彭夢(mèng)，譚明，曾艷，鄭宏臣，宋詼

1 天津科技大學(xué)，天津 300457

2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸 (tRNA) 是在生物體內(nèi)廣泛存在的一類非編碼RNA分子[1]。在基因表達(dá)過(guò)程中，tRNA是遺傳信息傳遞過(guò)程中的重要參與者，是連接核苷酸序列和氨基酸序列的重要紐帶[2]。細(xì)胞內(nèi)每種tRNA的數(shù)量存在顯著差異，由于密碼子簡(jiǎn)并性的存在，生物體內(nèi)的高表達(dá)基因均采用了數(shù)量相對(duì)豐富的tRNA所對(duì)應(yīng)的密碼子以保證表達(dá)過(guò)程的高效順利完成，這些密碼子稱為偏好密碼子；與此對(duì)應(yīng)的，數(shù)量相對(duì)稀少的tRNA對(duì)應(yīng)的密碼子生物體一般較少采用，稱為稀有密碼子[3]。這種生物對(duì)于使用部分密碼子的傾向性現(xiàn)象被稱為密碼子偏好性，不同生物的密碼子的偏好性存在著顯著差異[4]。將一種生物來(lái)源的基因轉(zhuǎn)入另外的宿主中進(jìn)行外源表達(dá)時(shí)，經(jīng)常面臨基因來(lái)源生物與宿主生物密碼子偏好性不同的問(wèn)題，這將導(dǎo)致外源基因在核糖體上的翻譯過(guò)程因?yàn)樗拗黧w內(nèi)對(duì)應(yīng)tRNA短缺而出現(xiàn)停滯現(xiàn)象，造成基因低表達(dá)或不表達(dá)。一般通過(guò)將外源基因按照宿主密碼子偏好性進(jìn)行改造的方式解決[5-6]。另外一種方式是通過(guò)提高宿主體內(nèi)稀少tRNA的豐度，從而提高外源基因表達(dá)幾率和表達(dá)量[7-8]。

例如，精氨酸密碼子AGA/AGG是真核生物中常見的密碼子，但在大腸桿菌中特別罕見[9-11]。Dieci等[12]通過(guò)使用攜帶大腸桿菌argU基因 (argU基因編碼的稀少tRNA識(shí)別AGA/AGG密碼子)的質(zhì)粒來(lái)克服這種限制。用含有大腸桿菌argU基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化已含有外源核糖體蛋白基因的大腸桿菌，使5種真核生物來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)核糖體蛋白表達(dá)量提高至總細(xì)菌蛋白質(zhì)的50%。Kleber等[13]在細(xì)菌中表達(dá)不同的花生過(guò)敏原時(shí)發(fā)現(xiàn)，Arah 1、2、6的成熟基因中含有8%–10%稀有密碼子AGA/AGG，其表達(dá)量比含0.8%同樣稀有密碼子AGA/AGG的Arah 5要低很多。在不改變基因密碼子含量的情況下，通過(guò)在大腸桿菌細(xì)胞中增加稀少tRNAargU、ileY和lueW基因的拷貝數(shù)，使Arah 1、2、6表達(dá)量提高了100多倍。Robert等[14]通過(guò)補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的6種稀少tRNA，構(gòu)建了商業(yè)化的Rosseta大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證Rosseta表達(dá)系統(tǒng)能夠緩解由密碼子偏好性導(dǎo)致的蛋白表達(dá)量低的問(wèn)題，可以提高外源基因尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平[15-17]。Constanze等[18]在巨大芽孢桿菌中通過(guò)共表達(dá)稀少tRNA基因，外源細(xì)胞外水解酶 (TFH) 蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加了18倍。但在目前應(yīng)用較廣泛的畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)中還未有相關(guān)研究報(bào)道。

為了實(shí)現(xiàn)在畢赤酵母中提高稀少tRNA豐度提高外源基因表達(dá)量的目的，需要獲得準(zhǔn)確的畢赤酵母稀少tRNA基因。目前，tRNA基因主要依靠軟件預(yù)測(cè)技術(shù)進(jìn)行發(fā)掘，其中應(yīng)用最為廣泛的是tRNAScan-SE軟件[19]。其預(yù)測(cè)結(jié)果被大多數(shù)基因組作為測(cè)序分析tRNA基因的注釋依據(jù)而采用。但由于真核生物tRNA基因的轉(zhuǎn)錄后修飾較為復(fù)雜，依靠識(shí)別基因組中tRNA基因的第34–37位堿基作為反密碼子的預(yù)測(cè)方式偏差較大[20]，因此需要對(duì)預(yù)測(cè)出的畢赤酵母tRNA基因結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

Constanze等在巨大芽孢桿菌構(gòu)建了一種以GFP為報(bào)告基因的tRNA基因驗(yàn)證方法，該驗(yàn)證方法在GFP基因序列5?端15個(gè)堿基后加入多個(gè)連續(xù)稀有密碼子，在GFP基因序列之后加入待驗(yàn)證的稀有密碼子對(duì)應(yīng)tRNA的基因，構(gòu)建表達(dá)載體后轉(zhuǎn)入巨大芽孢桿菌共表達(dá)。若與未轉(zhuǎn)入tRNA基因的帶有連續(xù)稀有密碼子的GFP對(duì)照組相比GFP的表達(dá)量有提高，則表明待驗(yàn)證的tRNA基因轉(zhuǎn)錄出的成熟tRNA可識(shí)別相應(yīng)稀有密碼子，能夠克服由于連續(xù)稀有密碼子對(duì)其表達(dá)造成的阻遏效果[18]。

NFATc3T是活化T細(xì)胞核因子NFAT家族成員，是一組在哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在免疫反應(yīng)中對(duì)誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄起重要作用[21]。NFAF在多種免疫細(xì)胞中均有表達(dá)，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞等，在細(xì)胞分化、生長(zhǎng)過(guò)程中起重要作用，已成為腫瘤研究中的熱點(diǎn)，并有可能成為新的腫瘤治療靶點(diǎn)[22]。NFAT保守型較高，在氨基端約100個(gè)殘基區(qū)域?yàn)橐粋€(gè)很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)(Trans-activation domain，TAD)，在該區(qū)域基因內(nèi)有多個(gè)連續(xù)脯氨酸稀有密碼子CCG，進(jìn)行畢赤酵母外源表達(dá)時(shí)會(huì)造成極大概率的翻譯提前終止[23]。

本研究在畢赤酵母中優(yōu)化了以GFP為報(bào)告基因的稀少tRNA基因驗(yàn)證方法，比較了將帶有連續(xù)稀有密碼子阻遏區(qū)的GFP基因和待驗(yàn)證tRNA基因使用同一載體共表達(dá)和使用不同載體共表達(dá)兩種方式，并對(duì)畢赤酵母tRNA基因進(jìn)行了驗(yàn)證。完成了人類活化T細(xì)胞核因子TAD區(qū)域NFATc3T和GFP融合基因與tRNA基因在畢赤酵母GS115中的共表達(dá)。驗(yàn)證了在畢赤酵母中表達(dá)tRNA基因?qū)B續(xù)稀有密碼子CCG導(dǎo)致翻譯提前終止現(xiàn)象的去阻遏作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

畢赤酵母GS115 (P.pastorisGS115)，大腸桿菌DH5α (Escherichia coliDH5α) 及穿梭質(zhì)粒pPIC9K、pFLDα均為中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所工業(yè)酶工程研究組實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑與耗材

D-葡萄糖、YNB、氨芐青霉素 (Amp)、博來(lái)霉素 (Zeosin) 購(gòu)自 Solarbio (美國(guó))。生物素(D-Biotin) 購(gòu)自BIO BASIC INC公司 (加拿大)；甲醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司。

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB (美國(guó))；高保真DNA聚合酶購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司 (中國(guó))。

質(zhì)粒小提試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技有限公司 (中國(guó))。

PCR所需引物均由北京華大基因公司合成。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

為了在畢赤酵母GS115中建立tRNA表達(dá)體系，選擇綠色熒光蛋白GFP基因作為報(bào)告基因。GFP基因由安徽通用生物公司進(jìn)行全序列合成，并克隆到穿梭質(zhì)粒pPIC9K多克隆位點(diǎn)EcoRⅠ和NotⅠ之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-GFP (簡(jiǎn)寫pGFP)。同時(shí)在GFP基因序列5?端的15個(gè)堿基對(duì)下游插入4個(gè)連續(xù)的畢赤酵母脯氨酸稀有密碼子CCG作為基因表達(dá)的阻遏區(qū)，構(gòu)建基因GFP4CCG(圖1)。

人類活化T細(xì)胞核因子TAD區(qū)域NFATc3T基因 (Gene ID: 100458008) 及綠色熒光蛋白GFP基因的融合基因NFATc3T-GFP由安徽通用生物公司進(jìn)行全序列合成，并克隆到穿梭質(zhì)粒pPIC9K多克隆位點(diǎn)的EcoRⅠ和NotⅠ之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-NFATc3T-GFP。

利用tRNAScan-SE 2.0軟件檢索GS115基因組序列后獲得待驗(yàn)證的基因序列以及作為對(duì)照組的基因序列。設(shè)計(jì)PCR引物 (表1)后，以酵母基因組DNA提取試劑盒提取的畢赤酵母GS115基因組為模板PCR擴(kuò)增獲得基因和基因 (圖1)。

圖1 PCR擴(kuò)增得到的基因序列Fig.1 The gene sequence amplified by PCR.The gray broken arrow represents the open reading frame of GFP.Four identical consecutive rare codons CCG are integrated into the coding region of GFP.The blue arrow indicates the tRNA gene.

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 PCR primers used in the experiment

在Constanze等的同一載體共表達(dá)方法中，帶稀有密碼子阻遏區(qū)的GFP基因與待驗(yàn)證tRNA基因距離太近，tRNA基因回文序列可能對(duì)GFP基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)造成影響[24]。為了驗(yàn)證這一影響，分別構(gòu)建了利用同一載體表達(dá)GFP4CCG基因和基因的載體pPIC9K-GFP4CCG-tRNA(簡(jiǎn)寫為pGFP4CCG-tRNA)，以及利用不同載體表達(dá)GFP4CCG基因和基因的載體pPIC9KGFP4CCG(簡(jiǎn)寫pGFP4CCG) 和pFLDα-tRNA(簡(jiǎn)寫ptRNA)。

為了給待驗(yàn)證的基因提供對(duì)照，構(gòu)建了包含不能識(shí)別密碼子CCG的的基因的載體pFLDα-tRNA(簡(jiǎn)寫ptRNA)。

1.2.2 電擊轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子鑒定

重組質(zhì)粒pPIC9K-GFP、pPIC9K-GFP4CCG、pPIC9K-GFP4CCG-tRNA以限制性內(nèi)切酶SalⅠ作為線性化位點(diǎn)酶切后進(jìn)行濃縮，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，通過(guò)在MD篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)分別獲得GS115/pGFP、GS115/pGFP4CCG和GS115/pGFP4CCG-tRNA轉(zhuǎn)化子。

電擊轉(zhuǎn)化：取80 μL畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞與10 μL (約2 μg) 線性化DNA混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2 cm電擊杯中，在冰上放置5 min，電壓1500 V進(jìn)行電擊，立即加入1 mL預(yù)冷的1 mol/L山梨醇至電轉(zhuǎn)杯中，將內(nèi)容物涂于篩選平板，在30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至單克隆產(chǎn)生。

轉(zhuǎn)化子鑒定：挑取篩選平板上的單菌落接種于3 mL YPD液體培養(yǎng)基中，29 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，取出1 mL用于保菌后，剩余菌液采用酵母基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。并以酵母基因組DNA為模板，以通用引物AOX和FLDα引物 (pFLDα骨架引物，于tRNA基因上下游各150 bp處設(shè)計(jì)引物) (表2) 對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增體系：5×Cobuddy HF緩沖液10 μL，dNTPs 1 μL，上下游引物各1.5 μL，模板1 μL，Cobuddy 0.5 μL，補(bǔ)ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，51 ℃ 45 s，72 ℃90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃終止。1%瓊脂糖凝膠電泳120 V、30 min，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。

1.2.3 菌株培養(yǎng)及GFP基因甲醇誘導(dǎo)表達(dá)

大腸桿菌培養(yǎng)：將驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子接種于LB培養(yǎng)基中 (Amp，100 μg/mL)，37 ℃、220 r/min搖床中過(guò)夜培養(yǎng)，用于質(zhì)粒提取。

畢赤酵母培養(yǎng)及誘導(dǎo)：將重組畢赤酵母菌株劃線于YPD平板，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2–3 d至單菌落長(zhǎng)出，挑取單菌落于10 mL BMGY液體培養(yǎng)基(100 mL三角瓶)，于29 ℃、220 r/min培養(yǎng)40 h，轉(zhuǎn)接于20 mL BMMY液體培養(yǎng)基 (250 mL避光擋板三角瓶) 測(cè)每個(gè)菌液OD600光吸收值，并將每個(gè)菌液調(diào)到同一個(gè)OD600水平。29 ℃、220 r/min，每隔24 h添加甲醇至終濃度為2%誘導(dǎo)培養(yǎng)，同時(shí)測(cè)OD600光吸收值作菌液生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 GFP4CCG基因與tRNA基因共表達(dá)的熒光檢測(cè)

每隔24 h取2 mL誘導(dǎo)表達(dá)菌液于包有鋁箔的避光EP管中，12 000 r/min離心10 min，無(wú)菌注射器小心吸取菌液上清，用已滅菌的0.22 μm的濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌及雜質(zhì)。并將過(guò)濾后的上清轉(zhuǎn)至新的包有鋁箔的避光EP管，分別取200 μL樣品于96孔熒光酶標(biāo)板，以BMMY培養(yǎng)基 (已過(guò)濾除菌) 為空白對(duì)照，采用連續(xù)多功能酶標(biāo)儀Flex Station 3進(jìn)行熒光值的檢測(cè)，檢測(cè)激發(fā)光為485 nm，發(fā)射光為523 nm。

表2 AOX與FLDα引物Table 2 Primers: AOX and FLDα

熒光顯微鏡下觀察畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)熒光，取誘導(dǎo)表達(dá)相同時(shí)間的重組畢赤酵母菌液，12 000 r/min離心10 min，收集菌體，ddH2O懸浮菌體，洗滌，離心收集菌體，重復(fù)洗滌3遍，重懸菌體于1 mL ddH2O，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光。

1.2.5 SDS-PAGE驗(yàn)證

三氯乙酸沉淀：取發(fā)酵上清液1 mL，加入100%三氯乙酸 (TCA) 溶液150 μL (終濃度13%)，充分混勻，–20 ℃沉淀10 min，4 ℃沉淀12–24 h，12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL丙酮吹懸洗滌沉淀，12 000 r/min離心10 min，棄上清，重復(fù)洗滌3次，室溫干燥至丙酮完全揮發(fā)，所得沉淀即為蛋白樣品。

SDS-PAGE驗(yàn)證：將所得到的蛋白樣品用20 μL 6 mol/L的尿素溶解，并加入7 μL 4×蛋白上樣緩沖液混勻，100 ℃煮沸10 min；待樣品冷卻后，短暫離心，取12 μL蛋白樣品上樣并開始電泳。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色2 h，然后換脫色液，脫色至條帶清晰可見，期間更換1–2次脫色液。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建

GFP4CCG基因和GFP4CCG-tRNA基因分別克隆到穿梭質(zhì)粒pPIC9K多克隆位點(diǎn)EcoRⅠ和NotⅠ之間，得到的重組質(zhì)粒pPIC9K-GFP4CCG、pPIC9KGFP4CCG-tRNA分別轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115菌株，應(yīng)用AOX引物 (表2) 進(jìn)行PCR篩選轉(zhuǎn)化子，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在瓊脂糖凝膠電泳中可見兩條帶，一條為含有目的基因加492 bpAOX部分基因序列的基因片段，其中GFP4CCG和GFP4CCG-tRNA的基因驗(yàn)證條帶大小應(yīng)分別為1221 bp (729 bp+492 bp)和1374 bp (882 bp+492 bp)，另一條為AOX1基因片段，大小約為2 200 bp (圖2A，2B)。將驗(yàn)證正確的重組菌株送樣測(cè)序，從而成功得到重組菌株GS115/pGFP4CCG和GS115/pGFP4CCG-tRNA。

同樣，將基因和基因克隆到穿梭質(zhì)粒pFLDα多克隆位點(diǎn)BamHⅠ處，得到的重組質(zhì)粒pFLDα-tRNA、pFLDα-tRNA分別轉(zhuǎn)入到重組菌株GS115/pGFP4CCG中，經(jīng)FLDα引物(表2) PCR篩選轉(zhuǎn)化子，基因和基因大小分別為147 bp和150 bp，加上pFLDα骨架上的300 bp，目的條帶分別為447 bp和450 bp(圖2C)。將驗(yàn)證正確的重組菌株送樣測(cè)序，最終成功構(gòu)建了重組菌株GS115/pGFP4CCG/ptRNA和GS115/ pGFP4CCG/ptRNA。

圖2 重組畢赤酵母的PCR驗(yàn)證Fig.2 PCR identification of the positive recombinant P.pastoris strains.M: nucleic acid molecular weight marker; +: positive control; –: negative control.(A) 1, 2: recombinant strain GS115/pGFP4CCG.(B) 1, 2: recombinant strain GS115/pGFP4CCGtRNA.(C) 1, 2: recombinant strain GS115/pGFP4CCG/ptRNA; 3: recombinant strain GS115/pGFP4CCG/ptRNA.

2.2 重組畢赤酵母表達(dá)水平檢測(cè)

2.2.1 重組畢赤酵母的生長(zhǎng)曲線

在BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌體轉(zhuǎn)接至BMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)前將各個(gè)菌液的OD600調(diào)整為同一水平 (7.35左右)。在誘導(dǎo)過(guò)程中，各個(gè)重組表達(dá)菌株生長(zhǎng)狀態(tài)情況 (圖3) 基本一致，添加tRNA基因與目的基因共表達(dá)沒有對(duì)菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響。

2.2.2 帶有連續(xù)稀有密碼子阻遏的GFP表達(dá)

通過(guò)熒光顯微鏡 (圖4) 和SDS-PAGE (圖5)比較誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h左右菌株GS115/pGFP和GS115/pGFP4CCG受激發(fā)光源激發(fā)后熒光值和GFP表達(dá)水平 (GFP理論分子量約為27 kDa)，結(jié)果顯示，加入連續(xù)稀有密碼子后，GFP的表達(dá)受到了明顯阻遏。

圖3 重組畢赤酵母生長(zhǎng)曲線Fig.3 The growth curve of recombinant P.pastoris.

圖4 GS115/pGFP轉(zhuǎn)化子和GS115/pGFP4CCG轉(zhuǎn)化子熒光對(duì)比Fig.4 Fluorescence comparison between GS115/pGFP and GS115/pGFP4CCG.

圖5 SDS-PAGE比較GFP基因添加連續(xù)稀有密碼子前后表達(dá)水平Fig.5 Comparing the expression levels of GFP gene before and after adding continuous rare codons by SDS-PAGE.M: protein molecular weight marker; 1:GS115/Pgfp; 2: GS115/pGFP4CCG.

2.2.3 tRNA基因效果驗(yàn)證

各重組畢赤酵母的表達(dá)水平通過(guò)報(bào)告基因GFP的熒光值來(lái)體現(xiàn)。采用連續(xù)多功能酶標(biāo)儀在485 nm激發(fā)光源照射下，檢測(cè)523 nm發(fā)射光數(shù)據(jù)作為熒光值。誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中各重組畢赤酵母的熒光值變化趨勢(shì)高度一致。

其中同載體共表達(dá)菌株GS115/pGFP4CCGtRNA與對(duì)照菌株GS115/pGFP4CCG相比，GFP表達(dá)量平均提高4.9%，不同載體共表達(dá)菌株GS115/pGFP4CCG/ptRNA與對(duì)照菌株GS115/pGFP4CCG相比GFP表達(dá)量平均提高12.5%。而共表達(dá)GFP4CCG和的菌株熒光值與對(duì)照菌株GS115/pGFP4CCG相比有所降低 (圖6)。

取誘導(dǎo)表達(dá)168 h的各菌液上清，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)各重組畢赤酵母菌株中目的蛋白最終表達(dá)水平 (圖7)。GFP理論分子量約為27 kDa，從圖中可以看出4個(gè)重組畢赤酵母菌株都成功表達(dá)了GFP，其中GS115/pGFP4CCG/ptRNA菌株的GFP表達(dá)量最高，其次是GS115/pGFP4CCG-tRNA，都高于GS115/pGFP4CCG，而GS115/pGFP4CCG/ptRNA菌株的GFP表達(dá)量最低。經(jīng)軟件Quantity One對(duì)蛋白膠圖進(jìn)行定量分析，其中，菌株GS115/pGFP4CCG、GS115/pGFP4CCG-tRNA和 GS115/pGFP4CCG/ptRNA的蛋白表達(dá)量分別為2.43、2.45、2.99 μg/mL，與檢測(cè)的熒光值結(jié)果一致。

圖6 重組畢赤酵母表達(dá)GFP熒光值對(duì)比Fig.6 Comparison of fluorescence values of GFP expressed in recombinant P. pastoris.*P≤0.05, **P≤0.01 and***P≤0.001(Student’s t-test).Error bars indicate standard deviations from three parallel experiments.

2.3 tRNA共表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證

2.3.1 融合基因NFATc3T-GFP表達(dá)菌株的構(gòu)建

圖7 SDS-PAGE比較GFP表達(dá)水平Fig.7 Comparing the expression levels of GFP by SDS-PAGE.M: protein molecular weight marker.1:GS115/pGFP4CCG.2: GS115/pGFP4CCG-tRNA.3: GS115/pGFP4CCG/ptRNA.4: GS115/pGFP4CCG/ptRNA.

重組質(zhì)粒pPIC9K-NFATc3T-GFP以限制性內(nèi)切酶SalⅠ作為線性化位點(diǎn)酶切后進(jìn)行濃縮，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115和畢赤酵母重組菌株GS115/pFLDα-tRNA中，通過(guò)在MD篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)化子 GS115/pNFATc3T-GFP和GS115/pNFATc3T-GFP/ptRNA。其中，融合基因NFATc3T-GFP序列全長(zhǎng)為1170 bp，由北京華大基因公司測(cè)序驗(yàn)證正確。

2.3.2 NFATc3T-GFP融合蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

圖8 重組畢赤酵母表達(dá)NFATC3T-GFP融合蛋白的熒光值對(duì)比Fig.8 Fluorescence contrast of NFATc3T-GFP expressed in recombinant P. pastoris.*P≤0.05, **P≤0.01 and ***P≤0.001 (Student’s t-test).Error bars indicate standard deviations from three parallel experiments.

誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中各重組畢赤酵母的熒光值變化見圖8，熒光值變化趨勢(shì)高度一致。重組菌株GS115/pNFATc3T-GFP/ptRNA表達(dá)NFATC3T-GFP融合蛋白的熒光值與重組菌株GS115/pNFATC3TGFP相比，平均提高了21.3%。

取誘導(dǎo)表達(dá) 168 h的菌液上清，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)各重組畢赤酵母中目的蛋白最終表達(dá)水平 (圖9)。NFATc3T-GFP融合蛋白理論分子量約為43 kDa，從圖中可以看出2個(gè)重組菌株均成功表達(dá)出了目的蛋白。通過(guò)軟件Quantity One對(duì)蛋白膠圖進(jìn)行定量分析，菌株GS115/pNFATc3TGFP/ptRNA的融合蛋白表達(dá)量約為2.59 μg/mL，與菌株GS115/pNFATC3T-GFP的融合蛋白表達(dá)量2.19 μg/mL相比，提高了18.3%，與檢測(cè)的熒光值結(jié)果相近。

3 討論

本文以帶有連續(xù)稀有密碼子CCG的GFP基因?yàn)閳?bào)告基因，分別構(gòu)建了利用同載體表達(dá)GFP4CCG基因和基因的載體pPIC9K-GFP4CCGtRNA，以及利用不同載體表達(dá)GFP4CCG基因和基因的載體pPIC9K-GFP4CCG和pFLDαtRNA，并將重組載體轉(zhuǎn)入畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果顯示，與單獨(dú)表達(dá)GFP4CCG相比，兩種共表達(dá)方式的GFP表達(dá)量均有提高，同載體共表達(dá)GFP表達(dá)量可提高4.9%，不同載體共表達(dá)GFP表達(dá)量可提高12.5%。采用不同載體共表達(dá)的方式優(yōu)于同一個(gè)載體共表達(dá)方式，SDS-PAGE定量分析GFP表達(dá)量的結(jié)果也得到相同結(jié)論。這一結(jié)果顯示tRNA基因與預(yù)表達(dá)的目的基因不在同一轉(zhuǎn)錄單元下表達(dá)，有利于其發(fā)揮抗阻遏的作用，這與Shin等[25]在大腸桿菌中獲得的結(jié)果一致。

圖9 SDS-PAGE比較NFATc3T-GFP融合蛋白表達(dá)水平Fig.9 Comparing the expression levels of NFATc3T-GFP by SDS-PAGE.M: protein molecular weight marker.1:GS115/pNFATc3T-GFP/ptRNA; 2: GS115/pNFATc3T-GFP.

為了進(jìn)一步驗(yàn)證不同載體共表達(dá)稀少基因的畢赤酵母表達(dá)體系可以提高含連續(xù)稀有密碼子CCG外源基因的表達(dá)，以含有多個(gè)連續(xù)脯氨酸稀有密碼子CCG的NFATc3T基因?yàn)槔?，?gòu)建融合基因NFATc3T-GFP表達(dá)菌株GS115/pNFATc3TGFP/ptRNA和GS115/pNFATc3T-GFP。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)不同載體共表達(dá)NFATc3T-GFP融合蛋白的表達(dá)水平可提高21.3%。此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了共表達(dá)稀少基因?qū)μ岣吆B續(xù)稀有密碼子CCG外源基因表達(dá)量的有效性。

在動(dòng)植物中，基因上游出現(xiàn)連續(xù)多個(gè)畢赤酵母稀有密碼子的情況是較為常見的，例如本文中表達(dá)的活化T細(xì)胞核因子NFATc3T基因 (含連續(xù)CCG)、菊科植物糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1基因 (含連續(xù)CGG)、擬南芥蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SUC1編碼基因(含連續(xù)GCG) 等。這些基因在畢赤酵母中進(jìn)行外源表達(dá)時(shí)，連續(xù)的稀有密碼子極易導(dǎo)致表達(dá)過(guò)程的提前終止。文中在畢赤酵母細(xì)胞中初步建立了提高外源基因表達(dá)的稀有tRNA共表達(dá)系統(tǒng)，并驗(yàn)證了其有效性，通過(guò)該策略可有效改善畢赤酵母表達(dá)過(guò)程中由于連續(xù)稀有密碼子存在導(dǎo)致的表達(dá)提前終止現(xiàn)象。

與目前普遍采用的密碼子優(yōu)化后進(jìn)行全基因合成的方法相比，文中提供的策略在實(shí)驗(yàn)周期和成本方面具有一定優(yōu)勢(shì)，可作為一種備選和補(bǔ)充方案。同時(shí)，本策略更適用于除基因合成外的各種功能基因的高通量篩選工作，理論上可有效提高功能基因表達(dá)的成功率，進(jìn)而擴(kuò)大篩選庫(kù)的容量，提高篩選目的基因的成功率。

同時(shí)，在部分表達(dá)系統(tǒng)中，共表達(dá)多個(gè)優(yōu)化的稀少tRNA提高了宿主總體mRNA的翻譯效率，提高了部分已經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的基因的表達(dá)和分泌量[18]。目前畢赤酵母中是否同樣會(huì)出現(xiàn)這種情況還有待研究。

將含有稀有密碼子的目的基因與對(duì)應(yīng)tRNA共表達(dá)以提高表達(dá)量的策略在原核表達(dá)系統(tǒng)中有較多報(bào)道，例如前文提到的Stratagene等[13]的大腸桿菌CodonPlus菌株、Novagen等[14]的大腸桿菌Rosetta菌株、以及Finger等[18]報(bào)道的巨大芽孢桿菌等，均是通過(guò)共表達(dá)多個(gè)經(jīng)優(yōu)化后的稀少tRNA，最終顯著提高了目的蛋白表達(dá)量。本研究完成了在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中目的基因與稀少tRNA共表達(dá)的初步探索，為下一步工作提供了研究基礎(chǔ)，經(jīng)不斷優(yōu)化稀少tRNA的種類和數(shù)量，將會(huì)達(dá)到更為理想的效果，極具研究潛力和開發(fā)前景。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)同一載體和不同載體兩種共表達(dá)方式，構(gòu)建了畢赤酵母稀少tRNA基因與外源基因共表達(dá)體系。得到一種適用于含連續(xù)稀有密碼子CCG的基因與基因共表達(dá)的畢赤酵母表達(dá)體系，提高了外源基因表達(dá)量，從而為提高外源基因表達(dá)量提供新的思路。該方法不局限于含連續(xù)稀有密碼子CCG的外源基因與稀少基因共表達(dá)，還可給其他含連續(xù)稀有密碼子的外源基因與其相對(duì)應(yīng)的稀少tRNA基因在畢赤酵母中共表達(dá)提供方法。

從基因工程的角度改變tRNA豐度能夠影響畢赤酵母基因表達(dá)水平，對(duì)于完善畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)和提高外源基因的表達(dá)量都具有十分重要的意義。