溫行，李章富，王輝，孫紹華，郭星，李福才

（中國醫(yī)科大學 1. 基礎醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學教研室，沈陽 110122； 2. 附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科，沈陽 110001）

喉鱗狀細胞癌 （簡稱喉癌） 是人類最常見的頭頸部腫瘤之一，伴有高發(fā)病率和死亡率，而且預后不良［1-2］。因此，探究喉癌的發(fā)生發(fā)展機制，尋找其診斷及預后的生物分子標記物至關重要。miR-200c最早發(fā)現在多種癌細胞系中表達失調，目前，miR-200c是否參與喉癌的發(fā)生和發(fā)展尚不明確。肽基脯氨酰順反異構酶 （peptidyl-prolyl cis/trans isomerase，NIMA-interacting 1，PIN1） 在中心體復制及分離等過程中發(fā)揮著重要作用，在絕大多數人類腫瘤中高表達［3］。前期，本課題組發(fā)現過表達PIN1加劇了Hep-2細胞中心體擴增、細胞分裂異常和細胞遷移。本研究將探討miR-200c對喉癌細胞系Hep-2細胞生物學行為的影響，以及miR-200c是否通過調控PIN1發(fā)揮其生物學功能，為喉癌的診斷、治療和預后分析提供科學依據和線索。

1 材料與方法

1.1 材料

人喉癌細胞系Hep-2；人喉癌組織標本 （取自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科喉癌患者，全部患者術前未行放化療，標本保存于-80 ℃冰箱中，所有標本均經病理學檢查確診，并經醫(yī)學倫理委員會批準及患者知情同意）；RPMI1640培養(yǎng)基 （美國HyClone公司）；qRT-PCR試劑盒 （日本TaKaRa公司）；PIN1和β-actin抗體 （美國Proteintech公司）；BCA測定蛋白濃度試劑盒 （中國碧云天生物技術公司）；蘇木素伊紅 （HE） 染色試劑盒 （中國碧云天生物技術公司）；Transwell 小室 （美國Corning公司） 。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉染：人喉癌細胞系Hep-2細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基 （10%胎牛血清） ，5% CO2，37 ℃孵箱中孵育，24 h更換新鮮培養(yǎng)液。當細胞長滿瓶底后，用0.25%的胰酶消化，進行傳代。取對數生長期的Hep-2細胞接種于6孔板中，待細胞密度達到80%時，進行質粒和小RNAs （miR-200c模擬物、模擬物對照、miR-200c抑制物、抑制物對照） 轉染。

1.2.2 質粒提取：將含有空載質粒和重組質粒pcDNA3.1-PIN1的菌株按照1∶100的比例接種到200 mL LB培養(yǎng)基 （氨芐青霉素，100 μ g/mL） 中，37 ℃，水平震蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。第2天，將200 mL菌液加入離心管中，按TIANGEN質粒提取試劑盒說明書提取質粒。

1.2.3 實時熒光定量PCR：轉染48 h后，加入TRIzol試劑提取RNA。使用全式金miRNA反轉試劑盒和TaKaRa反轉試劑盒合成cDNA。選擇U6和GAPDH作為內參對照，反應條件：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。

1.2.4 Western blotting：轉染48 h后，裂解細胞提取總蛋白。BCA試劑盒測定各樣品蛋白濃度，上樣量為20 μ g。電泳，轉膜，封閉，孵一抗PIN1 （1∶500） ，β-actin （1∶2 000） ，4 ℃搖床過夜，二抗 （1∶5 000）37 ℃恒溫孵育1 h，ECL發(fā)光。應用Image J軟件進行灰度分析。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因實驗：將野生型wtpGL3-PIN1-3’UTR和 突 變 型mut-pGL3-PIN1-3’UTR質粒分別與miR-200c 模擬物和模擬物對照共同轉染至Hep-2細胞，pRL-TK 作為內對照，24 h后收集細胞，應用Promega雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.2.6 CCK8檢測：接種細胞于6孔板中并做相應的轉染后收集細胞，胰酶消化細胞，調整細胞濃度。96孔板每孔加入100 μ L細胞懸液，間隔24 h，檢測前每孔加入100 μ L新鮮培養(yǎng)基 （含10 μ L CCK8試劑） ，培養(yǎng)箱內孵育2 h。測定450 nm處的吸光度 （optical density，OD） 值。

1.2.7 Transwell 實驗：接種細胞于6孔板中進行轉染，轉染后24 h消化細胞，雙無培養(yǎng)基吹成細胞懸液，調整細胞濃度。小室上室加入100 μ L細胞懸液，下室加入650 μ L完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。取出小室，甲醛溶液固定，蘇木素染色。PBS清洗后，用棉簽擦干凈小室，中性樹脂封片。干燥后，顯微鏡10倍物鏡下觀察拍照計數。

1.2.8 免疫熒光實驗：無菌條件下，將TC處理細胞爬片置于12孔板內，并將細胞接種至孔內，24 h內進行細胞轉染。48 h后取出玻片，甲醇溶液固定，丙酮溶液再固定。PBS清洗后，1%BSA封閉液室溫封閉2 h。一抗孵育，4 ℃過夜。PBS清洗玻片，孵二抗，避光37 ℃ 50 min。DAPI復染，PBS避光清洗后進行封片，熒光顯微鏡觀察拍照 （400倍） ，統(tǒng)計中心體異常擴增比例。

1.2.9 細胞凋亡實驗：接種細胞于6孔板中并進行轉染，48 h后胰酶消化細胞。1 000 r/min離心10 min，收集細胞。加入1 mL PBS溶液，輕震懸浮細胞，1 000 r/min離心10 min，棄上清。加入500 μ L 結合緩沖液重懸細胞，加入5 μ L FITC和5 μ L PI，輕輕混勻，室溫避光反應20 min，1 h內進行流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，應用獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計學分析，每組實驗數據均以表示，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-200c與喉癌發(fā)生和發(fā)展的關系

以U6為對照，應用實時PCR檢測了43例喉癌組織和癌旁正常組織中miR-200c的表達水平。其中，32例 （74%） 癌組織中miR-200c的表達量與癌旁組織相比升高 （圖1） 。統(tǒng)計分析結果顯示，喉癌組織中miR-200c的平均表達量 （1.86±0.33） 高于相應的癌旁組織 （0.92±0.46） ，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05） 。此外，在伴有淋巴結轉移的喉癌組織中miR-200c的平均表達量 （0.16±0.06） 顯著低于對照組（0.92±0.46） ，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜ 0.05） 。

2.2 miR-200c抑制喉癌Hep-2細胞遷移、減弱中心體異常擴增

圖1 miR-200c在喉癌組織中的表達水平Fig.1 Expression level of miR-200c in laryngeal carcinoma tissues

在Hep-2細胞中分別轉染miR-200c模擬物、模擬物對照、miR-200c抑制物、抑制物對照，并設空白對照組。應用實時PCR檢測轉染效率，模擬物轉染組中miR-200c的表達水平 （0.61±0.02） 與對照組（0.40±0.06） 相比升高，抑制物轉染組中miR-200c的表達水平 （0.37±0.02） 與對照組 （0.40±0.01） 相比降低，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜ 0.05） ，提示轉染成功。CCK8檢測結果顯示，轉染miR-200c相關小RNAs后，Hep-2細胞的生長速率無明顯差異 （圖2A，P＞ 0.05） 。Transwell小室實驗結果顯示，miR-200c模擬物轉染組穿過小室的Hep-2細胞數 （56.33±16.65） 與對照組（118±19.31）相比顯著減少，而miR-200c抑制物轉染組（321.67±32.72）與對照組 （109±15.10） 相比增多 （圖2B，P＜ 0.05） 。免疫熒光實驗結果顯示，與對照組 （9.34%±0.72%） 相比，miR-200c模擬物轉染組中心體異常擴增的細胞比例 （7.15%±0.35%） 顯著降低，而miR-200c抑制物轉染組 （11.56%±1.29%）與對照組 （9.02%±0.86%） 相比顯著增加 （圖2C，P＜0.05） 。細胞凋亡實驗結果表明，轉染miR-200c相關小RNAs后，Hep-2細胞的早期凋亡率無顯著變化 （圖2D，P＞ 0.05） 。

2.3 miR-200c靶基因的預測和鑒定

應用TargetScan等軟件預測，發(fā)現PIN1mRNA 3’非編碼區(qū) （3’UTR） 111-117位點為miR-200c的結合部位 （圖3A） 。構建野生型和突變型pGL3-PIN1-3’UTR報告基因載體，雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，實驗組熒光素酶活性 （0.05±0.02） 與對照組 （0.10±0.01） 相比顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜ 0.05） 。同時，實時PCR和Western blotting結果顯示，miR-200c 模擬物組中PIN1蛋白表達水平（0.52±0.16） 與對照組 （0.83±0.06） 相比降低，抑制物轉染組中PIN1蛋白表達水平 （1.62±0.16） 與對照組 （1.08±0.24） 相比升高 （圖3B，P＜ 0.05） ，而相應的mRNA表達水平無顯著差異 （P＞ 0.05） 。

2.4 miR-200c通過調控PIN1抑制喉癌Hep-2細胞的遷移和中心體異常擴增

圖2 miR-200c對喉癌Hep-2細胞生物學行為的影響Fig.2 Effect of miR-200c on the biological behavior of Hep-2 cells

圖3 miR-200c靶基因的預測和鑒定Fig.3 Prediction and identification of miR-200c target gene

在Hep-2細胞中共轉染PIN1和miR-200c模擬物，同時分別轉染PIN1、miR-200c模擬物和模擬物對照，并設空白對照組。實時PCR結果顯示，與對照組 （0.41±0.04） 相比，模擬物轉染組中miR-200c的表達水平 （0.63±0.06） 升高 （P＜ 0.05） ，PIN1轉染組中PIN1mRNA表達水平 （0.62±0.08） 與對照組 （0.47±0.03） 相比升高 （P＜ 0.05） ，提示轉染成功。Western blotting結果顯示，共轉染組中PIN1的蛋白表達水平 （1.31±0.24） 與PIN1組 （2.11±0.42）相比降低 （圖4A，P＜ 0.05） 。CCK8檢測結果顯示，Hep-2細胞的生長速率在各組中無明顯差異 （圖4B，P＞ 0.05） 。Transwell小 室 實 驗 結 果 顯 示，共 轉染組中穿過小室的Hep-2細胞數（399±43.86）與模擬物組（72±19.31）相比顯著增多，與PIN1組（523±61.80） 相比顯著減少 （圖4C，P＜ 0.05） 。免疫熒光實驗結果顯示，共轉染組與模擬物組（7.34%±0.27%） 相比，中心體異常擴增的細胞比例（9.95%±0.74%） 升高，與PIN1組 （12.93%±1.37%）相比顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義 （圖4D，P＜ 0.05） 。細胞凋亡實驗結果表明，Hep-2細胞的早期凋亡率在各組中無顯著變化 （圖4E，P＞ 0.05） 。

3 討論

miRNAs作為細胞信號通路的一個重要組成部分，越來越多的證據表明，miRNAs是許多生命活動的主要調控因子，如細胞增殖、分化、凋亡、應激反應和血管生成，它們通過結合多個靶基因的3’UTR區(qū)發(fā)揮作用［4］。研究［5-6］發(fā)現，miR-200家族在不同腫瘤中的表達水平不同，例如，miR-200家族在結直腸癌中表達下調，在卵巢癌中高表達。

圖4 PIN1對Hep-2細胞增殖、遷移、中心體擴增和凋亡的影響Fig.4 Effect of PIN1 on proliferation，migration，centrosome，and apoptosis in Hep-2 cells

miR-200c最先發(fā)現在多種癌細胞系中表達失調［7］。本研究發(fā)現miR-200c在喉癌組織中高表達，提示其參與喉癌的發(fā)生。有研究［8，10］顯示，miR-200c還參與胰腺癌、鼻咽癌和前列腺癌的發(fā)生。此外，miR-200c在伴有淋巴結轉移患者的喉癌組織中低表達，提示miR-200c在腫瘤轉移過程中發(fā)揮作用。Transwell小室實驗結果表明，miR-200c能夠抑制喉癌Hep-2細胞遷移的能力。有研究［11］發(fā)現，結腸癌中，miR-200c過表達后能夠減弱細胞的侵襲和轉移能力。

研究［12-13］表明，miR-200c在腫瘤中是通過其下游靶基因介導發(fā)揮作用的，已被證實的miR-200c靶基因有TKS5、JUN等。本研究中，通過TargetScan等生物信息學軟件預測發(fā)現PIN1mRNA 3’UTR存在miR-200c結合位點，熒光素酶報告基因檢測結果證實PIN1是miR-200c的靶基因之一。本研究還發(fā)現，Hep-2細胞中miR-200c能夠在翻譯水平抑制PIN1的表達。

在多數人類癌癥中，PIN1呈現出表達上調的現象［14，16］。本課題組前期研究發(fā)現PIN1在喉癌中表達上調，下調PIN1的表達抑制了Hep-2細胞的遷移能力，減弱了細胞中心體的異常擴增。有研究［17］發(fā)現，乳腺癌中PIN1能夠通過Ras信號通路增強c-Jun的轉錄活性，增強細胞的遷移能力。研究［18］顯示，中心體在微管組織、信號傳導、極性和細胞分裂中發(fā)揮關鍵作用。目前，中心體失調的時機、機制和影響尚不清楚［19］。有研究［20］報道，PIN1在中心體復制過程中扮演重要角色，PIN1過表達能夠誘導中心體擴增、染色體不穩(wěn)定性和腫瘤發(fā)生。

本研究中，發(fā)現miR-200c能夠通過調控PIN1抑制Hep-2細胞的遷移能力，并降低細胞的中心體異常擴增比例。有研究［21］顯示，過表達miR-200c能夠通過下調E2F3的表達抑制膀胱癌細胞的增殖能力。miR-200c能夠通過下調EDNRA的表達調控胃癌細胞的凋亡過程［22］。本研究結果顯示，miR-200c對喉癌Hep-2細胞的增殖和凋亡過程無顯著影響，推測此差異可能存在組織特異性。

綜上所述，本研究首次發(fā)現miR-200c參與喉癌的發(fā)生，證實PIN1是miR-200c的靶基因之一，發(fā)現miR-200c能夠通過調控PIN1抑制喉癌Hep-2細胞的遷移能力并減弱中心體異常擴增。此研究成果為進一步探討miR-200c作為喉癌診治的新靶標奠定了重要的科學基礎。