汪濤，劉梅，楊華良，李德冠

(1天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院，天津300100;2北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所)

腫瘤切除術(shù)后盆腔內(nèi)、外放射治療是治療女性子宮頸癌及子宮內(nèi)膜癌的重要輔助手段［1]，而盆腔惡性腫瘤放療野因包含消化道結(jié)構(gòu)，而消化道上皮細(xì)胞的增殖活躍，易受到放、化療的影響，進(jìn)而出現(xiàn)小腸、結(jié)腸和直腸等消化道不良反應(yīng)，這些不良反應(yīng)會(huì)限制患者放、化療的最大耐受劑量，降低治療效果。輕者癥狀可耐受并能自行愈合，重者癥狀持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間且伴有出血、狹窄或形成瘺，嚴(yán)重者可導(dǎo)致患者死亡［2，3]。放療不良反應(yīng)可發(fā)生在治療中任意時(shí)間，腸道急性不良反應(yīng)常發(fā)生于治療前幾周，數(shù)月或數(shù)年后會(huì)發(fā)生慢性損傷，而晚期不良反應(yīng)往往代表持久而不可逆的放療相關(guān)組織改變［4]。目前臨床對(duì)于放射性腸道損傷的藥物治療主要為對(duì)癥，2018年《中國(guó)放射性直腸炎診治專家共識(shí)》［5]中推薦的藥物治療方案包括腸炎急性期使用柳氮磺胺吡啶等藥物，使用抗生素、益生菌、洛哌丁胺等口服治療腹瀉癥狀，使用硫糖鋁、糖皮質(zhì)激素等保留灌腸治療出血。最新研究［6，7]認(rèn)為，中藥是預(yù)防與治療放射性腸炎的有效方法之一，特別是中藥保留灌腸，灌腸液一方面可直接注入直腸，在腸黏膜處直接吸收，藥物局部濃度高，起效快;另一方面，藥物混合于直腸液中，經(jīng)直腸靜脈直接進(jìn)入體循環(huán)，避免肝臟首過(guò)效應(yīng)，在發(fā)揮局部治療作用的同時(shí)還具有全身治療作用［8]。為此，我們依據(jù)中醫(yī)理論證型自擬放射性腸炎灌腸組方，并觀察其灌腸對(duì)急性放射性腸炎模型小鼠腸道黏膜屏障修復(fù)及治療作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物、試劑及儀器 C57BL/6J小鼠64只，SPF級(jí)，雌性，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，體質(zhì)量20.0～22.0 g。所有動(dòng)物均在同等條件下飼養(yǎng)，自由飲水和攝食。自擬放射性腸炎灌腸液組方為黃芩、黃連、黃柏、白花蛇舌草、白頭翁、蒲公英、粉葛、秦皮、生地榆、敗醬草、烏藥、延胡索。

1.2 急性放射性腸炎模型制備及自擬放射性腸炎灌腸液灌腸方法 小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、照射組、預(yù)防組和治療組，每組各16只。對(duì)照組不予照射，照射組、預(yù)防組和治療組接受腹部局部12 Gy(137Cs γ射線輻射源，購(gòu)自加拿大原子能有限公司，劑量率為0.99 Gy/min)照射1次制備急性放射性腸炎模型。預(yù)防組在照射前3天起用自擬放射性腸炎灌腸，1次/d，造模當(dāng)日繼續(xù)灌腸4 d，共灌腸7次;治療組在造模當(dāng)日當(dāng)日用自擬放射性腸炎灌腸，1次/d，共灌腸7次;對(duì)照組、照射組自造模當(dāng)日均予等量生理鹽水灌腸，共灌腸7次。灌腸方法為由肛門插入軟管約4 cm，然后注入灌腸液0.3 mL(經(jīng)人－鼠等效量折算［9])，留置20 s后拔出灌腸器，再將小鼠倒置30 s，小鼠無(wú)需麻醉。

1.3 各組小鼠小腸組織隱窩細(xì)胞數(shù)及絨毛形態(tài)、長(zhǎng)度測(cè)算 造模第3天時(shí)各組均取6只小鼠，頸椎脫臼處死小腸組織制作石蠟塊。采用蘇木素－伊紅法進(jìn)行HE染色，Image J 1.37分析軟件測(cè)算各組小腸絨毛隱窩細(xì)胞數(shù)。另取部分小腸組織，免疫組化Villin染色后抗原微波修復(fù)，封片，Image J 1.37分析軟件觀察小腸絨毛形態(tài)、測(cè)算小腸絨毛長(zhǎng)度。重復(fù)3次，取平均值。

1.4 各組小鼠生存情況觀察 觀察各組小鼠造模第15天時(shí)生存情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小腸組織隱窩細(xì)胞數(shù)比較 對(duì)照組小腸隱窩深遂，而照射組小腸隱窩排列發(fā)生變化，隱窩深度降低，預(yù)防組和治療組隱窩排列情況要優(yōu)于照射組。

對(duì)照組、照射組、預(yù)防組和治療組小腸組織隱窩細(xì)胞數(shù)分別為(16.90 ± 5.55)、(6.90 ± 3.51)、(10.30 ±2.21)、(3.40 ±2.91)個(gè)/cm，與對(duì)照組比較，照射組、預(yù)防組和治療組小鼠小腸組織隱窩細(xì)胞數(shù)降低(P均＜0.05)，與照射組比較，預(yù)防組小鼠小腸組織隱窩細(xì)胞數(shù)升高，治療組小腸組織隱窩細(xì)胞數(shù)降低(P均＜0.05)。

2.2 各組小腸組織絨毛形態(tài)及長(zhǎng)度比較 對(duì)照組小腸絨毛上皮細(xì)胞整齊，形態(tài)正常，排列有序，腺體豐富。照射組小腸絨毛長(zhǎng)度明顯比對(duì)照組腸絨毛長(zhǎng)度減少，照射組明顯比預(yù)防組腸絨毛長(zhǎng)度少，見(jiàn)圖2。對(duì)照組、照射組、預(yù)防組和治療組小腸組織絨毛長(zhǎng)度分別為(585.32 ±21.39)、(227.22 ±44.36)、(386.43 ±56.48)、(189.42 ±39.90)μm，與對(duì)照組比較，照射組、預(yù)防組和治療組小腸組織絨毛長(zhǎng)度降低(P均＜0.05)，與照射組比較，預(yù)防組小腸組織絨毛長(zhǎng)度升高，(P均＜0.05)。

2.3 各組小鼠生存情況觀察 造模第15天時(shí)，對(duì)照組、照射組、預(yù)防組和治療組小鼠分別存活10、3、5、4只，與對(duì)照組比較，照射組、預(yù)防組和治療組小鼠存活只數(shù)少(P均＜0.05)，與照射組比較，預(yù)防組小鼠存活只數(shù)多(P均＜0.05)。

3 討論

放射性腸炎在古代中醫(yī)文獻(xiàn)中并無(wú)明確記載，但其臨床癥狀與古代中醫(yī)的腸游、泄瀉、痢疾十分相似［10]，2017年發(fā)布的《放射性直腸炎(腸澼)中醫(yī)診療專家共識(shí)》中提出放射性直腸炎中醫(yī)病名命名為“腸澼”，急性期以熱毒傷絡(luò)型多見(jiàn)，慢性期多見(jiàn)寒熱錯(cuò)雜［11]。本研究中使用的灌腸液，處方功效為清熱、涼血、止血、止痛，用以緩解和治療患者由于放射線照射后腸道蘊(yùn)熱、氣血壅滯、濕性黏滯引起的不同程度的腹痛，腹瀉、便血等癥狀。灌腸劑組方中黃芩、黃連、黃柏可清熱燥濕、瀉火解毒;白花蛇舌草利濕通淋;白頭翁、葛根、秦皮可涼血止痢、升陽(yáng)止瀉、收斂止痢;蒲公英消腫散結(jié);地榆涼血止血;敗醬草、烏藥、延胡索可活血、祛瘀、行氣、止痛。組方以收斂、解痙、消炎、保護(hù)腸黏膜、促進(jìn)損傷修復(fù)和止血為主，定位于改善疾病及遠(yuǎn)期療效(預(yù)防復(fù)發(fā))。

小腸絨毛上皮細(xì)胞，特別是隱窩干細(xì)胞，對(duì)放療的早期效應(yīng)非常敏感［12]，雖然在劑量一定限度內(nèi)，小腸可通過(guò)隱窩干細(xì)胞進(jìn)行自我更新使得放射破壞的上皮細(xì)胞得到修復(fù)，但是上皮補(bǔ)償性增值更新不足導(dǎo)致炎癥和黏膜屏障受損，一般在放射治療2～3周時(shí)可出現(xiàn)腹痛、腹瀉等胃腸道相關(guān)癥狀［13]。腸道照射劑量和聯(lián)合同步化療等因素均影響患者發(fā)生放射性腸炎的風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)生急性腸道毒性的患者發(fā)生慢性不良反應(yīng)的也風(fēng)險(xiǎn)增加［14]。機(jī)械屏障是腸道屏障中最為重要的一部分，放射線可損傷腸道黏膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，破壞腸道機(jī)械屏障，使得腸道組織結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生變化。因此，提高上皮細(xì)胞增值、維持腸道黏膜完整對(duì)于放射性腸道損傷的預(yù)防和治療至關(guān)重要。有文獻(xiàn)［15]報(bào)道，與出現(xiàn)放射性直腸炎癥狀后用藥相比，在照射開(kāi)始第一天即用中藥保留灌腸，可有效推遲放射性直腸炎癥狀出現(xiàn)時(shí)間，減輕放射性直腸炎的癥狀。

本研究中，預(yù)防組小鼠小腸隱窩細(xì)胞數(shù)、腸絨毛形態(tài)及絨毛長(zhǎng)度均顯著高于照射組，證實(shí)該自擬放射性腸炎灌腸液可減輕或修復(fù)放射線對(duì)腸黏膜層破壞，對(duì)小鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞具有保護(hù)和修復(fù)作用。而治療組與照射組無(wú)差異，可能由于經(jīng)照射后，小鼠腸道黏膜已經(jīng)破壞，灌腸機(jī)械操作可能加重對(duì)腸道的破壞作用。一項(xiàng)納入25篇中藥保留灌腸與西藥保留灌腸治療放射性直腸炎效果的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的meta分析［16]結(jié)果顯示，與西藥(慶大霉素、甲硝唑、利多卡因、地塞米松等)灌腸相比，干預(yù)至少14天后，中藥灌腸組的臨床總有效率顯著提高，但干預(yù)10天后，2組療效無(wú)差異，作者分析原因可能為干預(yù)時(shí)間較短，尚未達(dá)到藥效發(fā)揮的時(shí)間有關(guān)。本研究結(jié)果中治療組對(duì)腸道防護(hù)效果不優(yōu)于照射組，可能也有用藥時(shí)間較短有關(guān)。受課題經(jīng)費(fèi)等原因，本實(shí)驗(yàn)僅進(jìn)行了腸道機(jī)械屏障損傷的防護(hù)作用研究，后續(xù)還應(yīng)從腸道微生物屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障方面對(duì)灌腸液的放射損傷防護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行闡明。

綜上所述，自擬放射性腸炎灌腸液預(yù)灌腸的急性放射性腸炎小鼠腸道黏膜屏障損傷程度低，發(fā)生急性放射性腸炎的小鼠自擬放射性腸炎灌腸液灌腸后腸道黏膜屏障損傷程度減輕。自擬放射性腸炎灌腸液灌腸對(duì)急性放射性腸炎小鼠腸道黏膜屏障損傷有預(yù)防及治療作用。放射性直腸炎中醫(yī)治療包括中藥口服、灌腸，或口服灌腸并用，但以口服與灌腸并用效果最佳［17]，本研究結(jié)果采用的是單純灌腸，在后期臨床實(shí)踐中，可考慮聯(lián)合應(yīng)用口服和灌腸液，但對(duì)于腸道機(jī)械屏障已經(jīng)嚴(yán)重破壞的患者，不建議灌腸，以免進(jìn)一步破壞腸道黏膜，可能加重臨床癥狀。