宋 健，黎 萍，袁桂紅，賈 真，張榮琳，王發(fā)寶，鐘國(guó)柄，李依倪，鐘敦璟

宋健，黎萍，袁桂紅，張榮琳，李依倪，鐘敦璟，海南省腫瘤醫(yī)院消化內(nèi)鏡科 海南省?？谑?570123

賈真，海南省腫瘤醫(yī)院麻醉科 海南省?？谑?570123

王發(fā)寶，海南省腫瘤醫(yī)院病理科 海南省?？谑?570123

鐘國(guó)柄，海南省腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 海南省?？谑?570123

核心提要： 胃癌(gastric cancer, GC)組織及胃液DNA中吞噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白1(engulfment and cell motility 1, ELMO1)基因啟動(dòng)子區(qū)均呈高甲基化狀態(tài), 在早期GC中即明顯升高, 具有較好的特異性和敏感性. ELMO1基因甲基化異化可作為GC早期診斷的分子靶標(biāo), 檢測(cè)胃液DNA中ELMO1基因甲基化異化可用于GC的早期診斷.

0 引言

胃癌(gastric cancer, GC)是一種消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤,其發(fā)病率在我國(guó)居第二位, 死亡率居第一位, 早期診斷困難. GC的發(fā)病機(jī)制與基因啟動(dòng)子甲基化等表觀遺傳學(xué)改變密切相關(guān)[1-3], 近幾年國(guó)外有研究表明, 吞噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)基因在GC患者中呈高甲基化狀態(tài), 但能否作為GC的分子診斷靶標(biāo)尚無(wú)定論[4,5]. 胃液中含有大量的胃黏膜脫落細(xì)胞及其DNA, 檢測(cè)胃液中的DNA甲基化能較病理活檢具有更好的敏感性[6]. 本研究對(duì)慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、GC患者病理組織及胃液中ELMO1基因甲基化水平進(jìn)行檢測(cè), 旨在探討ELMO1基因甲基化能否作為GC的分子診斷標(biāo)記物, 為GC的早期診斷提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病例入組及取材： 本研究選取2017-01/2018-08海南省腫瘤醫(yī)院內(nèi)鏡中心診治的胃病患者77例, 其中男性40例, 女性37例, 年齡35-75歲, 平均年齡56.3歲±12.5歲；所有患者在此之前均未接受放射、化學(xué)治療及生物免疫治療. 納入標(biāo)準(zhǔn)： 經(jīng)病理診斷為慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎及GC患者, 前兩組各20例. GC組37例, 其中早期GC15例及進(jìn)展期GC22例. 胃炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)按中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì). 中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見(jiàn)(2017年, 上海)[7], GC的診斷標(biāo)準(zhǔn)按中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì). 原發(fā)性GC診療指南(2017.V1)[8]. 排除患有其他系統(tǒng)腫瘤、其他胃腸系統(tǒng)疾病及其他器官衰竭等疾病的患者. 在胃鏡檢查過(guò)程中用集液器收集每例患者胃液10 mL置于15 mL凍存管, 同時(shí)用活檢鉗鉗取每例患者的病理組織,胃炎患者病理標(biāo)本取胃竇、胃體各2塊, GC患者取病變部位5塊, 距離病變部位5 cm處2塊. 胃液標(biāo)本-80 ℃保存?zhèn)溆? 胃炎組織標(biāo)本留取胃竇1塊10%甲醛固定行病理檢查, GC組織標(biāo)本留取2塊10%甲醛固定后行病理檢查,其余組織標(biāo)本-80 ℃保存?zhèn)溆? 此研究符合醫(yī)學(xué)研究倫理規(guī)范, 獲海南省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn), 所有患者知情同意并簽署知情同意書. 三組患者在一般基線資料上無(wú)明顯差異(P＞0.05), 具有可比性(表1).

1.1.2 主要儀器和試劑： PCR擴(kuò)增儀(Long Gene公司MyGene MG96+型)； 離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司LG16-WA型)； 凝膠電泳儀(北京六一儀器廠DYY-6C型)； 凝膠成像儀(Gel Ocumentuteon systern Beosens SC 805型). EZ DNA Methylation-GoldTMKit (zymo research Catalog Nos. D5005)； ZymoTaq PreMix (zymo research Catalog Nos. E2003)； Quick-DNATMUniversal Kit (zymo research Catalog Nos. D4068)

1.2 方法 將各組胃液于4 ℃, 1000 g, 離心10 min, 棄掉沉渣留上清液, 將上清液再次于4 ℃, 10000 g, 離心20 min,留取沉淀物用于DNA抽提. 各組組織樣本保存在DNA保護(hù)劑中, 提取DNA. 步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書Quick-DNATMUniversal Kit (zymo research Catalog Nos. D4068). DNA純度分析采用核酸蛋白分析儀, 采用凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè). 之后進(jìn)行DNA亞硫酸鹽修飾, 針對(duì)修飾前后的序列差異用MethPrimer軟件設(shè)計(jì)甲基化與未甲基引物, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 引物序列(表2). 本研究采用雙蒸水作為空白對(duì)照. PCR反應(yīng)采用ZymoTaqTMPre Mix試劑盒, 反應(yīng)體系為25μL, 反應(yīng)條件為： 95 ℃, 預(yù)變性5 min, 循環(huán)體系為94 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共進(jìn)行40個(gè)循環(huán), 之后72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存. PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè).

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 22統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析, 計(jì)量資料以mean±SD表示, 采用t檢驗(yàn)； 計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)、Mann-WhitneyU檢驗(yàn)及Fisher's精確檢驗(yàn),P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 各組病理組織中ELMO1基因甲基化水平 各組病理組織中ELMO1基因MSP電泳結(jié)果(圖1和圖2). 慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎組、GC組及癌旁組織ELMO1基因甲基化率分別為0%、20%、93.3%、96.7%, 前三者兩兩比較差異顯著(P＜0.01)； GC與癌旁組織DNA中無(wú)顯著差異(P＞0.05).

2.2 各組胃液中ELMO1基因甲基化水平 各組胃液中ELMO1基因MSP電泳結(jié)果(圖3). 在胃液DNA中ELMO1基因甲基化率分別為： 慢性淺表性胃炎組0%, 慢性萎縮性胃炎組10%, GC組76.7%, 前二者比較顯著差異(P＜0.05), 前兩者分別與GC組比較差異顯著(P＜0.01). 早期GC與進(jìn)展期GC患者胃液ELMO1基因甲基化率分別為73.3%、80.0%, 兩者比較差異不顯著(P＞0.05).

2.3 GC患者ELMO1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與臨床病理因素的關(guān)系 15例早期GC與22例進(jìn)展期GC患者組織中ELMO1基因甲基化率分別為86.7%、100%, 兩者無(wú)顯著差異(P＞0.05), 與腫瘤臨床分期、大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無(wú)明顯相關(guān)性(表3).

統(tǒng)計(jì)分析： Mann-WhitneyU檢驗(yàn)(年齡)； Fisher's精確檢驗(yàn)(性別, 腫瘤分期, 腫瘤大小, 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)

3 討論

近年研究表明, 早期GC患者的5年生存率超過(guò)90%, 中晚期GC患者的5年生存率則降至20%-30%[9,10]. 早期干預(yù)對(duì)于GC患者具有重要意義, 但由于缺乏GC早期的獨(dú)特臨床診斷特征及指標(biāo), 早期GC的診斷率不到15%, 多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期, 大大降低了生存率, 因此,尋找有效的早期診斷指標(biāo)對(duì)于提高GC患者的生存率具有重要意義[11,12]. 目前GC的早期診斷依賴于對(duì)包括慢性胃炎黏膜萎縮、腸上皮化生及異常增生等在內(nèi)的癌前病變的追蹤隨訪. 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn), 以DNA甲基化為代表的表觀遺傳學(xué)可在腫瘤的診斷及預(yù)后中具有重要作用[13,14].ELMO1基因, 是進(jìn)化上非常保守的一種序列, 主要介導(dǎo)細(xì)胞的吞噬、移動(dòng)和形態(tài)改變.ELMO1在包括肺癌、乳腺癌、食管腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、橫紋肌肉瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中有不同程度的異常表達(dá), 且與腫瘤的臨床分期及預(yù)后密切相關(guān), 是與腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)的基因之一[15-20], 其在GC發(fā)生中的作用機(jī)制還不清楚.

表1 患者的一般資料情況

表2 ELMO1引物序列

圖1 非萎縮性胃炎及萎縮性胃炎組織ELMO1甲基化特異性PCR電泳結(jié)果.

圖2 胃癌及癌旁組織ELMO1甲基化特異性PCR電泳結(jié)果.

表3 胃癌ELMO1甲基化與臨床病理因素關(guān)系

圖3 ELMO1甲基化特異性PCR檢測(cè)各組胃液中的結(jié)果.

GC的甲基化異化基因能否作為GC的分子診斷靶標(biāo)文獻(xiàn)報(bào)道較少, 目前還沒(méi)文獻(xiàn)報(bào)道有明確可靠的甲基化分子靶標(biāo)用于GC的基因診斷. 2017年P(guān)irini等[4]報(bào)道,通過(guò)對(duì)胃鏡活檢標(biāo)本進(jìn)行全基因組甲基化指數(shù)(GDMI)及聯(lián)合檢測(cè)IRF4,ELMO1,CLIP4and MSC啟動(dòng)子區(qū)甲基化, 發(fā)現(xiàn)GDMI大于4及RF4,ELMO1,CLIP4and MSC啟動(dòng)子區(qū)高甲基化對(duì)于GC風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)具有較大的價(jià)值.

胃液中含有大量的胃黏膜脫落細(xì)胞及其DNA, 易于獲取, 是進(jìn)行GC分子診斷的良好標(biāo)本. 在我國(guó)人口眾多, GC是高發(fā)腫瘤, 但現(xiàn)有的GC篩查方法包括血清學(xué)及胃鏡檢查費(fèi)用較高, 且不易在人群中推廣和接受,如能在胃液中找到理想的GC診斷分子靶標(biāo), 通過(guò)胃管法獲取胃液進(jìn)行GC分子靶標(biāo)的檢測(cè), 對(duì)于人群GC的篩查具有更好的接受度和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益比. 2016年Yamamoto等[6]報(bào)道, 通過(guò)對(duì)GC患者組織及胃液DNA中BARHL2基因甲基化研究發(fā)現(xiàn)：BARHL2基因甲基化異化在GC患者中敏感性達(dá)到90%, 特異性達(dá)到100%, 但未見(jiàn)后續(xù)研究報(bào)道. 我們也進(jìn)行了該基因的類同研究, 但結(jié)果是BARHL2基因在GC、癌旁及慢性胃炎中均呈高甲基化狀態(tài), 沒(méi)有特異性, 不能作為GC的分子診斷靶標(biāo).

本文研究了ELMO1基因在慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎及GC和癌旁組織及相應(yīng)胃液中該基因甲基化情況, 及其與GC患者腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系. 研究結(jié)果表明： GC患者病理組織及胃液DNA中ELMO1基因啟動(dòng)子區(qū)均呈高甲基化狀態(tài), 并有較高的一致性, 并且在早期GC中即明顯升高, 在慢性非萎縮性胃炎患者中無(wú)甲基化發(fā)生, 在慢性萎縮性胃炎患者中有少量甲基化發(fā)生, 在GC患者中ELMO1幾乎均發(fā)生甲基化, 提示ELMO1基因甲基化可作為GC的分子診斷靶標(biāo). 我們的研究結(jié)果表明在早癌GC患者胃液中進(jìn)行ELMO1基因甲基化檢測(cè)具有較高的敏感性和特異性,可作為早期GC的診斷方法.ELMO1在萎縮性胃炎的患者中也有20%的甲基化率, 提示該基因甲基化對(duì)GC的發(fā)生有一定的預(yù)警作用. GC患者ELMO1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與性別、臨床病理分期、腫瘤部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無(wú)明顯相關(guān)性. 另外癌旁組織中ELMO1基因同樣發(fā)生高甲基化, 并與癌組織基本一致, 其發(fā)生機(jī)制尚不明確, 需要進(jìn)一步研究.

綜上所述,ELMO1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化在GC組織中具有很高的發(fā)生率, 并且在早癌GC中既可發(fā)生, 可作為GC早期診斷的分子靶標(biāo). 在胃液中檢測(cè)ELMO1基因甲基化可用于GC的早期診斷； 在胃鏡檢查的同時(shí)留取胃液檢測(cè)ELMO1甲基化的改變有助于提高GC的診斷率及預(yù)測(cè)GC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn). 同時(shí), 可通過(guò)胃管法留取胃液進(jìn)行GC的無(wú)癥狀人群篩查, 避免胃鏡檢查的痛苦及提高經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益.ELMO1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島也可作為GC治療的一個(gè)潛在藥物靶點(diǎn), 為GC的早期診斷和治療提供新的思路與理論依據(jù).

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

胃癌(gastric cancer, GC)是我國(guó)發(fā)病率和死亡率分別位于第二位和第一位的惡性腫瘤, GC的預(yù)后與診斷時(shí)的疾病階段密切相關(guān). 在早期發(fā)現(xiàn)時(shí), GC通常是可治愈的,5年生存率大于90%, 而晚期GC的預(yù)后很差, 5年生存率僅為20-30%. 早期GC被定義為癌組織局限于胃黏膜或黏膜下層(不論有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移), 由于沒(méi)有特異性癥狀,僅有不到20%的GC被診斷為早期GC. 胃鏡是目前GC早期診斷的金標(biāo)準(zhǔn), 但由于我國(guó)人口眾多、胃鏡檢查接受度差及內(nèi)鏡醫(yī)師缺乏等, 不能作為GC早篩、早診的手段. 近年來(lái)腫瘤基因甲基化的研究為腫瘤早期診斷帶來(lái)了曙光, 部分腫瘤的甲基化基因診斷已進(jìn)入臨床應(yīng)用,并取得了較好的經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益. 近年有文獻(xiàn)報(bào)道吞噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)基因在GC患者中呈高甲基化狀態(tài), 但能否作為GC的分子診斷靶標(biāo)尚無(wú)定論. 本文對(duì)慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、GC患者病理組織及胃液中ELMO1基因甲基化水平進(jìn)行研究, 旨在探討ELMO1基因甲基化能否作為GC的分子診斷標(biāo)記物以及胃液能否用于檢測(cè)標(biāo)本.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

本文研究的主題是ELMO1基因在慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、GC組織及胃液DNA中甲基化異化情況. 擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題是ELMO1基因甲基化異化是否具有GC特異性和敏感性, 在胃液DNA中可否檢測(cè)到ELMO1基因甲基化異化, 以及其能否作為GC的分子診斷靶標(biāo). 問(wèn)題的解決將為GC的早期診斷提供一種新的方法.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本研究的主要目標(biāo)是ELMO1基因甲基化異化是否具有GC特異性和敏感性, 對(duì)于早期GC是否具有診斷價(jià)值,以及胃液可否用于ELMO1基因甲基化異化的診斷標(biāo)本.如實(shí)驗(yàn)達(dá)成這三個(gè)目標(biāo), 將為早期GC的分子靶標(biāo)診斷研究及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

實(shí)驗(yàn)方法

以慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、GC患者(包括早期GC及進(jìn)展期GC)為研究對(duì)象, 胃鏡檢查同時(shí)收集胃液及組織標(biāo)本. 通過(guò)甲基化特異聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)檢測(cè)三組患者組織及胃液DNA中ELMO1基因甲基化水平, 并進(jìn)行組間對(duì)比分析, 并分析ELMO1基因甲基化異化與GC的發(fā)生、分期及轉(zhuǎn)移的關(guān)系等.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是ELMO1基因甲基化率在慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎及GC組分別為0%、20%、93.3%,差異顯著(P＜0.01)； 在胃液DNA中依次為： 0%、12.3%、76.7%, 差異顯著(P＜0.05). 癌旁組織DNA中ELMO1基因甲基化率為96.7%, 與GC組比較差異不顯著(P＞0.05)； 早期GC與進(jìn)展期GC患者組織中ELMO1基因甲基化率分別為86.7%、100%, 兩者胃液中ELMO1基因甲基化率在分別為73.3%、80.0%, 兩者在胃液及組織中比較均無(wú)顯著差異(P＞0.05).ELMO1基因甲基化異化與GC的臨床分期、大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無(wú)明顯相關(guān)性. 本實(shí)驗(yàn)達(dá)成了實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo),ELMO1基因甲基化異化在GC患者組織及胃液DNA中具有較高的特異性和敏感性, 為早期GC的分子靶標(biāo)診斷研究及臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

GCELMO1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化異化具有特異性, 在GC組織及胃液中檢測(cè)其甲基化異化具有敏感性, 并且在早期GC中也具有較高敏感性,ELMO1基因甲基化可作為GC早期診斷的分子靶標(biāo), 并且胃液可作為ELMO1基因甲基化檢測(cè)的良好標(biāo)本. 本研究為GC的分子靶標(biāo)診斷及臨床應(yīng)用進(jìn)行了探索, 為以后GC甲基化分子靶標(biāo)在糞便及血液等標(biāo)本的檢測(cè)研究奠定了基礎(chǔ).

展望前景

本研究入組實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)偏少, 需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 需要更進(jìn)一步細(xì)化研究, 如慢性萎縮性胃炎中不典型增生或腸上皮化生與早期GC的差異, 為臨床提供更科學(xué)的數(shù)據(jù)支撐. 下一步將擴(kuò)大樣本量研究,并進(jìn)一步研究血液及糞便中該基因甲基化異化情況, 并建立該基因甲基化高通量定量檢測(cè)方法, 為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ).