王 瑤，龔作炯

王瑤，龔作炯，武漢大學(xué)人民醫(yī)院感染科 湖北省武漢市 430060

核心提要： 肝臟炎癥反應(yīng)是肝臟疾病過程中常見的病理反應(yīng), 也是肝臟疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵因素. 近年來, 許多研究證實, 組蛋白乙?；cDNA甲基化調(diào)控在肝臟炎癥的發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用.

0 引言

肝臟炎癥反應(yīng)包括無菌性炎癥和感染性炎癥, 而持續(xù)性的炎癥反應(yīng)可促進肝臟疾病的進展[1]. 研究表明, 以通過蛋白質(zhì)復(fù)合物的翻譯后修飾而不改變基礎(chǔ)遺傳DNA序列而發(fā)生的遺傳基因表達變化為特點的表觀遺傳學(xué)對肝臟炎癥反應(yīng)有著復(fù)雜的調(diào)控機制[2], 這些翻譯后修飾包括乙?；?、甲基化、磷酸化、SUMO化(sumoylation)、泛素化、羰基化和糖基化, 以及DNA甲基化修飾[3,4]. 而組蛋白乙?；cDNA甲基化的交互調(diào)控通過調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和沉默來影響疾病的發(fā)生發(fā)展[5].本文就組蛋白乙酰化和DNA甲基化的交互調(diào)控對肝臟炎癥反應(yīng)的影響作一述評, 以期深入闡明表觀遺傳調(diào)控肝臟炎癥反應(yīng)的分子機制.

1 組蛋白乙?；{(diào)控肝臟炎癥反應(yīng)

組蛋白去乙?；?histone deacetylases, HDACs), 顧名思義是修飾結(jié)合染色體上的經(jīng)典組蛋白分子的酶, 包括組蛋白H3、組蛋白H4, 這些組蛋白上存在豐富的賴氨酸(lysine, 縮寫為“K”)位點, 如H3上的第9個賴氨酸位點H3K9容易被乙?；?acetylization, 縮寫為“ac”)修飾,則簡稱為“H3K9ac”. 但隨著深入的研究發(fā)現(xiàn), HDACs也可修飾非組蛋白, 這些組蛋白/非組蛋白上存在著數(shù)量不一的賴氨酸位點, 這些位點被乙酰化修飾的程度也各不相同. 例如, 作為晚期炎癥介質(zhì)的非組蛋白的高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1, HMGB1)同樣也可以受乙?；{(diào)控, 當(dāng)核定位序列(nuclear localization sequence, NLS)中的lysine被高度乙?；瘯r, 其與染色質(zhì)結(jié)合疏松, 可由細胞核轉(zhuǎn)移入細胞質(zhì), 并使其在細胞質(zhì)內(nèi)聚集從而不能進入細胞核, 此時分泌至胞外的HMGB1增多, 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)也隨之增強[6].

本課題組長期從事組蛋白乙?；{(diào)控與肝臟炎癥反應(yīng)的相關(guān)研究, 肝衰竭的發(fā)生發(fā)展的實質(zhì)是肝臟內(nèi)巨噬細胞參與的“二次打擊”[7], 我們發(fā)現(xiàn)不管是廣譜的HDACs抑制劑Entinostat(MS-275)、Trichostatin A(TSA),Ⅰ類HDAC分子HDAC2的特異性抑制劑Santacruzamate A(CAY10683), 還是Ⅱ類HDAC分子HDAC6的特異性抑制劑Ricolinostat(ACY-1215)均可抑制肝衰竭過程中內(nèi)毒素(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的M1型巨噬細胞活化[8-11]. 深入的機制研究發(fā)現(xiàn), 這些HDACs酶或是調(diào)控組蛋白H3/H4, 或是調(diào)控非組蛋白核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor-κB, NF-κB)來影響炎癥相關(guān)途徑[9]. 組蛋白乙?；{(diào)控肝臟炎癥反應(yīng)的過程中也存在諸多值得深入研究的問題, 如組蛋白H3/H4本身也可作為炎性因子誘導(dǎo)肝臟炎癥反應(yīng)[12], 但這些組蛋白是否源于細胞核, 其出核胞外釋放的機制是否與HMGB1類似除了被乙?；揎? 其他類型的表觀遺傳修飾是否也可誘導(dǎo)這些組蛋白胞質(zhì)移位越來越多參與炎癥反應(yīng)的分子, 如三羧酸循環(huán)中與M1型巨噬細胞活化能量代謝有關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控分子異檸檬酸脫氫酶-1(isocitrate dehydrogenase-1,IDH1)也可直接受乙酰化調(diào)控, 但這些分子上的哪些賴氨酸位點容易受乙?；{(diào)控都值得深入研究.

同時對于肝臟感染性炎癥, 我們發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)患者肝臟炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重, 其血液、外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)及肝臟組織內(nèi)的HDACs活性越高[8,13,14], 且經(jīng)恩替卡韋(entecavir, ETV)抗病毒治療24 wk后, 慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者肝臟的炎癥程度明顯降低并伴有HDAC2、HDAC6及組蛋白H3的水平下降, 這說明在在抗病毒治療過程中乙肝病毒的脫氧核糖核酸(HBV DNA)的變化與組蛋白H3乙?；潭扔嘘P(guān)[14]. 至于組蛋白H3的乙酰化修飾主要發(fā)生在HBV復(fù)制過程中哪一個關(guān)鍵分子(如乙HBV X基因(HBx)、前基因組RNA(pregenomicRNA, pgRNA)、環(huán)狀DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA) )上； H3上幾號賴氨酸位點容易發(fā)生乙酰化修飾； 除了乙酰化修飾H3上的賴氨酸位點, 其他修飾方式如甲基化修飾是否也改變H3的構(gòu)象； 除H3之外的其他組蛋白是否同樣也被修飾, 都有待進一步研究. 但可以肯定的是, 自Pollicino等[15]首次發(fā)現(xiàn)組蛋白H3與H4均可直接與cccDNA發(fā)生結(jié)合, 改變H3/H4的乙酰化程度就可間接地調(diào)控HBV cccDNA微小染色體的轉(zhuǎn)錄水平以來. 科學(xué)家得出啟示, 只要改變結(jié)合在cccDNA上H3/H4的水平就可影響cccDNA的轉(zhuǎn)錄水平, 不管是乙?；€是其他方式的表觀遺傳調(diào)控. 故Rivière等[16]發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1對組蛋白H3上第9號賴氨酸進行3甲基化修飾(簡稱“H3K9me3”)來改變cccDNA染色質(zhì)結(jié)構(gòu), 進而調(diào)控HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄水平.

2 DNA甲基化調(diào)控肝臟炎癥反應(yīng)

DNA甲基化是指基因組CpG島二核苷酸第5位碳原子在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methylation, DNMT)的催化下結(jié)合一個甲基基團, 其產(chǎn)物稱為5-甲基胞嘧啶(5-mC). CpG島是人類基因組二核苷酸富含序列, 通常位于基因啟動子區(qū)域. 甲基化程度越高, 其轉(zhuǎn)錄活性越低； 而去甲基化可使基因的轉(zhuǎn)錄活性增強. 越來越多的證據(jù)表明, DNA甲基化調(diào)控巨噬細胞在慢性炎癥、炎癥性疾病中發(fā)揮著重要作用[17]. 而肝臟炎癥反應(yīng)對于肝衰竭、肝纖維化、非酒精性脂肪肝等疾病的發(fā)生發(fā)展都明顯的促進作用.

DNMT1抑制劑5-aza-2'-deoxycytidine(5-azadC)干預(yù)LPS誘導(dǎo)的RAW264. 7巨噬細胞中發(fā)現(xiàn), 細胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1,SOCS1)啟動子甲基化水平減少, SOCS1表達升高, 抑制Janus激酶2(janus kinase 2, JAK2)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)信號通路, 減少了炎性因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、白細胞介素6(interleukin 6, IL-6)的釋放, 抑制組織炎癥損傷[18]. 因此,在肝臟炎癥反應(yīng)過程中運用DNMT1抑制劑是否可以減輕炎性損傷則有待進一步研究.

分離四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的肝臟巨噬細胞, 通過DNA甲基化測序發(fā)現(xiàn)了與CpG島相關(guān)的26個基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài), 其中鑒定出的脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶相互作用蛋白2(proline serine threonine phosphatase interacting protein 1, PSTPIP2)基因高甲基化狀態(tài)由DNMT3a和DNMT3b介導(dǎo), PSTPIP2的去甲基化狀態(tài)可增強PSTPIP2的表達, 誘導(dǎo)替代性活化巨噬細胞(M2型巨噬細胞)極化抑制肝纖維化中經(jīng)典活化巨噬細胞(M1型巨噬細胞)極化, 來減輕小鼠肝臟炎癥反應(yīng), 進而緩解肝纖維化[19]. 故DNMT同樣可以通過調(diào)控巨噬細胞的極化影響肝纖維化的轉(zhuǎn)歸.

同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是H2S的前體, 其通過胱硫醚β-合酶(cystathionine β-synthase)和胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase, CSE)催化的轉(zhuǎn)硫途徑形成,并且可用作炎癥的新型調(diào)節(jié)劑. Hcy可抑制巨噬細胞中CSE的表達和H2S的產(chǎn)生, 引起CSE啟動子區(qū)DNMT和DNA甲基化水平的增加[20]. 深入研究發(fā)現(xiàn), CSE啟動子區(qū)富含CpG島, 可被DNA甲基化修飾, 有助于巨噬細胞中CSE轉(zhuǎn)錄和H2S產(chǎn)生的減少, 從而促進動脈粥樣硬化的發(fā)展[21]； 同樣地, 在肝臟脂質(zhì)代謝障礙引起的炎癥反應(yīng)過程中, 甲基化修飾CSE是否也可作為肝臟脂質(zhì)代謝類疾病潛在的治療靶點則有待進一步研究.

3 DNA甲基化與乙酰化交互調(diào)控肝臟炎癥反應(yīng)

早在1998年Nature發(fā)文報道了DNA甲基化與乙?；换プ饔玫奈镔|(zhì)基礎(chǔ), 即基因啟動子區(qū)域的CpG島被甲基化修飾時, 甲基化DNA特異性的轉(zhuǎn)錄抑制分子甲基CpG結(jié)合蛋白2(methyl CpG binding protein 2, MeCP2)則可與甲基化的CpG結(jié)合, 隨后與SIN3轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白家族成員A(SIN3 transcription regulator family member A, Sin3A)結(jié)合, 并進一步與異二聚體Mad/Max形成復(fù)合物, 募集HDACs[22]. 但進一步研究發(fā)現(xiàn), DNA甲基化與組蛋白乙?；苯哟嬖诟苯拥年P(guān)聯(lián)： DNMT1 686-812氨基酸殘基可與HDAC1直接結(jié)合, HDAC1催化區(qū)域內(nèi)的150-242氨基酸殘基可與DNMT1結(jié)合[23].

除了此之外參與DNA羥甲基化過程的DNA去甲基化酶(ten-eleven translocation, TET)同樣也可以與HDAC直接相互作用, 而DNA羥甲基化是指5-mc在DNA TET2的作用加一個羥基形成5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC). 研究發(fā)現(xiàn), TET2特異性識別CpG的半胱氨酸(cysteine, Cys)與雙鏈B螺旋(double stranded b helix, DSBH)兩個鋅指結(jié)構(gòu)可與HDAC2結(jié)合[24]. 并在LPS誘導(dǎo)的機體免疫應(yīng)答期間, TET2的缺失會導(dǎo)致晚期炎癥介質(zhì)IL-6的升高, 深入研究發(fā)現(xiàn), TET2能特異性靶向調(diào)控IL-6啟動子核因子κB抑制因子ζ(nuclear factor-kappa B inhibitor kinase ζ, IκBζ), 而此過程并不賴DNA甲基化和羥甲基化作用, 而是通過募集組蛋白去HDAC2抑制IL-6的轉(zhuǎn)錄[24]. HDAC抑制劑(HDAC inhibitor, HDACi)可以使哺乳動物基因組去甲基化, 研究表明, DNMT1的表達雖然不受HDACi depsipeptide影響, 但depsipeptide對p16、SALL3和GATA4基因甲基化的影響包括以下兩方面：(1)depsipeptide可以直接減少DNMT1與多腫瘤抑制基因1(multiple tumor suppressor 1, MTS1, 也稱p16)、轉(zhuǎn)錄因子Sal-likeprotein3(SALL3)和GATA結(jié)合蛋白4(GATA4)等基因啟動子的結(jié)合, 引起這些分子的去甲基化； (2)通過抑制組蛋白DNMT G9a和SUV39H1的表達, 導(dǎo)致這些基因啟動子周圍H3K9的二甲基化和三甲基化程度的降低, 進而引起這些分子表達的增加[25].

DNA甲基化與組蛋白乙酰化可聯(lián)合調(diào)控疾病的發(fā)生發(fā)展. 研究發(fā)現(xiàn), DNMT抑制劑(DNMT inhibitor,DNMTi)5-Aza 2-deoxycytidine與HDACi TSA聯(lián)合運用可通過抑制c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)-細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)通路和激活STAT3-組蛋白TET JMJD3(JmjC domain containing protein 3)通路, 減輕內(nèi)毒素血癥引起的急性肺損傷(acute lung injury, ALI)[26]. 由于HDACi和DNMTi被證明能夠影響免疫系統(tǒng), 表觀遺傳藥物和免疫抑制劑的組合被認(rèn)為是一種有前景的癌癥治療[27,28]. 其他臨床前研究與臨床試驗表明HDACis是化學(xué)增敏劑, 增加了化療藥的治療下癌細胞的敏感性[29-31].HDACi和DNMTi治療在與化療藥物聯(lián)合使用時已顯示出療效[32]. 目前, HDACi與DNMTi的聯(lián)合運用治療急性髓細胞性白血病(acute myeloid leukemia, AML)已進入臨床實驗階段[33,34], 但聯(lián)合運用的機制仍在爭論中, 但可以肯定的, 聯(lián)合治療對轉(zhuǎn)錄本的影響明顯大于任一處理單獨調(diào)節(jié)的基因的總和, HDACi與DNMTi的聯(lián)合運用具有協(xié)同效應(yīng)[35].

對于肝臟相關(guān)炎癥的干預(yù), 通過調(diào)控乙?；瘉碛绊慏NA甲基化或是通過DNA甲基化影響乙?；膱蟮垒^少, HDACi與DNMTi的聯(lián)合運用也尚處于空白階段. 因此, 在肝臟炎癥反應(yīng)過程中, 單獨通過改變組蛋白乙?；蚴荄NA甲基化則勢必影響對方的生物學(xué)效應(yīng)改變,研究表觀遺傳調(diào)控的交互作用勢在必行. 表觀遺傳調(diào)控的交互作用在免疫抑制劑治療肝臟自身免疫性肝炎的過程中是否同樣可以加用HDACi或是DNMTi, 或是HDACi與DNMTi的聯(lián)合運用? 肝臟內(nèi)的“二次打擊”引起的免疫炎癥級聯(lián)反應(yīng)是否同樣也適用? 病毒性肝炎活動期肝細胞受損過程中HDACi與DNMTi的聯(lián)合調(diào)控是否可減輕肝臟受損程度? 都值得深入研究.

4 結(jié)論

肝臟炎癥反應(yīng)是肝臟疾病慢性化的關(guān)鍵誘導(dǎo)因素, 調(diào)控炎癥相關(guān)分子的表達對炎癥的發(fā)生尤為重要. 肝臟炎癥反應(yīng)過程中的表觀遺傳調(diào)控特別是組蛋白乙?；恼{(diào)控與DNA甲基化負調(diào)控, 可從蛋白質(zhì)的翻譯水平即DNA的轉(zhuǎn)錄水平影響基因的表達. 組蛋白乙?；cDNA甲基化之間無明確的級聯(lián)調(diào)控關(guān)系, 一般可通過交互作用或協(xié)同作用影響基因的表達. 同時, HDACi與DNMTi的聯(lián)合運用具有協(xié)同效應(yīng), 兩者聯(lián)用抑或是配合其他化療藥物的實用, 在治療惡性腫瘤的臨床實驗階段中已初具成效. 但在肝臟炎癥甚至是肝臟疾病中的研究, HDACi與DNMTi的聯(lián)合運用尚處于空白階段. 因此對于肝臟炎癥反應(yīng)過程, 分別明確組蛋白乙?；cDNA甲基化的基礎(chǔ)調(diào)控作用, 深化探討兩者交互作用的分子機制, 明確HDACi與DNMTi聯(lián)合用藥的科學(xué)內(nèi)涵, 則有著廣闊的運用前景.