武晶晶，孔令慧，賈茹

（中國醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 1. 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室； 2. 生物科學(xué)系，沈陽 110122）

Na+-K+-2Cl-共轉(zhuǎn)運蛋白（Na+-K+-2Cl-cotransporter，Nkcc2）基因編碼的呋塞米敏感的Na+-K+-2Cl-共轉(zhuǎn)運蛋白是溶質(zhì)轉(zhuǎn)運體超家族成員之一，因此編碼該蛋白的基因也被稱為SLC12A1［1-2］。NKCC2蛋白主要分布在腎臟髓袢升支粗段，可將2個Cl-、1個Na+和1個K+同向轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)，參與腎臟近30% Na+的重吸收［3］，是重要的高血壓候選基因之一。

細胞色素P450 4F2編碼的ω-羥化酶，可將花生四烯酸代謝生成二十羥基二十炭四烯酸 （20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE）［4］，是重要的血壓調(diào)節(jié)因子。前期本課題組成功地構(gòu)建了CYP4F2轉(zhuǎn)基因小鼠，并證明轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟CYP4F2蛋白表達增加，20-HETE合成增多，是研究20-HETE對血壓調(diào)控機制的重要動物模型［5］。在對轉(zhuǎn)基因小鼠的研究［6］中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟Nkcc2蛋白和mRNA表達均顯著低于野生型小鼠，推測20-HETE在基因轉(zhuǎn)錄水平對Nkcc2存在調(diào)控作用。本研究通過構(gòu)建小鼠Nkcc2基因啟動子螢光素酶報告基因載體，利用20-HETE刺激轉(zhuǎn)染了Nkcc2啟動子報告基因載體的HEK-293T細胞，檢測該報告基因的轉(zhuǎn)錄活性，初步分析20-HETE對Nkcc2基因啟動子活性的影響，為闡明20-HETE對Nkcc2基因調(diào)節(jié)作用的分子機制奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞、pMD18-T Vector、Taq DNA polymerase、LA Taq DNA polymerase、DNA marker、T4 DNA連接酶、KpnⅠ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶、瓊脂糖均購自日本TaKaRa公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國HyClone公司，人類胚胎腎細胞系HEK293T細胞購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所，胰蛋白酶購自美國Biosharp公司，螢光素酶報告基因載體pGL3-Basic、海參螢光素酶載體pRL-TK、Dual-GloTM雙螢光素酶檢測系統(tǒng)購自美國Promega公司，胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉購自美國Sigma-Aldrich公司，膠回收、質(zhì)粒制備試劑盒購自美國Axygen公司，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，20-HETE購自美國Cayman公司，引物合成由中國南京金斯瑞生物科技有限公司完成，DNA測序由中國沈陽優(yōu)唯生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析：應(yīng)用生物信息學(xué)軟件ALi-Baba 2.1和TRANSFAC TESS，對小鼠Nkcc2基因啟動子區(qū)-1 474 bp～+1 bp序列進行預(yù)測，比對2個軟件的分析結(jié)果，尋找潛在的順式作用元件。

1.2.2 小鼠Nkcc2基因啟動子的克?。?/p>

1.2.2.1 小鼠基因組DNA提取與引物設(shè)計 取FVB/N小鼠鼠尾，常規(guī)方法提取小鼠基因組DNA，-20℃保存。根據(jù)Gen Bank數(shù)據(jù)庫獲得小鼠Nkcc2基因啟動子的DNA序列，利用primer 5.0設(shè)計一對特異性引物P1和P2，PCR產(chǎn)物的長度為1 502 bp （-1 462 bp ～+40 bp） 。設(shè)計引物：上游引物5’-GTCACCAATTTACCTTT CCCTT-3’；下游引物5’-ACTTACCGCCCCATCCAG-3’。

1.2.2.2 啟動子片段擴增及TA克隆 以小鼠基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定，并利用膠回收純化試劑盒回收純化，純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD-18T載體，16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109型感受態(tài)細胞，涂布于LB瓊脂板，進行藍白斑篩選。挑取白色克隆于含有氨芐西林的LB培養(yǎng)液中擴增，經(jīng)菌液PCR鑒定DNA片段插入方向，質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)DNA雙向測序驗證，正確的重組載體命名為pMD18-Nkcc2。

1.2.2.3 小鼠Nkcc2啟動子螢光素酶報告基因載體的構(gòu)建 pMD18-Nkcc2重組載體經(jīng)KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定，并利用膠回收純化試劑盒回收純化后，插入到pGL3-Basic載體，16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化JM109型感受態(tài)細胞，挑取單克隆菌落于含有Amp的LB培養(yǎng)液中擴增，試劑盒提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切及雙向測序鑒定，正確的重組載體命名為pGL3-Nkcc2。

1.2.3 小鼠Nkcc2基因啟動子活性檢測：

1.2.3.1 細胞培養(yǎng)及處理 人類胚胎腎細胞系HEK293T細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100 U /mL青霉素，100 U /mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)，用含0.1%胰蛋白酶的消化液消化傳代。

1.2.3.2 轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，用無抗生素培養(yǎng)基接種HEK293T細胞于24孔培養(yǎng)板中，接種密度以24 h后細胞增長至50%～70%為宜，分別用無血清無抗生素的培養(yǎng)基配置質(zhì)粒DNA （小鼠Nkcc2啟動子螢光素酶報告基因質(zhì)粒及海參螢光素酶對照質(zhì)粒） 和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000，兩者混合后室溫孵育20 min，加入24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染HEK293T細胞。細胞轉(zhuǎn)染24 h后，用終濃度為1 μ mol/L 20-HETE刺激2 h。

1.2.3.3 Dual-GloTM雙螢光素酶檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性 依據(jù)試劑盒說明書PBS洗滌細胞后，加入100 μ L 1×PLB裂解細胞，室溫震蕩15 min，將10 μ L細胞裂解液移入螢光素酶檢測管中，每管加入35 μ L LAR Ⅱ，利用生物發(fā)光儀檢測螢火蟲螢光強度值，每管再加入35 μ L Stop-reagent，檢測海參螢光強度值，計算相對熒光值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)均由3次獨立實驗結(jié)果的表示，采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠Nkcc2基因啟動子區(qū)的生物信息學(xué)分析

登錄美國國家生物技術(shù)信息中心Gen Bank下載小鼠Nkcc2基因啟動子區(qū)1 474 bp序列，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件AliBaba2.1和TRANSFAC TESS分析小鼠Nkcc2基因啟動子區(qū)結(jié)構(gòu) （-1 474 bp～+1 bp） ，該區(qū)域存在多個順式作用元件，其中NF-κ B、AP-1等均與20-HETE調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)，是20-HETE調(diào)控Nkcc2基因的潛在作用元件，見圖1。

圖1 小鼠Nkcc2基因啟動子區(qū)潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點Fig.1 Transcription factor binding site of the murine Nkcc2 gene promoter region

2.2 Nkcc2基因啟動子螢光素酶報告基因載體的構(gòu)建

以小鼠基因組DNA為模板，利用PCR擴增小鼠Nkcc2基因啟動子片段 （-1 462 bp ～ +40 bp） ，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小與預(yù)期相符（圖2） 。將PCR產(chǎn)物克隆至中間載體pMD18-T vector中，經(jīng)PCR、雙向測序及BLAST比較分析，鑒定出與GenBank序列一致的pMD18-Nkcc2重組載體，經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和HindⅢ雙酶切，回收目的短片段，插入到經(jīng)KpnⅠ和HindⅢ雙酶切的無啟動子螢光素酶報告基因載體pGL3-Basic上。重組載體pGL3-Nkcc2經(jīng)Kpn I和Hind Ⅲ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1 502 bp的陽性插入片段 （圖3） ，且測序結(jié)果 （圖4） 與GenBank序列一致，證明用于分析Nkcc2啟動子活性的螢光素酶報告基因載體構(gòu)建成功。

2.3 20-HETE對Nkcc2基因啟動子活性的影響

圖2 小鼠Nkcc2基因啟動子PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the PCR-amplified murine Nkcc2 gene promoter fragmen

為驗證20-HETE對Nkcc2基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用，將pGL3-Nkcc2螢光素酶報告基因載體瞬時轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞24 h后，用1 μ mol/L 20-HETE刺激2 h，并利用螢光素酶報告基因系統(tǒng)檢測Nkcc2基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性。與對照組相比，20-HETE處理組Nkcc2基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性下降了27.5% （P＜ 0.05） ，說明20-HETE可有效下調(diào)Nkcc2基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性，初步驗證了假設(shè)。

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of the recombinant plasmid digested by restriction endonuclease

3 討論

原發(fā)性高血壓是當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最具挑戰(zhàn)性的心血管疾病之一，也是全球范圍內(nèi)重大公共問題。血壓調(diào)節(jié)是一個多系統(tǒng)多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過程，其中腎小管Na+重吸收作用通過調(diào)節(jié)機體水鈉代謝，參與血壓調(diào)節(jié)。Nkcc2基因編碼的Na+-K+-2Cl-共轉(zhuǎn)運體主要分布在腎臟髓袢升支粗段，參與腎小管Na+的重吸收，因此該基因是重要的高血壓候選基因。

圖4 重組質(zhì)粒雙向測序結(jié)果Fig.4 Bidirectional sequencing of the recombinant plasmid

CYP4F2是另一個重要的高血壓候選基因，該基因編碼的ω-羥化酶是人類腎臟產(chǎn)生20-HETE最重要的酶之一。20-HETE主要由髓袢升支粗段生成，通過抑制Nkcc2發(fā)揮利尿鈉作用，然而其具體機制尚不清楚。有報道［7-8］稱20-HETE通過抑制ROMK活性，減少Nkcc2轉(zhuǎn)運所需K+濃度差的勢能，間接抑制Nkcc2的活性。本課題組前期利用4% NaCl的高鹽飼料喂養(yǎng)具有高20-HETE水平的CYP4F2轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)20-HETE與高鹽有協(xié)同作用，通過經(jīng)典的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解腎臟Nkcc2蛋白，證明了20-HETE通過翻譯后調(diào)控機制參與腎臟Nkcc2蛋白表達的調(diào)控。本研究中還發(fā)現(xiàn)，正常飲食CYP4F2轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟Nkcc2蛋白和mRNA表達均低于同組野生型小鼠，推測20-HETE在基因轉(zhuǎn)錄水平對Nkcc2表達亦存在調(diào)節(jié)作用。雖然，目前尚未有直接證據(jù)證明20-HETE對Nkcc2基因表達存在調(diào)控作用，但仍有一些報道從側(cè)面支持本研究的結(jié)論。在對鹽敏感性高血壓動物模型Dahl鹽敏感性大鼠的研究［9-12］中發(fā)現(xiàn)，Dahl鹽敏感性大鼠內(nèi)源性20-HETE水平較低是引起鹽敏感性高血壓的主要原因；對Dahl鹽敏感性大鼠腎臟水鈉代謝相關(guān)通道蛋白表達譜的研究［13］發(fā)現(xiàn)，Dahl鹽敏感性大鼠腎臟Nkcc2蛋白表達及活性均高于其他種類大鼠；而利用Clofibrate外源性誘導(dǎo)20-HETE合成增加可恢復(fù)Dahl鹽敏感性大鼠腎臟Nkcc2至正常水平［9-10］，以上結(jié)論均間接說明了20-HETE對Nkcc2的表達存在調(diào)控作用。

結(jié)合本課題組的前期工作基礎(chǔ)和其他實驗室關(guān)于20-HETE對Nkcc2作用機制的研究，推測20-HETE在轉(zhuǎn)錄水平存在對Nkcc2基因表達的調(diào)節(jié)作用。為探討20-HETE對Nkcc2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用機制，利用生物信息學(xué)軟件分析小鼠Nkcc2基因啟動子區(qū)-1 474 bp ～+1 bp序列，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在多個20-HETE調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的潛在作用元件，如NF-κ B、AP-1等。進一步構(gòu)建了小鼠Nkcc2基因啟動子區(qū)螢光素酶報告基因載體pGL3-Nkcc2。20-HETE刺激轉(zhuǎn)染了pGL3-Nkcc2載體的HEK293T細胞后，通過螢光素酶報告基因系統(tǒng)檢測Nkcc2基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性，結(jié)果顯示，20-HETE能有效減少pGL3-Nkcc2重組載體轉(zhuǎn)錄活性，初步判斷20-HETE在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)Nkcc2基因的表達。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了小鼠Nkcc2基因啟動子區(qū)重組報告基因載體pGL3-Nkcc2，為進一步探究20-HETE對Nkcc2基因的調(diào)控機制提供了有利的研究工具。同時，本研究發(fā)現(xiàn)20-HETE對pGL3-Nkcc2重組載體轉(zhuǎn)錄活性存在抑制作用，為進一步鑒定20-HETE對Nkcc2基因表達調(diào)控的分子機制奠定了實驗基礎(chǔ)。