目的條帶切膠后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收，送往華大基因進行測序。測序結(jié)果使用Blast進行確認，使用DNAstar翻譯成氨基酸序列進行分析。使用Proparam對序列進行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的預測分析，使用Protscal進行蛋白質(zhì)親疏水性預測分析，使用TMHMM進行跨膜區(qū)預測分析，使用Net Phos3.1 Server進行磷酸化位點分析，使用PSLpred進行亞細胞定位分析，使用SOPMA和Predict Protein進行二級結(jié)構分析。

1.2.3 重組菌的構建

將純化后的PCR產(chǎn)物和pET-28a(+)質(zhì)粒分別通過EcoRⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，切膠回收后16 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α，涂布含50 μg/mL卡那霉素的LB平板進行篩選。挑取轉(zhuǎn)化子，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)菌液PCR和質(zhì)粒雙酶切驗證后,獲得重組質(zhì)粒pET-28a-DH。將重組質(zhì)粒pET-28a-DH轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliTransetta (DE3)，同時轉(zhuǎn)化pET-28a(+)空質(zhì)粒作為陰性對照，獲得重組菌E.coliTransetta/pET-28a-DH和對照菌E.coliTransetta/pET-28a。

1.2.4 重組酶的誘導表達

挑取重組菌E.coliTransetta/pET-28a-DH和對照菌E.coliTransetta/pET-28a單菌落分別接種于20 mL LB培養(yǎng)基(含有50 μg/mL卡那霉素和150 μg/mL氯霉素)中37 ℃、180 r/min培養(yǎng)過夜，按2%接種量轉(zhuǎn)接入1 L LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6，加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，16 ℃、130 r/min誘導培養(yǎng)16 h。離心收集菌體并重懸于KPB緩沖液(20 mmol/L，pH值6.5)中，在冰浴中進行超聲破碎，12 000 r/min離心1 h，得上清和沉淀。通過12% SDS-PAGE進行分離后，轉(zhuǎn)至NC膜上，加入封閉液封閉過夜。然后用一抗(1∶2000稀釋)、二抗(1∶1000稀釋)先后孵育結(jié)合1 h，通過DAB顯色法進行顯色反應。

1.2.5 純化重組酶

利用pET-28a(+)質(zhì)粒中的his-tag標簽，使用鎳柱對重組酶進行純化。將離心得到的上清加入到鎳柱中，用含有不同濃度咪唑的緩沖液進行洗脫，分別收集洗脫液進行SDS-PAGE分析。

1.2.6 重組酶活性檢測

實驗室之前已成功構建有活性的植物乳桿菌P-8的脂肪酸水合酶工程菌E.coliBL21/pET-28a-HY，實驗證明其能夠?qū)A水合為10-HOE。收取1.2.4中的離心上清液作為粗制酶液進行活性檢測，反應體系為1 mL，其中包含4 μg亞油酸、2 μg吐溫80、0.1 mmol/L FAD、5 mmol/L NADH、200 μL CLA-HY粗酶液、200 μL CLA-DH粗酶液，KPB緩沖液補至1 mL。對照組包含4 μg亞油酸、2 μg吐溫80、0.1 mmol/L FAD、5 mmol/L NADH、200 μL CLA-HY粗酶液、200 μL pET-28a(+)空質(zhì)粒粗酶液，KPB緩沖液補至1 mL。反應在37 ℃、120 r/min的條件下進行6 h后，加入5 mL正己烷充分振蕩30 s，3 000×g離心5 min，吸取上層正己烷至干凈試管中用N2吹干，加入2 mL 4%鹽酸-甲醇溶液50 ℃水浴20 min進行甲酯化，再次萃取脂肪酸后用N2吹干，加入100 μL正己烷回溶，使用GC-MS檢測分析。GC-MS條件: Finnigan Trance GC /FinniganTrance MS (美國Thermo)，色譜柱: Agilent DB-WAX(30 m×0.250 mm×0.25 μm)。升溫程序: 40 ℃保持0.5 min后以20℃/min的速度升至280 ℃，保持10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 CLA-DH基因的擴增

在NCBI中查找到植物乳桿菌P-8的CLA-DH序列，全長861 bp。以植物乳桿菌P-8基因組為模板，PCR擴增短鏈脫氫酶CLA-DH基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到約860 bp大小的片段(圖2)，與預期的理論值大小相同。將PCR產(chǎn)物膠回收后，送往華大基因測序，測序結(jié)果使用Blast驗證，結(jié)果顯示得到正確的植物乳桿菌P-8中CLA-DH。

M-DNA Marker; 1-CLA-DH PCR產(chǎn)物

圖2 CLA-DH基因PCR產(chǎn)物電泳圖

Fig.2 Electrophoresis gram of PCR product of CLA-DH

2.2 CLA-DH的生物信息學分析

經(jīng)序列分析表明，CLA-DH基因序列共編碼286個氨基酸(圖3)，其中極性氨基酸127個，非極性氨基酸132個，編碼蛋白的理論分子質(zhì)量為32.091 8 kDa，理論等電點為5.15。不穩(wěn)定指數(shù)為25.53，屬于穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為85.48。

對CLA-DH進行磷酸化位點分析，結(jié)果表明存在3個Ser磷酸化位點、3個Thr磷酸化位點和7個Tyr磷酸化位點。對CLA-DH進行疏水性分析，結(jié)果表明第142位的丙氨酸疏水性最強，第201位的組氨酸親水性最強，總平均親水系數(shù)為-0.179，所以CLA-DH是1個親水性蛋白。對CLA-DH進行跨膜區(qū)分析，結(jié)果表明CLA-DH不含跨膜區(qū)。對其進行細胞定位預測，結(jié)果顯示CLA-DH為細胞質(zhì)蛋白。對CLA-DH二級結(jié)構進行預測，發(fā)現(xiàn)其二級結(jié)構主要為40%左右的α-螺旋、30%左右的無規(guī)則卷曲和20%左右的β-折疊。

圖3 CLA-DH的氨基酸序列

Fig.3 Amino acid sequence of CLA-DH

2.3 重組質(zhì)粒的構建

將純化后的CLA-DH基因和pET-28a(+)質(zhì)粒分別經(jīng)EcoRⅠ和XholI雙酶切后回收酶切產(chǎn)物，連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細胞，挑取轉(zhuǎn)化子進行培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證，獲得大小分別為5 300 bp和860 bp的片段(圖4)，與理論值相符。為進一步驗證陽性克隆，將酶切驗證正確的質(zhì)粒測序，結(jié)果顯示已經(jīng)插入正確的目的基因，將重組質(zhì)粒保藏并命名為pET-28a-DH。

M-DNA marker；1-雙酶切產(chǎn)物

圖4 重組質(zhì)粒pET-28a-DH雙酶切鑒定電泳圖

Fig.4 Electrophoresis gram of recombined plasmid pET-28a-DH by two enzymes digestion

2.4 重組菌的構建與誘導表達

將pET-28a-DH和pET-28a(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliTransetta (DE3)感受態(tài)細胞中，獲得重組菌E.coliTransetta/pET-28a-DH和對照菌E.coliTransetta/pET-28a。將誘導表達后菌體用KPB緩沖液洗滌2遍。超聲破碎離心后收集上清和沉淀進行SDS-PAGE分析和Western Blot分析。結(jié)果顯示與對照菌相比，重組菌E.coliTransetta/pET-28a-DH在上清部分約38 kDa處有1條明顯的目標蛋白條帶(圖5)，與預測目標蛋白大小基本一致，表明獲得CLA-DH的可溶性表達，Western Blot結(jié)果也再次驗證目標蛋白成功表達。

A-誘導表達后重組菌株蛋白的SDS-PAGE；B-Western Blot檢測;M-蛋白Marker；1-陰性對照全細胞；2-上清；3-沉淀

圖5 誘導表達后重組菌株蛋白的SDS-PAGE和Western Blot檢測

Fig.5 SDS-PAGE analysis of the proteins from recombinants induction

2.5 重組酶的純化

粗酶液與鎳柱親和后，分別用20、40、60、80、100、200 mmol/L咪唑洗脫液進行梯度洗脫，將洗脫液進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示200 mmol/L咪唑洗脫液中得到大量單一的目的蛋白(圖6)。

M-蛋白Marker；1-破碎上清液；2-20 mmol/L咪唑洗脫液；3-40 mmol/L咪唑洗脫液；4-60 mmol/L咪唑洗脫液；5-80 mmol/L咪唑洗脫液；6-100 mmol/L咪唑洗脫液；7-200 mmol/L咪唑洗脫液

圖6 鎳柱純化重組酶的SDS-PAGE分析

Fig.6 SDS-PAGE analysis of purification of recombinant enzymes by Ni-NTA affinity chromatography

2.6 重組酶活性檢測

實驗室前期已成功構建的工程菌亞油酸水合酶大腸桿菌工程菌E.coliBL21/pET-28a-HY。亞油酸標準品經(jīng)GC檢測在12.12 min出峰，加入CLA-HY粗酶液與亞油酸反應后經(jīng)GC-MS檢測在14.8 min出現(xiàn)新的產(chǎn)物峰，經(jīng)MS碎片結(jié)果及理論斷裂方式分析確定為10-HOE。同時加入CLA-HY和CLA-DH粗酶液進行反應后，經(jīng)GC-MS檢測在14.11 min出現(xiàn)新的產(chǎn)物峰(圖7)，結(jié)合MS結(jié)果及理論斷裂方式(圖8)分析該物質(zhì)為10-氧代-順-12-十八碳烯酸，證明CLA-DH能夠?qū)?0-HOE轉(zhuǎn)化為10-氧代-順-12-十八碳烯酸。

圖7 E.coli BL21/pET-28a-HY和E.coli BL21/pET-28a-DH共同反應LA的GC結(jié)果

Fig.7 GC results of LA co-reacting with E.coli BL21/pET-28a-HY and E.coli BL21/pET-28a-DH

圖8 產(chǎn)物的MS碎片結(jié)果及理論斷裂方式

Fig.8 MS fragmentation results of the product and theoretical fracture mode

3 討論

植物乳桿菌轉(zhuǎn)化LA生成CLA需要CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC組成的亞油酸異構酶系共同參與代謝過程。植物乳桿菌P8可以轉(zhuǎn)化LA生成CLA，而且基因組中也存在這3種酶，但其轉(zhuǎn)化CLA能力較弱，說明可能是3種酶性質(zhì)不同造成轉(zhuǎn)化能力不同。CLA-DH分別催化具有內(nèi)部羥基或氧代基團的脂肪酸的脫氫和氫化，是植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化CLA過程中的關鍵步驟。有研究表明CLA-DH屬于短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)家族，與其他SDRs有很大的相似性，但關于SDR家族中的羥基脂肪酸脫氫酶報道很少[8]。研究CLA-DH的酶學性質(zhì)有助于探明植物乳桿菌P-8轉(zhuǎn)化CLA能力較弱的原因，所以本實驗克隆得到植物乳桿菌P-8中的CLA-DH基因，對其進行了生物信息學分析，并構建了CLA-DH的重組大腸桿菌，通過誘導表達得到有活性的CLA-DH重組酶，為深入研究CLA-DH的酶學性質(zhì)提供了實驗基礎，而且為進一步提高CLA產(chǎn)量并將其廣泛應用于食品、藥品、保健品中奠定了理論基礎。