朱 鳳，劉星星，范 恒

朱鳳，劉星星，范恒，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科 湖北省武漢市 430022

核心提要： 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白6(NLR family, pyrin domain containing6, Nlrp6)促進IL-18及抗菌肽的分泌, IL-18可抑制IL-22BP的產(chǎn)生,增強IL-22作用, 并通過MyD88通路來促進上皮細胞增殖； Nlrp6還可通過Toll-like receptors調(diào)節(jié)杯狀細胞分泌Mucoprotein2, 清除腸道細菌, 調(diào)節(jié)腸道免疫功能及維持腸道菌群穩(wěn)態(tài).

0 引言

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)為累及回腸、結(jié)腸、直腸的一種特發(fā)性腸道炎癥性疾病, 主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(crohn's disease, CD). 其臨床表現(xiàn)以腹痛、腹瀉及黏液膿血便為主, 癥狀易反復發(fā)作, 難以治愈, 且有一定的癌變傾向[1]. 該病多發(fā)于青少年, 在歐美國家發(fā)病率較高.近年我國發(fā)病率有增加趨勢, 可能與我國人民生活方式改變有關(guān)[2]. 目前普遍認為IBD的發(fā)病機制是由環(huán)境因素和腸道菌群共同作用, 激活遺傳易感個體腸道黏膜的免疫應答, 引發(fā)一系列的炎癥反應, 使腸黏膜中的抗炎和促炎介質(zhì)失衡, 導致腸黏膜的病理改變. IBD目前的藥物治療主要包括氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)劑等, 配合調(diào)整患者生活方式, 但治療效果不理想, 且存在一定的副作用. 因此, 深入研究IBD的發(fā)病機制對于創(chuàng)新治療方法及治療藥物具有重要的臨床意義.

固有免疫應答是機體抵抗病原體的第一道防線,亦是獲得性免疫應答的基礎(chǔ). 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding and oligomerization domainlike receptors, NLRs)家族是近年來研究比較多的一個參與免疫應答的龐大的炎癥蛋白家族, 在細胞凋亡、炎癥、腫瘤等方面發(fā)揮著重要作用. 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白6(NLR family, pyrin domain containing6, Nlrp6)是NLRs家族中一個比較特殊的成員, 目前對其有一定的研究, 但其功能和作用機理尚未完全明確. 本文就Nlrp6在IBD中的作用機制研究進展作一綜述.

1 NLRs家族

NLRs家族是一類存在于細胞質(zhì)內(nèi)的模式識別受體, 可以識別結(jié)合某些病原體或其產(chǎn)物所共有的高度保守的病原相關(guān)分子模式, 通過激活NF-κB、IFNr和其它炎性信號來促進免疫反應, 參與機體免疫應答[3]. 目前發(fā)現(xiàn)NLRs家族蛋白在人類有23種, 在小鼠有34種[4,5]. NLRs家族主要由氨基端(N端)結(jié)構(gòu)域、NOD結(jié)構(gòu)域、羧基端(C端)富含亮氨酸的重復序列三部分組成. N端為效應結(jié)構(gòu)域, 介導蛋白質(zhì)相互作用, 參與免疫應答[6]. 不同類型NLRs分子因為其N端結(jié)構(gòu)域不同, 有其特定下游信號轉(zhuǎn)導通路. 根據(jù)N端結(jié)構(gòu)域不同, 目前NLRs家族分子分成四類[7]： (1)Ⅱ類反式激活因子, 調(diào)節(jié)主要組織相容性復合體MHCⅡ類分子的表達； (2)NOD1和NOD2, 主要功能是識別細菌肽聚糖亞單位, 并激活NF-κB信號通路發(fā)生免疫應答[8]； (3)白細胞介素-1β轉(zhuǎn)化酶蛋白激酶激活因子；(4)NLR家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白(NLR family, pyrin domain containing, NLRP). NLRs家族主要參與調(diào)節(jié)腸道的免疫信號通路和微生物菌群, 影響腸道的炎癥的發(fā)生[9,10].

2 Nlrp6蛋白的結(jié)構(gòu)及功能

Nlrp6是第一個被發(fā)現(xiàn)的抑制天然免疫反應相關(guān)信號通路的NLRs蛋白家族成員, 其編碼基因位于人11號染色體. 在腸道組織中, Nlrp6高表達于腸上皮細胞和肌成纖維細胞等非造血細胞[11]. Nlrp6可與含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)和含CARD結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing CARD,ASC)通過N端PYD結(jié)構(gòu)域的蛋白-蛋白連接作用組成細胞內(nèi)多聚蛋白復合物(即Nlrp6炎癥小體), 最終產(chǎn)生白細胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-18等細胞因子, 參與炎癥反應和免疫應答[12,13].

在Nlrp6缺失型小鼠中觀察到Nlrp6的功能是抑制NF-κB和MAPK的活化, 從而發(fā)揮促進凋亡、抑制炎癥及腸道組織增殖的作用[14,15]. Nlrp6缺失型小鼠體內(nèi)的巨噬細胞在細菌感染時對NF-κB的激活增加, 并伴有NF-κB和MAPK依賴性細胞因子、趨化因子分泌增加, 免疫細胞數(shù)目明顯增加, 通過激活Toll樣受體(multiple tolllike receptors, TLR), 增強NF-κB和MAPK信號轉(zhuǎn)導的活化, 說明Nlrp6可能在識別病原體后抑制TLR通路, 防止炎癥擴大[16]. NF-κB相關(guān)細胞因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和IL-6在Nlrp6缺失型小鼠體內(nèi)顯著升高[11], TNF-α和IL-6可以激活腸上皮細胞STAT3途徑促進腫瘤的發(fā)生[17,18]. ASC與其他Nlrp蛋白共表達并不能激活Caspase-1前體, 表明Nlrp6能夠有效地激活Caspase-1前體, 促使細胞發(fā)生凋亡, 阻止細胞的無限增殖, 抑制腫瘤發(fā)生[19].

近年來, Ranson等[20]觀察到Nlrp6在人類CD中上調(diào),但在人類UC中沒有顯著程度上調(diào). 相反, Alipour等[21]發(fā)現(xiàn)IBD亞群中Nlrp6表達有降低的趨勢, 但這沒有達到統(tǒng)計學意義. 進一步研究表明, 在CD和UC患者的上皮層中Nlrp6的表達降低. 動物模型進一步證實了Nlrp6表達與腸屏障完整性之間的關(guān)聯(lián). 在小鼠的WAS(避水應激)誘導的小腸炎癥(腸炎)中報道了Nlrp6水平降低[22]. 然而, 在結(jié)腸炎小鼠模型中Nlrp6的表達尚不完全清楚. 由此可見, Nlrp6在調(diào)節(jié)腸道免疫功能和維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)中的作用日益受到重視, 研究Nlrp6炎性小體及其配體有助于深入探討UC的發(fā)病機制.

3 Nlrp6/IL-18信號通路在調(diào)節(jié)IBD腸道免疫功能和維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用

Nlrp6炎性小體導致蛋白水解切割和激活caspase-1, 之后釋放促炎細胞因子IL-18[23]. 為了評估Nlrp6對結(jié)腸炎的影響, 進行了幾種使用Nlrp6-/-小鼠的研究[24,25]. 在該實驗中, Nlrp6-/-小鼠顯示出對DSS誘發(fā)的結(jié)腸炎增強的易感性. 研究人員還觀察到IL-18的水平降低了. 此外, 使用16SrRNA分析腸道菌群組成揭示了Nlrp6-/-小鼠腸道中更多的致癌微生物群. 我們了解到, 炎癥小體的激活導致多重下游效應, 包括通過蛋白水解切割產(chǎn)生活化形式的前IL-18. Levy等[26]發(fā)現(xiàn)敲除IL-18導致結(jié)腸炎嚴重程度和腸道細菌群落的顯著惡化, 類似于Nlrp6-/-小鼠. 這些結(jié)果表明, Nlrp6對腸道細菌群落的影響可能部分取決于IL-18, 且IL-18在DSS誘導的結(jié)腸炎中具有保護作用. Kempster等[27]認為病態(tài)的IL-18過度激活存在差異. 然而, IL-18的不同表達也可能導致關(guān)于IL-18在NEC中的作用的“沖突”.觀察發(fā)生在回腸中的環(huán)狀物, 而不是它在DSS誘導的結(jié)腸炎中的作用(大多數(shù)嚴重的遠端結(jié)腸). 為此, Nlrp6在小鼠結(jié)腸上皮細胞中的缺乏改變了糞便微生物, 其特征是細菌門擬桿菌和TM7[11]. Seregin等[28]證明使用不依賴于上皮損傷和修復的IBD替代模型, Nlrp6通過限制IL-10-/-小鼠致結(jié)腸炎病菌 A.muciniphila的定植來預防結(jié)腸炎的發(fā)展. 在腸道中, AMP是參與該組織的先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分. Nlrp6可以調(diào)節(jié)“健康”宿主-微生物界面的機制, 從IgA和粘液分泌到AMP產(chǎn)生[29,30].

由此可見在IBD中, Nlrp6炎性小體信號通路主要是通過產(chǎn)生細胞因子IL-18來介導免疫功能和維持腸道菌群穩(wěn)態(tài). 深入研究Nlrp6/IL-18通路的作用機制, 有利于揭示腸道免疫紊亂和菌群失調(diào)在UC發(fā)病中的作用.

4 Nlrp6-Muc2軸對結(jié)腸上皮細胞免疫功能和微生物菌群的影響

在UC患者和DSS誘導的結(jié)腸炎小鼠中, 可以觀察到結(jié)腸上皮細胞中杯狀細胞通常被耗盡, 粘液合成和分泌減少[31,32]. 在腸道病原體清除實驗中, 固有層物質(zhì)會被微生物和病原體穿透[33]. Wlodarska等[9]觀察到與野生型小鼠相比, Nlrp6缺陷小鼠的C.rodentium負荷和病理變化增加. ASC-/-和caspase-1/11-/-小鼠也表現(xiàn)出無法清除C.rodentium. 這些結(jié)果表明Nlrp6炎性體激活是宿主防御A/E病原體感染的關(guān)鍵. Muc2粘蛋白是由杯狀細胞產(chǎn)生的大型糖蛋白, 形成先天宿主防御的第一線[34].Muc2-/-小鼠會發(fā)生自發(fā)性結(jié)腸炎并且不能阻止從黏膜表面附著和去除粘附的病原體[35]. Nlrp6在整個腸黏膜中高表達, 特別是在杯狀細胞中. 該發(fā)現(xiàn)表明Nlrp6調(diào)節(jié)粘液分泌, 進一步的研究表明, Nlrp6-/-小鼠的腸上皮細胞表現(xiàn)出顯著的杯狀細胞增生. 然而, 杯狀細胞粘液顆粒分泌受到抑制, 缺乏厚的連續(xù)覆蓋的內(nèi)部黏膜層[9].

有報道指出, Nlrp6僅調(diào)節(jié)粘液顆粒和腸上皮的融合以及粘液的分泌, 但不影響粘液的表達. 自噬對于Paneth細胞、破骨細胞和肥大細胞的功能至關(guān)重要[36-38]. 同樣,在Nlrp6-/-小鼠的上皮中缺乏可見的自噬體形成, 表明自噬過程是由Nlrp6介導的粘液顆粒分泌所必需的過程.此外, caspase-1/11-/-和ASC-/-小鼠的杯狀細胞顯示明顯缺乏粘液分泌.

通常, 腸道內(nèi)部粘液層將結(jié)腸細胞與微生物群分離,這樣就可以阻止細菌接觸隱窩, 破壞其結(jié)構(gòu)及功能[39].Birchenough等[40]報道細菌的流入增加了隱窩附近TLR配體的濃度并激活了前杯狀細胞(sentinel goblet cells,senGCs), 這是在Nlrp6炎性體激活之前, 由內(nèi)吞作用下游的TLR-MyD88信號通路傳導引起的. 這導致Ca2+信號傳導驅(qū)動化合物Muc2分泌、GJ依賴性細胞信號傳導的產(chǎn)生、功能性GC的Muc2分泌和活化的senGC的排出.這種方式清除了隱窩中的細菌, 從而保護下部隱窩和腸干細胞免受細菌侵入. Nlrp6控制senGC排出, 并促進活化的senGC誘發(fā)細胞間信號傳導, 最終誘導相鄰功能性GC中的Muc2分泌.

圖1 Nlrp6調(diào)節(jié)腸道免疫功能和維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)的多種機制.

由此可見, Nlrp6對于腸道上皮細胞的杯狀細胞表達Muc2粘液蛋白具有重要作用, 而Muc2可以調(diào)節(jié)腸道免疫及微生物, 保護腸道黏膜, 故Nlrp6-Muc2軸對治療IBD可以提供新的治療思路.

5 Nlrp6在IBD炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌中的調(diào)節(jié)作用

眾所周知, IL-22可以促進上皮細胞增殖[41]. 作為可溶性IL-22受體, IL-22BP特異性結(jié)合IL-22并阻止IL-22與IL-22的結(jié)合膜結(jié)合IL-22R1可抑制上皮細胞增殖[42].Castleman等[43]表明人腸道微生物群(包括共生細菌)間接調(diào)節(jié)結(jié)腸ILC3功能以誘導IL-22, IL-22通過其對上皮屏障的功能性作用促進腸內(nèi)穩(wěn)態(tài). 當腸道上皮屏障完整性受損時, 例如人類免疫缺陷病毒感染和IBD, 來自腸腔的微生物易位到固有層中, 誘導多種潛在的致病性免疫應答. Huber等[44]發(fā)現(xiàn)Nlrp6炎性小體導致IL-18依賴性降低, IL-22BP的下調(diào), 從而增加上皮細胞增殖. 此外, IL-18還通過MyD88信號通路促進上皮細胞增值. 通過用AOM或DSS治療誘導的結(jié)腸炎相關(guān)癌癥小鼠模型,Nlrp6-/-小鼠比野生型小鼠發(fā)展出更多更大的腫瘤[45]. 在該研究中, 作者首次闡述了Nlrp6在腫瘤發(fā)展中的保護作用. 進一步的研究表明, Nlrp6下調(diào)上皮細胞增殖的相關(guān)因子, 包括Wnt和腫瘤中的Notch靶基因[46]. 正如上述研究報道的那樣, Nlrp6可調(diào)節(jié)腸道菌群的組成. 在Nlrp6-/-小鼠中攜帶的致結(jié)腸炎腸道微生物群落和微生物群誘導的趨化因子(C-C基序)配體5(CCL5)一起通過IL-6途徑局部激活促進上皮細胞增殖[47].

結(jié)直腸癌(CRC)是消化系統(tǒng)最常見的癌癥之一, 但很多有關(guān)CRC發(fā)展的潛在分子機制仍然未知[48]. 一個主要的風險因素CRC的發(fā)展是IBD的延長. 進一步證明NF-κB激酶依賴性途徑的經(jīng)典抑制劑對于腫瘤的生長和進展至關(guān)重要, 突出了CRC發(fā)病過程中炎癥的重要性[49,50].腸道微生物群落使一個復雜的生態(tài)系統(tǒng), 最近顯示出對動物模型和人類的健康和疾病有很大的影響[51-54]. 腸道微生物群被認為影響IBD的發(fā)病機制, 因為抗生素和益生菌的治療可以改善某些IBD亞組患者的疾病癥狀[55].此外, 最近證實IBD患者的腸道微生物群的一些成員豐度降低, 包括厚壁菌門和擬桿菌[56,57]. 牛鏈球菌/溶血弧菌, 產(chǎn)腸毒素細菌脆弱體和大腸桿菌NC101已被認為是CRC的危險因素[58,59]. 此外, 一些小鼠模型中的自發(fā)性腸炎在無菌環(huán)境中無法發(fā)展[60]. Hu等[46]證明了Nlrp6-/-和ASC-/-小鼠含有一種在WT小鼠中可傳染的腸道菌群微生物群落, 它可以導致結(jié)腸炎惡化. 在這里, 使用(AOM)-DSS誘導的結(jié)腸炎相關(guān)CRC模型(CAC), 證明了WT小鼠與Nlrp6-/-和ASC-/-共養(yǎng)發(fā)展為炎癥誘導的CRC作用的戲劇性增強趨勢, 其通過誘導IL-18改變其介導的微生物群落和由此誘導的CCL5依賴性結(jié)腸炎癥和IL-6途徑的激活. 由于IBD的持續(xù)炎癥刺激容易導致癌變, 形成CRC, 因此, 預防和及時治療IBD可以有效控制CRC的發(fā)生. 由此可知, Nlrp6通過IL-18影響腸道微生物菌群, 進一步通過CCL-5及IL-6的激活影響IBD相關(guān)性CRC的發(fā)生發(fā)展. 因此, 此實驗研究對于我們治療IBD相關(guān)性CRC具有臨床指導意義.

6 結(jié)論與展望

Nlrp6通過作用于caspase-1產(chǎn)生IL-18, 從而促進AMPs的分泌, 清除腸道細菌, 調(diào)節(jié)腸道免疫功能及維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)； IL-18還可抑制IL-22BP的產(chǎn)生, 增強IL-22作用, 并通過MyD88通路來促進上皮細胞增殖； Nlrp6通過TLR調(diào)節(jié)杯狀細胞分泌Muc2粘蛋白, Muc2也可調(diào)節(jié)腸道免疫及微生物, 保護腸黏膜(圖1). Nlrp6可通過各種途徑影響腸道免疫及菌群穩(wěn)態(tài), 而這正是IBD的主要致病原因. 因此, 深入研究Nlrp6作用機制, 有助于揭示IBD發(fā)病機制. 由于IBD有一定癌變傾向, Hu[46]發(fā)現(xiàn)Nlrp6可作用于NOTCH及Wnt靶點, 激活CCL5及IL-6信號通路, 調(diào)節(jié)上皮細胞增殖, 影響IBD相關(guān)性CRC. Nlrp6在腫瘤的形成中也具有保護作用. Nlrp6的表達已被人提出作為結(jié)腸腺癌檢測的診斷標記物[61]. 由上可知, 目前的研究證據(jù)顯示Nlrp6參與維持上皮屏障的完整性、促進腸上皮傷口愈合、抑制腸上皮過度增殖和細胞凋亡, 并在炎癥、腫瘤等多種疾病發(fā)生發(fā)展中具有抑制作用. 因此,Nlrp6及其相應細胞因子的表達水平可以作為IBD及相關(guān)腫瘤的一個很有價值的生物標記物和治療的靶點.