許勇民，孫大壯，宋春青，王蕊，董雪松

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，沈陽(yáng) 110001）

百草枯 （paraquat，PQ）化學(xué)名稱為1，1’-二甲基-4，4’-聯(lián)吡啶陽(yáng)離子鹽，是一種非選擇性高效吡啶類接觸性除草劑。目前，它是發(fā)展中國(guó)家使用最頻繁的除草劑之一。自從20世紀(jì)60年代初首次推出以來(lái)，使用PQ引起的問題 （如自殺意圖、意外中毒或職業(yè)暴露等） 經(jīng)常被報(bào)道［1］。PQ經(jīng)皮膚、呼吸道和消化道均可吸收，進(jìn)入體內(nèi)的PQ可迅速分布至各個(gè)器官，從而引起機(jī)體多器官功能損害，其中肺組織是PQ中毒的主要靶器官。肺組織中的濃度是血漿中濃度的6～10倍，并且在血漿中PQ濃度降低時(shí)，仍可在肺內(nèi)維持高濃度狀態(tài)，進(jìn)一步導(dǎo)致肺炎癥反應(yīng)及不可逆性肺纖維化［2］。以往研究［3］顯示，PQ對(duì)肺的毒性主要通過氧化還原反應(yīng)生成活性氧 （reactive oxygen species，ROS） ，導(dǎo)致細(xì)胞氧化還原狀態(tài)失衡而引起氧化應(yīng)激，進(jìn)一步誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) （endoplasmic reticulum，ER） 應(yīng)激及線粒體凋亡途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。PQ中毒目前尚無(wú)有效治療方法，近年來(lái)，很多研究［4-6］針對(duì)減少ROS的生成、清除已生成的ROS和減少炎癥反應(yīng)等方面，但上述治療仍無(wú)法逆轉(zhuǎn)PQ的毒性作用。因此，臨床上迫切需要尋找有效的治療方法。

PQ誘導(dǎo)的肺損傷中氧化應(yīng)激和超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD） 的改變已被廣泛認(rèn)知［5，7］。研究［5，8-9］表明，SOD模擬物有效抑制了PQ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。SOD模擬物通過穿透細(xì)胞并有效清除線粒體中電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)所生成的超氧化物離子，可以使受損的抗氧化防御系統(tǒng)得到修復(fù)。錳-SOD （MnSOD） 是位于線粒體基質(zhì)中的SOD模擬物，MnSOD雜合小鼠對(duì)PQ極其敏感，在果蠅中敲掉MnSOD的RNA后，增加了PQ對(duì)果蠅的毒性［10］。研究SOD模擬物的作用，可以進(jìn)一步了解線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激之間的關(guān)系。

錳 （Ⅲ） -四 （4-N-甲基吡啶基） 卟啉 （MnTMP-yP） 是一種超氧化物歧化酶的模擬物，可以穿透細(xì)胞并有效清除ROS。MnTMPyP可抑制脂多糖誘導(dǎo)的自由基的生成和多巴胺能神經(jīng)變性［11］。MnTMPyP在肝、腎、腦缺血/再灌注過程中對(duì)產(chǎn)成的ROS的清除作用已在以往研究［12-14］中被報(bào)道，然而其在PQ誘導(dǎo)的肺損傷模型中的作用報(bào)道較少。本研究探討了MnTMPyP是否減輕PQ誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞損傷以及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺泡Ⅱ型上皮樣細(xì)胞A549細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。胎牛血清 （美國(guó)Gemini公司） ，RPMI 1640 培養(yǎng)基 （美國(guó)Hyclone公司） ，MnTMPyP（美國(guó)默克集團(tuán)） ，PQ、胰蛋白酶、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR） 檢 測(cè) 試 劑 盒、ECL發(fā) 光液、細(xì)胞裂解液 （碧云天生物技術(shù)研究所） ，MTT、DMSO、BCA蛋白定量試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒、HRP標(biāo)記的山羊抗兔Ig G抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體 （北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司） ，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulatory protein 78，Grp78）、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologus protein，CHOP）、β-actin （美國(guó)Proteintech Group公司） 。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：在A549細(xì)胞中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)條件為含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱。將SOD的模擬物MnTMPyP設(shè)置為干預(yù)因素。實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組，加入RPMI 1640培養(yǎng)液；MnTMPyP組，加入MnTMPyP 10 μ mol/L［14］；PQ組，加入PQ 750 μ mol/L；PQ+ MnTMPyP組，MnTMPyP 10 μ mol/L預(yù)處理90 min，吸棄原液后加入PQ 750 μ mol/L。各組細(xì)胞處理24 h后檢測(cè)以下指標(biāo)。

1.2.2 細(xì)胞活性檢測(cè)：在96孔板內(nèi)加入密度為1×105/mL的A549細(xì)胞，每孔100 μ L，細(xì)胞貼壁后，按照實(shí)驗(yàn)分組加入處理因素繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μ L混勻，在37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，棄上清，加入DMSO 150 μ L，震蕩10 min充分溶解沉淀。酶標(biāo)儀492 nm測(cè)定吸光度值。

1.2.3 DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平：各組細(xì)胞按處理因素處理后，用無(wú)血清的培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞1次，加入用無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶1 000稀釋的DCFHDA （終濃度為10 μ mol/L） 1 mL，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，消化、離心后，無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，流式細(xì)胞儀以激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.2.4 DCFH-DA熒光檢測(cè)：各組細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組處理24 h后，吸棄原液，用無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞1次，加入1∶1 000用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA （終濃度為10 μ mol/L） 500 μ L，在5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，吸出染液后用無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗3次，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度。

1.2.5 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平：細(xì)胞孵育完成后，使用不含EDTA的胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，加入Fluo-3/AM Ca2+熒光探針，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Ca2+熒光強(qiáng)度。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)GR活性檢測(cè)：各組細(xì)胞做相應(yīng)處理后培養(yǎng)24 h，吸取培養(yǎng)液，PBS沖洗2 次，0.25%胰蛋白酶消化，用等量的PBS收集細(xì)胞。超聲細(xì)胞破碎儀破碎裂解細(xì)胞，BCA法蛋白定量后，按照GR活性檢測(cè)試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 Western blotting檢測(cè)Grp78、CHOP蛋白的表達(dá)：收集各組細(xì)胞，以PBS沖洗2次，加入適量預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，震蕩混勻，置冰上進(jìn)行超聲裂解，每次5 s，共2次，促進(jìn)細(xì)胞完全破碎，超聲后在4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清，通過BCA試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，濕電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，膜在室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入TBST稀釋的Grp78、CHOP和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min，3次，加入二抗，室溫孵育2 h。用ECL顯色，最后進(jìn)行顯影、定影。采用Image J圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均采用表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)組間兩兩比較采用Dunnettt檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett T3檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MnTMPyP增加PQ抑制的A549細(xì)胞活性

A549細(xì)胞以不同處理因素處理24 h后，與對(duì)照組相比，MnTMPyP組細(xì)胞活性下降不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞ 0.05） ，表明選用的MnTMPyP干預(yù)濃度無(wú)明顯細(xì)胞毒性。PQ組與對(duì)照組比較，細(xì)胞活性顯著下降 （P＜ 0.01） ，表明該濃度可以有效制作PQ致肺泡上皮細(xì)胞損傷的模型。與PQ組相比，PQ+MnTMPyP組細(xì)胞活性顯著增加 （P＜ 0.01） ，表明MnTMPyP對(duì)PQ引起的細(xì)胞活性下降具有保護(hù)作用。見圖1。

2.2 MnTMPyP減少PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞內(nèi)ROS生成

按不同處理因素處理A549細(xì)胞24 h后，DCFHDA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。與對(duì)照組相比，MnTMPyP組ROS稍增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05） ，PQ組ROS顯著增加 （P＜ 0.01）；與PQ組相比，PQ+MnTMPyP組A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低 （P＜0.01） ，表明MnTMPyP預(yù)處理有效減少A549細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。見圖2。

圖1 各組細(xì)胞處理24 h后MTT法檢測(cè)的細(xì)胞活性Fig.1 Cell viability analyzed with MTT assay after 24-h treatment of cells in each group

2.3 MnTMPyP降低PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平

對(duì)照組和MnTMPyP組細(xì)胞內(nèi)Ca2+無(wú)明顯升高（P＞ 0.05） ，與對(duì)照組相比，PQ組Ca2+水平顯著升高（P＜ 0.01）；與PQ組相比，PQ+MnTMPyP組Ca2+水平明顯降低 （P＜ 0.01） ，表明MnTMPyP預(yù)處理顯著降低PQ處理的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平。見圖3。

2.4 MnTMPyP增強(qiáng)PQ抑制的A549細(xì)胞內(nèi)GR活性

GR催化NADPH還原氧化性谷胱甘肽 （oxidized glutathione，GSSG） 生成谷胱甘肽 （reduced glutathione，GSH） ，有助于維持體內(nèi)GSH/GSSG比值。GR在氧化還原反應(yīng)中對(duì)ROS清除起關(guān)鍵作用。與對(duì)照組相比，MnTMPyP組GR活性無(wú)明顯變化 （P＞0.05） ，PQ組的GR活性顯著降低 （P＜ 0.01）；與PQ組相比，PQ+MnTMPyP組的GR活性明顯增加 （P＜0.01） ，表明MnTMPyP有效增加GR活性并有助于清除氧自由基的作用。見圖4。

2.5 MnTMPyP減少PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞ER應(yīng)激蛋白Grp78及CHOP蛋白表達(dá)

為了證明MnTMPyP的保護(hù)作用也可以減輕ER應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步檢測(cè)ER應(yīng)激蛋白Grp78及CHOP的表達(dá)。以不同處理因素處理A549細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，MnTMPyP組Grp78及CHOP的表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＞ 0.05） ，但PQ組Grp78和CHOP蛋白的表達(dá)量明顯增加 （P＜ 0.01）；與PQ組相比，PQ+MnTMPyP組Grp78和CHOP蛋白表達(dá)量顯著降低 （P＜ 0.01） ，表明MnTMPyP可以減少ER應(yīng)激途徑的凋亡來(lái)保護(hù)PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞損傷。見圖5。

圖2 各組細(xì)胞處理24 h后DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平Fig.2 Intracellular ROS levels detected by the DCFH-DA method after 24-h treatment of cells in each group

圖3 各組細(xì)胞處理24 h后細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平Fig.3 Cytoplasmic Ca2+ levels after 24-h treatment of cells in each group

3 討論

PQ對(duì)人體的毒性是臨床毒理學(xué)中的重要關(guān)注點(diǎn)。研究證明，PQ細(xì)胞毒性的機(jī)制為干擾細(xì)胞內(nèi)呼吸鏈電子轉(zhuǎn)移途徑及ROS的生成［3］。本研究觀察了MnTMPyP在PQ誘導(dǎo)肺損傷中是否通過抗氧化作用起到保護(hù)作用。結(jié)果表明，MnTMPyP在PQ誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞損傷中有顯著地保護(hù)作用，其機(jī)制涉及到減少ROS產(chǎn)生、減少氧化應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)GR活性降低、Ca2+超載及ER應(yīng)激通路蛋白的激活。

圖4 各組細(xì)胞處理24 h后GR活性Fig.4 Glutathione reductase activity after 24-h treatment of cells in each group

本研究為了證明MnTMPyP的抗氧化作用，檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)ROS及GR活性。GSH是一種非酶促抗氧化劑，也是細(xì)胞質(zhì)中含量最豐富的巰基物質(zhì)。它是細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)中的天然ROS清除劑和主要還原劑。PQ毒性的機(jī)制包括NADPH氧化、GR活性降低［15］。實(shí)驗(yàn)表明，PQ確實(shí)增加了ROS的產(chǎn)生以及減弱了GR活性，然而MnTMPyP成功的減少了ROS的生成，增加了GR活性，驗(yàn)證了其抗氧化作用。

圖5 各組細(xì)胞處理24 h后Western blotting檢測(cè)ER應(yīng)激途徑誘導(dǎo)凋亡過程中標(biāo)志性蛋白的表達(dá)Fig.5 Expression of marker proteins of the endoplasmic reticulum stress pathway during apoptosis detected by Western blotting after 24-h treatment of cells in each group

許多研究表明ER在化學(xué)毒物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用，ER應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡也參與許多疾病的發(fā)病機(jī)制［16］。ER是具有維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)合成、翻譯后修飾和蛋白質(zhì)折疊功能的重要細(xì)胞器。ER是Ca2+的重要儲(chǔ)存場(chǎng)所，并在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起重要作用。大部分ER內(nèi)分子伴侶都是Ca2+結(jié)合蛋白［17］。ROS的積累以及由其引發(fā)的Ca2+外流導(dǎo)致未折疊蛋白的積累，這進(jìn)一步增強(qiáng)ER應(yīng)激，加強(qiáng)ER應(yīng)激通路誘導(dǎo)的凋亡［18］。

ER內(nèi)蛋白質(zhì)合成或加工失調(diào)導(dǎo)致未折疊蛋白的積累，從而導(dǎo)致ER應(yīng)激中未折疊蛋白應(yīng)答 （unfolded protein response，UPR） 的激活。UPR可以通過減少蛋白質(zhì)合成、促進(jìn)蛋白質(zhì)降解和生成分子伴侶蛋白來(lái)協(xié)助蛋白質(zhì)的正常折疊，從而緩解ER應(yīng)激。典型的UPR由3條ER跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白介導(dǎo)，PERK、IRE1a和ATF6。UPR由結(jié)合免疫球蛋白 （BiP） 感應(yīng)，也稱為Grp78。在正常情況下，PERK、ATF6、IRE1與分子伴侶Bip/Grp78結(jié)合，但是未折疊蛋白的積累使Grp78與UPR的3個(gè)蛋白分離并促進(jìn)它們活化。Grp78作為ER應(yīng)激的感應(yīng)蛋白之一，當(dāng)ER應(yīng)激開始時(shí)通過調(diào)節(jié)ER腔內(nèi)Ca2+水平作為對(duì)ER應(yīng)激的反應(yīng)，因此被認(rèn)為是ER應(yīng)激發(fā)生的標(biāo)志性蛋白［16］。

CHOP既可以作為ER應(yīng)激標(biāo)記，也可以作為促凋亡轉(zhuǎn)錄因子。CHOP在生理?xiàng)l件下表達(dá)水平非常低，但在嚴(yán)重或持續(xù)的ER應(yīng)激下其表達(dá)水平顯著升高。CHOP是ER應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的中心調(diào)控因子，其活性受UPR全部3個(gè)蛋白的調(diào)控。CHOP作為生長(zhǎng)抑制和DNA損傷誘導(dǎo)基因，是ER應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)細(xì)胞不能維持穩(wěn)態(tài)時(shí)，UPR的所有3個(gè)ER跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白共同作用以促進(jìn)CHOP表達(dá)，并在ER應(yīng)激持續(xù)狀態(tài)下進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［19］。

本研究結(jié)果表明，PQ可以誘導(dǎo)細(xì)胞中ROS和細(xì)胞質(zhì)中Ca2+水平增高，與ER應(yīng)激相關(guān)的Grp78及CHOP蛋白的表達(dá)增高。提示PQ引起的ROS產(chǎn)生以及由其誘導(dǎo)的Ca2+外流可能會(huì)導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在ER腔內(nèi)大量積累，使Ca2+平衡紊亂，激活ER應(yīng)激UPR。長(zhǎng)期持續(xù)的ER應(yīng)激下，ER的功能穩(wěn)態(tài)遭到破壞，進(jìn)而激活凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路并誘導(dǎo)凋亡。然而，MnTMPyP成功減少了PQ誘導(dǎo)的ROS的生成，增強(qiáng)了GR活性，通過降低Grp78及CHOP的表達(dá)成功抑制了ROS誘導(dǎo)的ER應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，MnTMPyP對(duì)PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用，其機(jī)制是通過降低ROS的產(chǎn)生以及抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和ER應(yīng)激。本研究表明，有效的抗氧化藥物可能是治療PQ中毒的關(guān)鍵，這將有助于PQ中毒的下一步基礎(chǔ)研究，并為臨床治療提供依據(jù)。