王儒曉， 李媛媛， 劉傳林， 杜文曉， 侯建海， 姚文君， 張俊凱， 張運(yùn)發(fā)， 王宇， 曲江勇

(煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264005)

多板綱Polyplacophora是軟體動(dòng)物門Mollusca中較原始的類群，石鱉是多板綱的代表種類，從白堊紀(jì)至今，其化石形態(tài)變化不大，在研究軟體動(dòng)物的起源與進(jìn)化中有重要的地位和意義(趙青松等，2007)。我國沿海分布10多種石鱉，以紅條毛膚石鱉Acanthochitonrubrolineatus較為常見。紅條毛膚石鱉分布于我國黃、渤海到廣東沿岸，生活于潮間帶和低潮區(qū)巖石岸，以附著性的藻類、底棲硅藻等為主要食物，屬狹溫、狹鹽性動(dòng)物(張均龍等，2015)。目前，紅條毛膚石鱉的研究主要集中在形態(tài)、藥用及磁性納米材料(錢霞等，2015；王玲等，2018)，其種群遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性尚不明確。因此，開展紅條毛膚石鱉不同地理種群的分子遺傳研究，了解其遺傳結(jié)構(gòu)，對(duì)我國潮間帶多板綱生物遺傳多樣性等研究具有重要意義。

線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunit Ⅰ，COⅠ)作為最常用的分子標(biāo)記，在海洋生物的遺傳多樣性及種群遺傳結(jié)構(gòu)研究中發(fā)揮著重要作用(Nietal.，2012；Lietal.，2015；Corderoetal.，2017；王玲等，2018)。本研究利用線粒體COⅠ基因探討環(huán)渤海紅條毛膚石鱉9個(gè)地理種群的遺傳結(jié)構(gòu)，以期闡明環(huán)渤海紅條毛膚石鱉的遺傳多樣性現(xiàn)狀及其受環(huán)境因子的影響狀況，為合理利用紅條毛膚石鱉種質(zhì)資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣點(diǎn)覆蓋紅條毛膚石鱉在渤海區(qū)域的全部分布區(qū)，基本涵蓋全部巖基海岸潮間帶，主要為低潮帶。采樣點(diǎn)分別是：萊州、營口、大連、葫蘆島、長島、砣磯島、煙臺(tái)、秦皇島、蓬萊(圖1)，共采集了環(huán)渤海海域9個(gè)樣地126只紅條毛膚石鱉個(gè)體，采集后保存于無水乙醇中備用。

圖1 紅條毛膚石鱉地理種群采樣點(diǎn)Fig. 1 Sampling sites of Acanthochiton rubrolineatus

DL. 大連Dalian (121°41′E， 38°54′N)， YK.營口Yingkou (122°50′E， 40°37′N)， HLD. 葫蘆島Huludao (120°57′E， 40°43′N)， QHD. 秦皇島Qinhuangdao (119°39′E， 39°56′N)， TJ. 砣磯島Tuojidao (120°46′E， 38°10′N)， CD. 長島Changdao (120°46′E， 38°10′N)， LZ. 萊州Laizhou (119°56′E， 37°15′N)， YT. 煙臺(tái)Yantai (121°30′E， 37°27′N)， PL. 蓬萊Penglai (120°49′E， 37°47′N)； 下同the same below

1.2 環(huán)境因子的選取

選取經(jīng)度、緯度、年平均溫度、年平均溫度變異系數(shù)、年平均降水量、年平均降水量變異系數(shù)、日照時(shí)數(shù)、日照時(shí)數(shù)變異系數(shù)、日照百分率變異系數(shù)、年平均水汽壓變異系數(shù)、年平均氣壓、年平均氣壓變異系數(shù)共12個(gè)環(huán)境因子(圖1、表1)。數(shù)據(jù)來源于國家氣象數(shù)據(jù)共享服務(wù)網(wǎng)(http：//data.cma.cn/)，從該網(wǎng)站獲取8個(gè)采樣點(diǎn)近30年的氣象數(shù)據(jù)并計(jì)算氣溫、降水量變異系數(shù)(砣磯島數(shù)據(jù)未收錄)。

1.3 DNA提取、擴(kuò)增及測(cè)序

分別取紅條毛膚石鱉肌肉約100 mg，采用DNeasy?組織&血液試劑盒(GTIN：0405322800-6077，Lot：151046088；GIAGEN，德國)提取總DNA。

表1 8個(gè)地理種群近30年環(huán)境因子(砣磯島無數(shù)據(jù)記錄)Table 1 Environmental factors of 8 populations in 30 years (no record in Tuoji Island)

注Notes： AAT. 年平均溫度annual average temperature， VAAT. 年平均溫度變異系數(shù)annual average temperature variation coefficient， AAPR. 年平均降水量annual average precipitation， VAAPR. 年平均降水量變異系數(shù)annual average precipitation variation coefficient， SS. 日照時(shí)數(shù)sunshine duration， VCSS. 日照時(shí)數(shù)變異系數(shù)sunshine variation coefficient， VCSP. 日照百分率變異系數(shù)sunshine percentage variation coefficient， VAAVR. 年平均水汽壓變異系數(shù)annual average vapor pressure variation coefficient， AAP. 年平均氣壓annual average air pressure， VAAP. 年平均氣壓變異系數(shù)annual average air pressure variation coefficient； 下同the same below

使用COⅠ通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(北京六合華大基因)，COⅠForward：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG；COⅠReverse：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’(Folmeretal.，1994)。反應(yīng)體系(25 μL)：12.5 μL Taq MIX(0.625 U Taq酶，0.2 mmol·L-1dNTP，1.5 mmol·L-1MgCl2；Lot：A3701A，TaKaRa，中國大連)；上下游引物各 0.15 μL(100 μmol·L-1)、1 μL DNA模板(80～100 ng)，不足部分以ddH2O補(bǔ)充。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，42 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行純化測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

雙向測(cè)序的結(jié)果用ContingExpress進(jìn)行拼接，通過CLUSTAL_X 2.0(Larkinetal.，2007)進(jìn)行序列比對(duì)，并輔以人工校對(duì)。DnaSP 5(Librado & Rozas，2009)統(tǒng)計(jì)單倍型。ARLEQUIN 3.5(Excoffier & Lischer，2010)計(jì)算種群多樣性指數(shù)，如單倍型多樣度(h)、核苷酸多樣度(π)、序列平均核苷酸差異數(shù)(k)、擴(kuò)張系數(shù)(Tau)、種群分化系數(shù)(Fst)；分子方差分析(AMOVA)。

通過SPASS 19.0(Coakes，2013)對(duì)遺傳多樣性、環(huán)境因子分別進(jìn)行Shapiro-Wilk正態(tài)分布檢驗(yàn)、單因素方差分析、Pearson相關(guān)性分析。

本研究選用最大似然法(maximum likelihood，ML)和貝葉斯法(Bayesian inference，BI)構(gòu)建單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹，jModelTest(Darribaetal.，2012)和MrModelTest(Nylander，2004)中的赤池信息準(zhǔn)則(Akaike information criterion，AIC)分別確立最適模型TVM+I+G。ML樹和BI樹構(gòu)建均以琉球花棘石鱉Acanthopleuraloochooana和函館銼石鱉Ischnochitonhakodaensis為外群。基于得到的最佳替換模型，使用PhyML(Guindonetal.，2010)構(gòu)建ML樹，采用啟發(fā)式搜索，自舉檢驗(yàn)的數(shù)值為1 000，并計(jì)算各拓?fù)浞种档闹С致?。使用MrBayes 3.2.5(Ronquistetal.，2012)構(gòu)建BI樹：采用馬爾科夫鏈的蒙特卡羅方法(4個(gè)MCMC模擬)運(yùn)算3×106，采樣密度1/1 000。收斂性由分歧頻率的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差決定(<0.01)，老化值分別設(shè)置為1.2×106代，剩余的代數(shù)用來構(gòu)建50%一致樹。最終得到一致的系統(tǒng)發(fā)生結(jié)構(gòu)，而只在后驗(yàn)概率值上有輕微差異。結(jié)果使用TreeView(Surhoneetal.，2010)查看，通過ITOL在線工具(http：//itol.embl.de/)進(jìn)行系統(tǒng)樹圖像美化?；谥薪榫W(wǎng)法(median-joining method，MJ)(Bandeltetal.，1999)和最大簡約法(maximum parsimony，MP)(Polzin & Daneshmand，2003)，通過Network 5.0.0.1繪制單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性

126只紅條毛膚石鱉樣本的mtDNACOⅠ基因部分序列長度為654 bp，堿基組成：A(20.51%)、T(41.72%)、C(14.23%)、G(23.54%)，共發(fā)現(xiàn)41個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，38個(gè)轉(zhuǎn)換，4個(gè)顛換，無插入/缺失，界定29種單倍型，單倍型最多的采樣點(diǎn)是長島和大連(表2)?？傮w單倍型多樣性0.899±0.013，核苷酸多樣性0.013 3±0.006 8，核苷酸兩兩差異度8.689±4.038。單倍型多樣性最高的為砣磯島(0.955±0.057)，最低的為葫蘆島(0.742±0.084)；核苷酸多樣性最高的為大連(0.013 9±0.007 5)，最低的為秦皇島(0.007 6±0.004 3)。紅條毛膚石鱉各地理種群(除蓬萊外)的遺傳多樣性指數(shù)正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果表明，所有遺傳多樣性指數(shù)都服從正態(tài)分布；樣本量之間的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，各多樣性指數(shù)均不受個(gè)體數(shù)量的影響，說明可以用此數(shù)據(jù)表示各地理種群的遺傳多樣性。

表2 紅條毛膚石鱉種群遺傳多樣性Table 2 Sampling information and diversity indices for 9 Acanthochiton rubrolineatus populations

注： inf為無限大， —為數(shù)據(jù)未收錄， 括號(hào)內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)差； 下同

Notes： inf. infinite， —. no data， standard deviation in brackets； the same below

2.2 環(huán)境因子對(duì)遺傳多樣性的影響

除砣磯島(未被國家氣象數(shù)據(jù)共享服務(wù)收錄)外，所有環(huán)境因子經(jīng)檢驗(yàn)均為正態(tài)分布。通過Person相關(guān)性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)紅條毛膚石鱉種群核苷酸多樣性與緯度、年平均溫度變異系數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(rπ-LA=-0.808、rπ-VAAT=-0.795、rπ-AAP=-0.903、rh-AAP=-0.921；P<0.05)，其他數(shù)據(jù)間無顯著相關(guān)性(P>0.05)(表3)。

表3 紅條毛膚石鱉遺傳多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性分析Table 3 Relationship correlations between genetic diversity of Acanthochiton rubrolineatus and environmental factors

注： LO. 東經(jīng)， LA. 北緯； 下同

Notes： LO. east longitude， LA. northern latitude； the same below

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)

基于COⅠ基因的兩兩種群之間的Fst值為-0.253(煙臺(tái)-蓬萊)～0.565(秦皇島-蓬萊)(表4)。秦皇島與萊州、大連、長島、砣磯島、煙臺(tái)、蓬萊6個(gè)種群之間存在顯著的低水平遺傳分化(0.121～0.565)，葫蘆島與萊州、大連、長島、煙臺(tái)存在顯著的低水平遺傳分化(0.168～0.378)，營口與萊州、長島、煙臺(tái)存在顯著的低水平遺傳分化(0.231、0.229、0.232)，砣磯島與煙臺(tái)存在顯著的低水平遺傳分化(0.113)。

AMOVA表明，紅條毛膚石鱉種群遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)(83.26%，P<0.001)(表5)，較少部分的遺傳變異來自于種群間(16.74%，P<0.001)。表明環(huán)渤海紅條毛膚石鱉的遺傳分化主要表現(xiàn)為種群內(nèi)分化。

表4 基于COⅠ基因紅條毛膚石鱉種群間遺傳分化指數(shù)Table 4 Pairwise estimated values of genetic differentiation coefficient among natural populations of Acanthochiton rubrolineatus

注： 種群分化系數(shù)(對(duì)角線下方)與基因流(對(duì)角線上方)；*P<0.05

Note：Fst(below diagonal)， and gene flow (above diagonal)；*P<0.05

表5 紅條毛膚石鱉分子方差分析Table 5 AMOVA of Acanthochiton rubrolineatus

系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)顯示，環(huán)渤海紅條毛膚石鱉沒有形成明顯的進(jìn)化分支。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)與進(jìn)化樹一致。

圖2 紅條毛膚石鱉COⅠ基因的BI和ML系統(tǒng)發(fā)生樹Fig. 2 Phylogenetic tree (BI and ML) based on COⅠ gene of Acanthochiton rubrolineatus

分支處數(shù)字代表后驗(yàn)概率/自舉檢驗(yàn)值

The number at the branch represents posterior probability/bootstrap test value

圖3 基于COⅠ基因的紅條毛膚石鱉單倍型網(wǎng)絡(luò)Fig. 3 Haplotype network based on COⅠ gene of Acanthochiton rubrolineatus

2.4 種群歷史動(dòng)態(tài)

核苷酸錯(cuò)配分布分析表明，觀察值呈近似單峰分布(圖4)，分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(SSD=0.017，P=0.220>0.05；Harpending’s raggedness index=0.027，P=0.080)，符合種群擴(kuò)張模型下的預(yù)期分布。根據(jù)石鱉類線粒體COⅠ基因進(jìn)化速率(1.2%每百萬年)計(jì)算，紅條毛膚石鱉種群的擴(kuò)張時(shí)間約為111.86萬年。

圖4 紅條毛膚石鱉的錯(cuò)配分布圖Fig.4 Mismatch distributions of Acanthochiton rubrolineatus

3 討論

紅條毛膚石鱉8個(gè)種群(除蓬萊外)的線粒體COⅠ基因序列研究表明，各地理種群具有較高的單倍型多樣性(0.742～0.955)和較低的核苷酸多樣性(0.007 6～0.013 9)，符合Grant和Bowen(1998)提出的海洋類生物較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性模式，且與其他海洋無脊椎動(dòng)物類似(Nietal.，2012；Zhouetal.，2016；史博洋等，2017；王玲等，2018)。紅條毛膚石鱉126只個(gè)體獲得29種單倍型(23.02%)，種群的遺傳多樣性水平較低。低水平遺傳多樣性的物種易受到環(huán)境及人為因素影響，在不良環(huán)境條件下生存會(huì)受到威脅，應(yīng)重視環(huán)渤海紅條毛膚石鱉種群保護(hù)。

核苷酸多樣性是評(píng)價(jià)種群遺傳多樣性的重要指標(biāo)。環(huán)渤海紅條毛膚石鱉8個(gè)種群的核苷酸多樣性與緯度呈顯著負(fù)相關(guān)，環(huán)渤海南部種群遺傳多樣性高于北部種群，推測(cè)南部種群更為古老。核苷酸多樣性與年平均溫度變異系數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，表明環(huán)境溫度越穩(wěn)定，紅條毛膚石鱉遺傳多樣性越高，與其他海洋無脊椎動(dòng)物生態(tài)遺傳研究結(jié)果基本一致(Monarietal.，2007；Yuetal.，2009；史博洋等，2017)。

海洋生物通常在其分布的空間范圍內(nèi)具有較低水平的遺傳分化，無顯著遺傳結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)(王玲等，2018)。大多數(shù)海洋無脊椎動(dòng)物具有浮游幼蟲期，幼蟲在海流的推動(dòng)下擴(kuò)散，不同地理種群間進(jìn)行基因交流，呈較低水平的遺傳分化，表現(xiàn)出遺傳均質(zhì)性(Palumbi，1994；Lee & Boulding，2010)。環(huán)渤海紅條毛膚石鱉種群間的Fst值較低且多數(shù)不顯著(63.89%)，種群間沒有形成顯著的遺傳分化。同時(shí)，環(huán)渤海紅條毛膚石鱉沒有形成顯著的遺傳譜系結(jié)構(gòu)，遺傳分化程度低，種群間存在基因交流。紅條毛膚石鱉發(fā)育過程經(jīng)歷擔(dān)輪幼蟲期(張均龍等，2013)，推測(cè)在渤海環(huán)流推動(dòng)下，各地理種群間基因交流頻繁，這可能是環(huán)渤海紅條毛膚石鱉沒有形成顯著地理格局的原因。

環(huán)渤海紅條毛膚石鱉經(jīng)歷了種群擴(kuò)張，根據(jù)擴(kuò)張時(shí)間，環(huán)渤海紅條毛膚石鱉的擴(kuò)張發(fā)生在早更新世晚期(第二溫暖期)，也是多瑙-恭茲間冰期發(fā)生時(shí)間。這一時(shí)期，海平面上升，紅條毛膚石鱉從冰期避難所向外擴(kuò)張，占據(jù)新的棲息地，從而形成新的遺傳格局(Shenetal.，2011；Nietal.，2012)，推測(cè)紅條毛膚石鱉屬于間冰期擴(kuò)張物種。