周麗娜 王玉新 武 挺 方 林

1 廈門(mén)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科，福建省廈門(mén)市 361021; 2 廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科

腎間質(zhì)血管內(nèi)皮損傷致管腔狹窄造成“無(wú)復(fù)流現(xiàn)象”，引起腎小管上皮細(xì)胞攝取的氧分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，導(dǎo)致其缺血、壞死，最終形成急性腎衰竭[1-2]。然而血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷修復(fù)可預(yù)防或減輕腎小管上皮細(xì)胞的損傷[3-4]。1997年Asahara[5]提出內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)可分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞,參與血管生成和內(nèi)皮修復(fù)，除此以外，EPCs是否還可以通過(guò)其他作用機(jī)制修復(fù)血管損傷？據(jù)報(bào)道，VEGF能促進(jìn)血管生成和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng),是促進(jìn)血管生成的最高選擇性、最強(qiáng)活性的因子[6-7]。EPCs移植能否通過(guò)上調(diào)VEGF的表達(dá)發(fā)揮對(duì)I/R腎損傷的保護(hù)作用，尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬建立大鼠缺血再灌注腎損傷模型，通過(guò)觀察EPCs移植對(duì)大鼠缺血再灌注損傷VEGF表達(dá)的影響，來(lái)探討EPCs移植在修復(fù)缺血再灌注腎損傷大鼠內(nèi)皮細(xì)胞的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 22頭SPF級(jí)雄性SD大鼠，重約220g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證編號(hào)：SCXK(滬)2007-0005]，隨機(jī)分為對(duì)照組(n=6)、缺血再灌注損傷組(I/R，n=8)、 EPCs處理組(n=8)，分籠飼養(yǎng)于廈門(mén)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXC(閩)2008-0003]。

1.2 主要試劑 Histopague-1083(Sigma)、EBM-2細(xì)胞培養(yǎng)液(Lonza)、小鼠抗大鼠CD34抗體及小鼠抗大鼠VEGFR-2抗體(Santa cruz)羊抗鼠IgG-FITC(武漢博士德)、逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒(Promega)。

1.3 內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 每100g大鼠用10%水合氯醛0.3～0.4ml麻醉。5ml外周血加入Histopague-1083,分離單個(gè)核細(xì)胞，重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液，按密度5×106/ml接種于6孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)3d后，丟棄上清液，培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD34表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞、細(xì)胞免疫熒光鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞表面標(biāo)志CD34及VEGFR-2。

1.4 建立動(dòng)物模型 大鼠缺血再灌注損傷(I/R)模型的制備采用切除右腎，夾閉左腎動(dòng)靜脈40min 后松開(kāi)；假手術(shù)組僅切除右腎；在缺血再灌注損傷后從左腎動(dòng)脈移植EPCs(5×106/2ml)至左腎作為EPCs組。分別在手術(shù)后1d收獲大鼠。

1.5 生化指標(biāo)檢測(cè) 取大鼠外周血上機(jī)測(cè)定血肌酐及尿素氮等指標(biāo)。

1.6 病理染色 取3組腎組織進(jìn)行CD34免疫組化染色，用人工單盲法進(jìn)行半定量評(píng)分[8]，陽(yáng)性范圍0分：無(wú)，1分：≤25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：﹥75%；陽(yáng)性強(qiáng)度 1分：弱，2分：中，3分：強(qiáng)，4分：極強(qiáng)。二者相乘，即該例的陽(yáng)性積分；每組總陽(yáng)性積分/每組例數(shù)，為該組的陽(yáng)性強(qiáng)度平均分。

1.7 RT-PCR檢測(cè)大鼠腎臟VEGF mRNA的表達(dá) 提取腎皮質(zhì)總RNA，反轉(zhuǎn)錄4μg。分別擴(kuò)增VEGF和β-actin PCR。VEGF上游引物5’-AATGATGAAGCCCTGGAGTG-3’；下游引物5’- GAACAAGGCTCACAGTGATTTT-3’，產(chǎn)物179bp。內(nèi)參β-actin上游引物5’-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3；下游引物5’-GGAAGGTGGACAGTGAGGC-3’，產(chǎn)物444 bp。反應(yīng)條件為：95℃ 45s；53.6℃ 45s；72℃ 90s，共40個(gè)循環(huán)。用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)PCR條進(jìn)行掃描,并用4.62圖像分析系統(tǒng)對(duì)吸收度A進(jìn)行分析，以二者A比值為相對(duì)量。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定 用密度梯度法分離獲得單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，3d后形成“集落”(圖1)。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示外周血CD34細(xì)胞占(1.29±0.21)%(圖2)。內(nèi)皮祖細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、VEGFR-2結(jié)果如圖3。

圖1大鼠外周血集落圖2流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠外周血CD34+細(xì)胞百分比

注：放大倍數(shù)：A，×200；B，×400。 注：A：圈定單個(gè)核細(xì)胞為A門(mén)； B：同型對(duì)照；C：大鼠外周血CD34+陽(yáng)性率1.29%。

圖3 EPCs的鑒定免疫細(xì)胞熒光染色

注：A:CD34陽(yáng)性(×100)；B:VEGFR-2陽(yáng)性(×100)。

2.2 EPCs治療前、后血肌酐、尿素氮水平比較 I/R組、EPCs組大鼠血肌酐、血尿素氮明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)；移植EPCs后明顯改善I/R組的腎功能(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 EPCs治療前、后血肌酐、尿素氮水平及CD34陽(yáng)性評(píng)分、VEGF mRNA表達(dá)水平比較

注：與正常組相比，#P<0.05;與I/R組比，*P<0.05 。

2.3 腎臟組織CD34蛋白表達(dá)水平 對(duì)各組大鼠腎組織進(jìn)行CD34免疫組化檢測(cè)。I/R組腎間質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞密度明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)，移植EPCs后明顯增加了I/R組的腎間質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞密度(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖4。

2.4 EPCs治療前、后VEGF mRNA表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組比較，I/R組大鼠VEGF mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05)，給予EPCs治療后，治療組大鼠VEGF mRNA表達(dá)較I/R組明顯上升。見(jiàn)表1、圖5。

圖4 各組大鼠腎臟CD34免疫組化染色

注：A,陰性對(duì)照：免疫組化染色，DAB顯色，蘇木素套染(×100)。B,正常對(duì)照組：腎間質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞見(jiàn)CD34表達(dá)。免疫組化染色，DAB顯色，蘇木素套染(×100)。C,I/R組：腎間質(zhì)血管幾乎未見(jiàn)CD34表達(dá)。免疫組化染色，DAB顯色，蘇木素套染(×100)。D,EPCs組：腎間質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞見(jiàn)CD34表達(dá)。免疫組化染色，DAB顯色，蘇木素套染(×100)。

圖5 大鼠腎組織VEGF mRNA RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

注：由左至右電泳條帶依次為1.Marker、2.normal組、3.I/R組、4.EPCs組。

3 討論

急性腎衰竭是臨床上常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，它可繼發(fā)于多種疾病，如膿毒血癥等。盡管目前的治療水平較以往已有明顯提高，但目前其死亡率仍高。眾所周知，I/R腎損傷主要是始動(dòng)于內(nèi)皮的損傷，因此如何減輕血管內(nèi)皮的損傷至關(guān)重要。內(nèi)皮祖細(xì)胞作為多能造血干細(xì)胞之一具有促進(jìn)血管修復(fù)的功能，其可在某些信號(hào)的刺激下被動(dòng)員至損傷處，通過(guò)直接分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，或旁分泌機(jī)制，參與血管新生、重建和修復(fù)[9-13]。國(guó)內(nèi)外有許多關(guān)于內(nèi)皮祖細(xì)胞的報(bào)道。崔斌等人[14]利用球囊剝脫內(nèi)皮構(gòu)建大鼠頸動(dòng)脈損傷模型，將內(nèi)皮祖細(xì)胞從尾靜脈移植至大鼠體內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)EPCs可遷移至血管損傷處，通過(guò)促進(jìn)血管的再內(nèi)化過(guò)程及抑制平滑肌的增殖從而促進(jìn)血管內(nèi)皮的修復(fù)。Hecht 等人[15]將來(lái)源于胚胎的內(nèi)皮祖細(xì)胞移植至慢性缺血性腦病的大鼠模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示內(nèi)皮祖細(xì)胞和腦血管內(nèi)皮細(xì)胞二者相互作用，同時(shí)內(nèi)皮祖細(xì)胞還可通過(guò)間接旁分泌和自分泌信號(hào)機(jī)制，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)生成，改善大腦血流。Bai 等學(xué)者[16]的研究也證實(shí)內(nèi)皮祖細(xì)胞具有促進(jìn)缺血性腦卒中大鼠血管再生的作用。除此以外，離體培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞可分泌VEGF，提示也可能通過(guò)旁分泌而起作用[17]。薛建新等[18]報(bào)道，VEGF165轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞后可修復(fù)大鼠缺血再灌注腎損傷。Yi等[19]將VEGF 基因轉(zhuǎn)染至內(nèi)皮祖細(xì)胞發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)血流恢復(fù)效果較對(duì)照組明顯。

自1980年首次提出血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子以來(lái)，其相關(guān)研究一直備受關(guān)注。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是糖蛋白化合物，是血管生成的主要細(xì)胞因子，對(duì)促進(jìn)血管生成、提高血管通透性是非常重要的。此外,VEGF水平對(duì)血管內(nèi)皮功能的評(píng)估和側(cè)支循環(huán)的建立具有重要意義[20-21]。

在本次研究中，筆者觀察到缺血再灌注損傷后，大鼠腎間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重受損，同時(shí)腎功能明顯下降，且其血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)量也較正常對(duì)照組下降。筆者發(fā)現(xiàn)給予EPCs治療后，大鼠腎間質(zhì)的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量亦較I/R組增多、腎功能均較I/R組明顯改善，且血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)量較I/R組增加。因此推斷，EPCs移植可修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮、改善缺血再灌注損傷大鼠的腎功能，該作用機(jī)制除了可能與其轉(zhuǎn)分化為內(nèi)皮細(xì)胞外，還可能也與其上調(diào)VEGF的表達(dá)促進(jìn)血管修復(fù)有關(guān)。筆者的結(jié)論與薛建新等人報(bào)道具有一致性。本課題通過(guò)對(duì)EPCs移植治療的研究，為今后ARF的治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為開(kāi)辟新的ARF防治途徑提供相關(guān)科學(xué)依據(jù)。

隨著內(nèi)皮祖細(xì)胞的廣泛研究，關(guān)于干細(xì)胞治療為急性腎衰竭患者帶來(lái)了希望，但由于內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)血管修復(fù)機(jī)制尚未完全研究透徹，仍需要不斷完善相關(guān)動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)、并且不斷深入探討其他可能的作用機(jī)制。同時(shí)由于實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)和技術(shù)的影響，目前對(duì)于內(nèi)皮祖細(xì)胞的表型鑒定等有待統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。如何使內(nèi)皮祖細(xì)胞今后能被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域的治療，目前還有諸多問(wèn)題等待進(jìn)一步研究探討，若能成功攻克這些問(wèn)題，干細(xì)胞治療疾病的新時(shí)代即將到來(lái)。