藍(lán)先旗，麥惠強(qiáng)，寧曄，王鳳麗，梁仔

(1中山市人民醫(yī)院，廣東中山528403;2廣東醫(yī)科大學(xué)附屬廉江醫(yī)院)

腦卒中特別是出血性腦卒中已成為我國居民第一死亡原因[1]。腦出血早期手術(shù)清除血腫及藥物保守治療是影響治療效果的關(guān)鍵[2]。核因子κB(NF-κB)p65、Notch家族受體蛋白1(Notch1)均為臨床常用的炎癥指標(biāo)。燈盞花素是從燈盞花全株植物中提取分離的黃酮類有效成分,化學(xué)名為4,5,6,三羥基甲酮-7-葡萄糖醛酸苷[3,4]，在清除氧自由基、抗氧化,抑制蛋白激酶C等多方面產(chǎn)生作用,在心血管疾病等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[5]。近年來，研究[6]發(fā)現(xiàn)，燈盞花素治療高血壓、腦出血效果較好。但燈盞花素在出血性腦卒中治療中的具體作用機(jī)制鮮被深入探討。2018年1～5月，我們觀察了燈盞花素對腦出血模型大鼠早期腦損傷的影響，并探討其可能作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物、試劑及儀器 健康SD雄性大鼠96只，體質(zhì)量280～300 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。燈盞花素(meilunbio公司，貨號MB5170)，大鼠冠狀腦模具(萊艾特，貨號：LAT-DSGZNBJ)兔單克隆抗NF-κB p65(美國CST公司, 貨號：7174S)，DAB顯色液(北京中杉金橋公司)，各相應(yīng)免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋公司)，IV 型膠原酶0.5U(美國Sigma公司)，戊巴比妥鈉(美國Sigma)，電泳儀及電泳槽(美國Amersham公司)，DBJ_2000凝膠成像系統(tǒng)(英國UVIpro公司)。

1.2 大鼠分組、腦損傷模型制備及燈盞花素給予方法 取96只SD大鼠，隨機(jī)分為A(假手術(shù)組)、B(腦出血組)、C(低劑量燈盞花素干預(yù)組)、D組(高劑量燈盞花素干預(yù)組)，每組各24只。B、C、D組采用尾狀核定位注射制作腦出血模型，A組僅針刺尾狀核定位注射。腦出血模型制備方法：戊巴比妥鈉麻醉大鼠，頭部固定于立體定位儀，常規(guī)消毒頭皮，于中線約3 mm右側(cè)處切開長約1 cm縱行切口，在距離前囟前1.5 mm、中線右側(cè)3 mm的位置用牙科骨鉆鉆一個(gè)直徑約1 mm小孔，暴露出硬腦膜。用經(jīng)消毒滅菌的無菌微量注射器抽吸無菌膠原酶Ⅳ 0.2 U(0.2 U膠原酶溶解于1 μL無菌生理鹽水中)，在立體定位儀上將微量注射泵進(jìn)行安裝固定。通過骨孔中央立體定向地垂直進(jìn)針進(jìn)入SD大鼠的腦右側(cè)尾狀核(立體定位坐標(biāo)是：以前囟為參照，前囟前0.1 mm，前囟側(cè)3.5 mm，前囟腹側(cè)6 mm)，將無菌膠原酶Ⅳ 0.2 U(1 μL)勻速注射，注射時(shí)間超過5 min。注射完畢將微量注射器針頭保持在原來位置10 min，阻止回流。A組微量注射器針頭僅同部位針刺，保留相同留針時(shí)間，但不進(jìn)行藥物注射。造模后各組SD大鼠單獨(dú)放于鼠籠中，隨意獲得食物和水。C、D組分別于造模前1 h及造模1、6、12 h時(shí)腹腔注射50、100 mg/kg的燈盞花素，B組分別于造模前1 h及造模1、6、12 h時(shí)腹腔注射1 mL生理鹽水，A組不做任何處理。

1.3 各組大鼠腦出血體積及腦組織含水量測算 造模24 h時(shí)每組各取6只大鼠處死，取腦組織切片，得到血腫最大層面，后以切面為起始，2 mm層厚切片，選取所有含血腫切片，依序擺齊，記錄所有標(biāo)本含血腫層數(shù)，并用高分辨攝像機(jī)拍攝記錄血腫最大層面。用Image J(V1.45)軟件分析測算最大截面面積，采用“改良多田公式法”估算每個(gè)標(biāo)本的出血體積(V)。V=a×b×c×1/2×0.2，其中a為最大血腫面積層面血腫最長徑，b為最大血腫面積層面上與最長徑垂直最長徑，c為大體組織中出現(xiàn)血腫切片數(shù)(默認(rèn)層厚0.2 cm)。重復(fù)3次，取平均值。采用干濕比重法測算各組大鼠腦組織含水量：造模24 h時(shí)每組各取6只大鼠，處死后新鮮腦組織，吸除腦組織表面液體，分析天平上稱取其濕重，100 ℃烘干至恒重。計(jì)算各組腦含水量比重。腦含水量比重=(濕重-干重)/濕重×100%。重復(fù)3次，取平均值。

1.4 各組大鼠血腫周圍腦組織NF-κB p65及腦組織NF-κB p65、Notch1蛋白檢測 ①采用免疫組化法檢測各組大鼠血腫周圍腦組織NF-κB p65。造模24 h時(shí)每組各取6只大鼠處死，處死后取新鮮腦組織，制作血腫周圍腦組織石蠟切片。利用Leica Qwin生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測算各組大鼠血腫周圍腦組織NF-κB p65，NF-κB p65以光密度OD值表示。陰性對照用PBS代替一抗進(jìn)行孵育，排除假陽性結(jié)果。每只大鼠選取2張切片，取6只大鼠平均灰度值為NF-κB p65的相對表達(dá)量。②采用免疫蛋白電泳法檢測 各組大鼠腦組織NF-κB p65、Notch1蛋白 。造模24 h時(shí)每組各取6只大鼠處死，處死后取新鮮腦組織，采用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光來可視化檢測試劑盒使圖像發(fā)光，使用Quantity One軟件對蛋白進(jìn)行定量分析，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦出血體積比較 A、B、C、D組大鼠腦出血體積分別為(1.62±0. 87)、(106.87±25.35)、(79.31±11.46)、(72.69±10.61)cm3，與A組比較，B、C、D組大鼠腦出血體積增加(P均≤0.05)，與B組比較，C、D組大鼠腦出血體積減小(P均≤0.05)，與C組比較，D組大鼠腦出血體積減小(P≤0.05)。

2.2 各組大鼠腦組織干濕比重比較 A、B、C、D組各組大鼠腦組織干濕比重分別為76.71±0.44、82.87±0.86、78.92±1.02、76.66±0.94，與A組比較，B、C組大鼠腦組織干濕比重增加(P均≤0.05)，與B組比較，C、D組大鼠腦組織干濕比重降低(P均≤0.05)，與C組比較，D組大鼠腦組織干濕比重降低(P≤0.05)。

2.3 各組大鼠血腫周圍腦組織 NF-κB p65相對表達(dá)量比較 A、B、C、D組大鼠血腫周圍腦組織 NF-κB p65相對表達(dá)量分別為46.79±21.52、132.58±13.95、73.63±10.29、51.96±4.83，與A組比較，B、C、D組血腫周圍腦組織NF-κB p65相對表達(dá)量增加(P均≤0.05)，與B組比較，C、D組血腫周圍腦組織 NF-κB p65相對表達(dá)量降低(P均≤0.05)，與C組比較，D組血腫周圍腦組織 NF-κB p65相對表達(dá)量降低(P≤0.05)。

2.4 各組大鼠腦組織NF-κB p65、Notch1蛋白相對表達(dá)量比較 A、B、C、D組腦組織NF-κB p65的相對表達(dá)量分別為0.24±0.06、0.84±0.09、0.66±0.09、0.56±0.07，A、B、C、D組腦組織Notch1的相對表達(dá)量分別為0.44±0.08、0.98±0.10、0.80±0.17、0.74±0.10，與A組比較，B、C、D組腦組織腦組織NF-κB p65、Notch1的相對表達(dá)量增加(P均≤0.05)，與B組比較，C、D組腦組織NF-κB p65、Notch1的相對表達(dá)量降低(P均≤0.05)，與C組比較，D組腦組織NF-κB p65、Notch1的相對表達(dá)量降低(P≤0.05)。

3 討論

腦出血后早期腦損傷病情轉(zhuǎn)歸除與血腫大小、部位等有關(guān)外，主要取決于水腫的程度、炎癥通路的激活狀態(tài)。腦出血后早期腦損傷的產(chǎn)生機(jī)制既有水腫形成參與，也有各種炎癥凋亡通路如NF-κB信號通路的介導(dǎo)，其中NF-κB p65的是該通路研究的重點(diǎn)之一[7]。新近有研究[8]發(fā)現(xiàn)，Notch1是NF-κB凋亡作用的重要上游，其主要分布在血管周圍，且參與血管生長發(fā)育調(diào)節(jié)，其表達(dá)與血管新生、血管畸形等有重要關(guān)聯(lián)。還有研究表明，在腦出血組織中，Notch1表達(dá)明顯增加[9]，這進(jìn)一步研究Notch1與腦出血存在重要關(guān)聯(lián)。NF-κB p65作為經(jīng)典NF-κB信號通路的重要成員，其表達(dá)在腦出血中明顯增加。

Notch活化酶的抑制劑DAPT γ-分泌酶治療可減少對腦的損傷。 然而，支持這種治療效果的分子機(jī)制尚不完全清楚。有研究[10]表明，證明Notch / RBP-J信號傳導(dǎo)在NG2+神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞如GFAP+細(xì)胞，巢蛋白+細(xì)胞和RC2+細(xì)胞中被激活，使用Notch / RBP-J信號傳導(dǎo)報(bào)道小鼠。3天DAPT治療減少了反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，但沒有減少NG2+神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞的數(shù)量。 BrdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明，這種減少是由于反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖減少。 DAPT抑制Olig2的核轉(zhuǎn)位，Olig2對于反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化是必不可少的。

燈盞花素是從中國藥典收藏重要燈盞細(xì)辛中提取的黃銅活性成分，主要藥理作用是降低血液黏度、抑制清除自由基、抗氧化，抑制蛋白激酶C，減輕炎癥反應(yīng)和改善腦微循環(huán)，從而具有減輕腦出血后早期腦損傷的潛力。有研究[11,12]發(fā)現(xiàn)，燈盞花素對腦組織炎癥應(yīng)激起保護(hù)作用，且在腦缺血損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，燈盞花素明顯改善預(yù)后。研究[13]證實(shí)，燈盞花素可能通過抑制鈣超載、減少自由基釋放其腦保護(hù)作用。且燈盞花素對腦損傷是出現(xiàn)的Na+、K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性下降有明顯的抑制作用，并能降低腦組織含水量[18]，減輕腦水腫的程度。

腦出血后因受損傷和炎癥刺激，炎癥級聯(lián)反應(yīng)被觸發(fā)，炎性因子例如IL-6、TNF-α、MMP-9等釋放增多，通過多種分泌方式與靶細(xì)胞上IL-6、TNF-α等受體結(jié)合產(chǎn)生作用，其中重要的NF-κB信號通路，可能在腦出血作用下被激活，且通過Notch1這一上游蛋白調(diào)控產(chǎn)生作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與B組比較，C、D組大鼠腦出血體積、腦組織干濕比重減小，且D組減少更明顯。與B組比較，C、D組血腫周圍腦組織 NF-κB p65相對表達(dá)量降低，且D組降低更明顯。與與B組比較，C、D組腦組織NF-κB p65、Notch1相對表達(dá)量降低，且D組降低更明顯，說明燈盞花素在腦出血疾病中的腦保護(hù)作用，燈盞花素干預(yù)后大鼠腦出血周圍組織中NF-κB p65這一經(jīng)典炎癥凋亡因子表達(dá)明顯減少。燈盞花素可能通過抑制NF-κB p65與Notch1表達(dá)產(chǎn)生作用。進(jìn)一步推斷，燈盞花素可能通過抑制Notch/NF-κB信號通路介導(dǎo)減輕大鼠腦出血模型早期腦損傷。

綜上所述，燈盞花素腹腔注射可減輕腦出血模型大鼠早期腦損傷程度，且高劑量(100 mg/kg)時(shí)作用更明顯。其機(jī)制可能為抑制NF-κB p65、Notch1的表達(dá)。但燈盞花素對腦出血大鼠抗炎癥反應(yīng)的具體互作機(jī)制、治療時(shí)合適時(shí)間窗、持續(xù)時(shí)間治療效果等問題尚有待于進(jìn)一步研究。