潘靜，覃月秋，徐晨陽，梁云軒，宋嗣恩，季科，楊復(fù)鏘，周喜漢，黃贊松

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西百色533000)

急性胰腺炎(AP)是臨床常見的急腹癥，近年來發(fā)病率逐漸升高。目前，AP的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。炎癥反應(yīng)、異常自噬及凋亡可能在AP的發(fā)病中起著重要作用。作為經(jīng)典炎癥因子，白細(xì)胞介素6(IL－6)、IL－10對維持機(jī)體促炎—抗炎平衡狀態(tài)起著重要的作用［1]。淋巴細(xì)胞自噬、凋亡異常可使AP機(jī)體淋巴細(xì)胞亞群減少，免疫功能下降［2，3]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)、凋亡相關(guān)因子半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3(Caspase－3)分別是調(diào)控細(xì)胞自噬、凋亡最重要的因子，LC3、Caspase－3水平的升高提示機(jī)體自噬、凋亡系統(tǒng)異常激活［4，5]。目前炎癥反應(yīng)與淋巴細(xì)胞自噬、凋亡異常在AP發(fā)病機(jī)制中的相互作用機(jī)制尚不清楚，炎癥信號傳導(dǎo)機(jī)制激活，導(dǎo)致自噬、凋亡異常激活，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，可能是AP患者免疫功能受損的重要原因之一。我們觀察了 AP患者外周血 IL－6、IL－10、LC3、Caspase－3水平，并分析其與患者淋巴細(xì)胞自噬、凋亡的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月～2018年12月間右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的AP患者73例，其中輕癥急性胰腺炎(MAP，MAP組)25例，男15例、女10 例，年齡(48.56 ±14.16)歲;中度重癥急性胰腺炎(MSAP，MSAP組)25例，男14例、女11例，年齡(48.60 ±12.65)歲;重癥急性胰腺炎(SAP，SAP組)23例，男 15例、女 8例，年齡(49.52±16.47)歲。AP診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會2013年制訂的《中國急性胰腺炎診治指南》［6]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除合并腫瘤、肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病患者、自身免疫性疾病、妊娠或哺乳期婦女。另選擇健康體檢者25例為對照組，其中男12例、女13例，年齡(44.32±4.99)歲。各組年齡、性別比例具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)同意，納入者均簽署知情同意書。

1.2 試劑及儀器 FACS Calibur流式細(xì)胞儀、淋巴細(xì)胞凋亡FITC Annexin V Apoptosis Detection KitⅠ熒光雙染試劑、自噬試劑Autophagy Assay Kit以及溶血素均購于美國 BD公司，人IL－6(EHC007(H).96)、IL －10(EHC009(H).96)試劑檢測盒購于欣博盛科技有限公司，人LC3(m1062954.96)試劑檢測盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，人Caspase－3(CSB－E08856h－96T)試劑檢測盒購于武漢華美生物工程有限公司。

1.3 各組血清 IL－6、IL－10檢測 采用 ELISA法。AP患者入院24 h內(nèi)采集外周血5 mL，對照組于體檢時采集外周血5 mL，采用多功能酶標(biāo)儀檢測兩組IL－6、IL－10，操作步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品光密度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終測算血清IL－6、IL－10。重復(fù)3次，取平均值。

1.4 各組血清LC3及淋巴細(xì)胞自噬情況觀察①血清 LC3檢測：采用 ELISA法檢測各組血清LC3，所有操作均同“1.3”，重復(fù)3次，取平均值。②淋巴細(xì)胞自噬率測算：取各組外周血，淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，1×Wash buffer清洗細(xì)胞1次，離心后棄上清;加入適量的1×Wash buffer重懸細(xì)胞，計數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106mL;加入MDC Stain 100 μL，輕輕混勻，37 ℃避光孵育15 min，加入 Collection buffer400 μL重懸細(xì)胞，1 h內(nèi)于流式細(xì)胞儀中測算各組淋巴細(xì)胞自噬率(于FSC－SSC點(diǎn)圖設(shè)矩形門R1排除碎屑，再作MDC FL1H－SSC點(diǎn)圖，以正常對照組右側(cè)象限3%細(xì)胞設(shè)矩形門R2，并復(fù)制R2于各病例組點(diǎn)圖中統(tǒng)計R2陽性率改變，即為AP患者自噬率)。重復(fù)3次，取平均值。

1.5 各組血清Caspase－3及淋巴細(xì)胞凋亡情況觀察 ①血清Caspase－3檢測：采用ELISA法檢測各組血清Caspase－3，所有操作均同“1.3”，重復(fù)3次，取平均值。②淋巴細(xì)胞凋亡率測算：取各組外周血，分離淋巴細(xì)胞，將其配成淋巴細(xì)胞數(shù)為1×106～5 ×106/mL;加入Annexin－V FITC、PI各5 μL，避光孵育15 min，加入1×buffer 400 μL重懸細(xì)胞，1 h于流式細(xì)胞儀測算各組淋巴細(xì)胞凋亡率(流式細(xì)胞儀散點(diǎn)圖活細(xì)胞百分率位于左下象限FITC－/PI－，壞死細(xì)胞百分率位于右上象限FITC+/PI+，凋亡細(xì)胞百分率位于右下象限FITC+/PI－)。重復(fù)3次，取平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。計量資料用±s表示，兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。AP患者血清IL－6、IL－10水平與血清LC3、Caspase－3水平的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清 IL－6、IL－10水平比較 MAP、MSAP、SAP組及對照組血清IL－6分別為(8.37±2.27)、(15.08 ± 3.90)、(27.90 ± 7.45)、(4.91 ±1.24)pg/mL，血清 IL －10 分別為(20.51 ±4.74)、(15.61 ± 3.67)、(10.64 ± 4.12)、(5.87 ± 4.05)pg/mL。與對照組比較，MAP、MSAP、SAP組血清IL－6、IL－10水平升高，與 MAP組比較，MSAP組血清IL－6水平升高、IL－10水平降低(P均＜0.05)，與MSAP、MAP組比較，SAP組血清 IL－6水平升高、IL－10水平降低(P 均 ＜0.05)。

2.2 各組血清LC3水平及淋巴細(xì)胞自噬率比較MAP、MSAP、SAP組及對照組血清 LC3分別為(211.09 ± 80.19)、(382.69 ± 61.65)、(548.37 ±229.06)、(180.75 ± 55.43)pg/mL，與 MSAP、MAP及對照組比較，SAP組血清LC3水平升高(P均＜0.05);與MAP組、對照組比較，MSAP組血清 LC3水平升高(P 均 ＜0.05)。MAP、MSAP、SAP組及對照組淋巴細(xì)胞自噬率分別為10.42% ±2.64%、15.46% ± 3.27%、25.81% ± 5.39%、9.34% ±2.67%，與MAP、MSAP組及對照組比較，SAP組淋巴細(xì)胞自噬率升高(P均＜0.05)，與MAP組、對照組比較，MSAP組淋巴細(xì)胞自噬率升高(P均 ＜0.05)。

2.3 各組血清Caspase－3水平及淋巴細(xì)胞凋亡率比較 MAP、MSAP、SAP組及對照組血清Caspase－3 分別為(1.68 ±0.63)、(4.67 ±2.31)、(6.36 ±1.91)、(1.42 ±0.52)ng/mL，與 MSAP、MAP 及對照組比較，SAP組血清Caspase－3水平升高(P均＜0.05);與MAP及對照組比較，MSAP組血清Caspase－3水平升高(P 均 ＜0.05)。MAP、MSAP、SAP 組及對照組淋巴細(xì)胞凋亡率分別為3.12% ±1.35%、6.01% ±2.41、8.73% ±4.58%、2.41% ± 1.06%，與MAP、MSAP組及對照組比較，SAP組淋巴細(xì)胞凋亡率升高(P均＜0.05)，與MAP組、對照組比較，MSAP組淋巴細(xì)胞凋亡率升高(P均＜0.05)。

2.4 AP患者血清IL－6、IL－10水平與血清 LC3、Caspase－3水平的相關(guān)性 MSAP、SAP組患者血清IL－6水平與血清LC3、Caspase－3水平呈正相關(guān)(r分別為 0.990 4，0.981 3，P 均 ＜ 0.05;r分別為 0.978 5，0.987 0，P 均 ＜0.05)，血清 IL －10 水平與血清LC3、Caspase－3水平呈正相關(guān)(r分別為0.933 1，0.973 2，P 均 ＜0.05;r=0.987 8，0.866 3，P 均 ＜0.05)。

3 討論

目前認(rèn)為，多種炎癥介質(zhì)參與了AP炎癥反應(yīng)過程，包括 TNF －α、IL －6、IL －1、黏附分子、血小板活化及趨化因子等促炎因子，以及IL－10、IL－4、轉(zhuǎn)化生長因子－β1(TGF－β1)等抗炎因子［7]。作為經(jīng)典炎癥因子，IL－6主要介導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)以及急性期反應(yīng)及造血功能，在機(jī)體免疫反應(yīng)中可以通過刺激IL－10分泌而起到抗炎作用［8];IL－10可抑制局部和系統(tǒng)炎癥，能夠減輕AP患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，兩者在AP發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AP各組血清IL－6水平均較對照組升高，SAP組較MSAP、MAP組升高;MSAP組較MAP組升高。AP各組血清IL－10水平均較對照組升高，但SAP組較MSAP及MAP組低;MSAP組較MAP組低。說明在AP患者早期機(jī)體即存在炎癥反應(yīng)，隨著病情進(jìn)展，大量炎癥介質(zhì)被激活，促炎因子不斷釋放，IL－6水平不斷升高，機(jī)體炎癥反應(yīng)劇烈，胰腺損傷越重，此時抗炎因子IL－10作為保護(hù)性機(jī)制亦隨之升高［10]。在AP早期，機(jī)體釋放的IL－10尚足以抵抗炎癥因子所致的損傷，促炎－抗炎反應(yīng)仍處于平衡狀態(tài)。當(dāng)發(fā)展為SAP，炎癥反應(yīng)不斷加劇，IL－10不斷消耗，當(dāng)抗炎因子IL－10水平釋放不足、過度消耗時，IL－10水平降低，可使促炎－抗炎反應(yīng)失衡，進(jìn)一步引發(fā)SIRS，SAP病情進(jìn)一步加重。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，IL－6、IL－10水平與AP病情嚴(yán)重程度相關(guān)。

近年研究［11]發(fā)現(xiàn)，劇烈炎癥反應(yīng)、異常自噬及凋亡在AP發(fā)生發(fā)展中起重要作用，AP尤其是SAP機(jī)體存在劇烈炎癥反應(yīng)，隨著大量炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，機(jī)體免疫受損，出現(xiàn)免疫抑制;而過度自噬、凋亡導(dǎo)致淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，AP免疫功能受損，易誘發(fā)感染、膿毒癥等，加重病情［12]。AP時持續(xù)過度的炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致腺泡細(xì)胞Ca2+濃度增加、氧化應(yīng)激加重，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的瀑布樣釋放，引起自噬、凋亡異常激活，使AP病情加重［13]。本研究檢測了AP患者及對照組血清LC3、Caspase－3水平、淋巴細(xì)胞自噬率及凋亡率，結(jié)果顯示SAP組血清LC3、Caspase－3水平、淋巴細(xì)胞自噬率及凋亡率較對照組、MAP組及 MSAP組升高，MSAP組較MAP及對照組升高，差異具有顯著性，而MAP組較對照組僅輕度升高，與對照組比較差異無顯著性。提示在MSAP及SAP中存在LC3、Caspase－3水平異常升高，自噬、凋亡增強(qiáng)。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示MSAP及SAP患者外周血LC3、Caspase－3水平與自噬率、凋亡率呈顯著正相關(guān)。隨著LC3、Caspase－3水平的升高，AP自噬率、凋亡率增加。提示MSAP尤其是SAP患者體內(nèi)LC3、Caspase－3水平表達(dá)升高，淋巴細(xì)胞自噬、凋亡激活。相關(guān)分析結(jié)果還顯示，MSAP、SAP組 IL－6、IL－10水平與 LC3、Caspase－3水平呈顯著正相關(guān)，說明隨著炎癥因子IL－6、IL－10水平升高，機(jī)體炎癥反應(yīng)加劇，促使LC3、Caspase－3表達(dá)增強(qiáng)，機(jī)體淋巴細(xì)胞自噬及凋亡增加，AP病情加重。因此，有效控制炎癥反應(yīng)，降低LC3、Caspase－3表達(dá)水平，抑制淋巴細(xì)胞異常自噬、凋亡，將有可能成為改善AP尤其是SAP患者病情的有效方法。

綜上所述，MAP、MSAP、SAP 患者血清 IL －6、IL－10、LC3、Caspase－3 水平均升高。MAP、MSAP、SAP患者炎癥反應(yīng)水平升高，淋巴細(xì)胞自噬、凋亡水平增強(qiáng)。MSAP、SAP血清IL－6、IL－10水平與血清LC3、Caspase－3水平呈正相關(guān)。血清 IL－6、IL－10可能促進(jìn)AP患者淋巴細(xì)胞的自噬、凋亡，在AP的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。