傅孝美 李宗軍 趙志友 羅鳳蓮

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖南 長沙 410128；2. 湖南賓之郎食品科技有限公司，湖南 湘潭 411100)

檳榔(ArecacatechuLinn)是檳榔屬棕櫚科檳榔亞科檳榔族檳榔亞族的常綠喬木[1]。檳榔主要種植在中國的海南和臺灣，海南95%以上的檳榔以干果的形式直接銷往湖南加工成食用檳榔(亦稱檳榔嚼塊)，還有少部分以鮮品形式直接作為咀嚼嗜好品在本地食用；在臺灣是以直接嚼食鮮品為主，并衍生出“檳榔西施”“紅唇族”等臺灣特有的檳榔文化[2]。如今，檳榔已發(fā)展成為海南第二大熱帶經(jīng)濟作物，僅次于天然橡膠[1，3]。

隨著檳榔產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展壯大，食用檳榔的質(zhì)量安全也備受關注。鮮果檳榔在干制煙熏成黑果時會污染苯并芘等有毒有害物質(zhì)，國際癌癥研究機構(gòu)已將苯并芘鑒定為1類致癌物(人類致癌物)[4]。文章歸納了食用檳榔中苯并芘的污染來源，對比介紹了幾種檳榔中苯并芘的檢測方法，旨在為食用檳榔中苯并芘的檢測提供參考。

1 食用檳榔中苯并芘的污染來源

食品中苯并芘的污染來源主要包括木材、石油不完全燃燒、食品加工過程、包裝材料污染以及瀝青中的苯并芘污染等途徑[5]。檳榔鮮果通常在綠熟期進行采摘，在海南經(jīng)初加工制成干果，再運銷湖南進一步加工制成檳榔嚼塊。檳榔初加工產(chǎn)品分為青果和黑果，青果是將檳榔鮮果進行蒸煮殺青，再烘干至水分含量為20%左右，制成無煙熏味的檳榔干果[6]；黑果則是利用傳統(tǒng)的煙熏烤爐將蒸煮殺青后的檳榔鮮果熏干，制成水分含量約26%的檳榔干果。經(jīng)煙熏的檳榔干果因有大量熏煙顆粒附著在其表皮而發(fā)黑，故稱為黑果[7]。傳統(tǒng)的煙熏烤爐是利用橡膠木材碎屑暗火燃燒熏干檳榔或是用蜂窩煤球直接熏干檳榔，熏煙中含有苯并芘，在高溫下隨著熏煙附著到檳榔表面，并逐步滲入內(nèi)部?？敌幍萚8]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)傳統(tǒng)煙熏烘烤方式加工制成的檳榔干果，其苯并芘殘留量高達26.52 μg/kg，參照GB 2762—2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》中谷物及其制品苯并芘殘留限量5 μg/kg，其含量為限量標準的5.3倍，而經(jīng)后加工制成食用檳榔后，苯并芘的含量降低到安全標準內(nèi)。在檳榔干果加工成檳榔嚼塊的過程中，經(jīng)泡籽、清洗、煮籽、蒸籽、烘烤、發(fā)制等多個加工工序，苯并芘含量大幅度下降[9]，嚴聃等[10]研究發(fā)現(xiàn)在食用檳榔加工過程中，通過清水反復清洗可使檳榔表面煙垢吸脹疏松，有利于后工序除去煙垢，再經(jīng)0.5%純堿和0.2% CMC混合液浸泡檳榔煙果，苯并芘殘留基本無檢出。但煙果檳榔加工過程中苯并芘的變化規(guī)律還有待進一步研究。

2 苯并芘的性質(zhì)及危害

苯并芘由5個熔融的苯環(huán)組成[11]，呈無色或淡黃色針狀晶體，熔沸點較高，不溶于水，密度比水大，微溶于甲醇、乙醇，易溶于苯、甲苯、正己烷等有機溶劑。苯并芘是多環(huán)芳烴類化合物的代表，具有很強的致癌性、致畸性和誘變性，常被作為多環(huán)芳烴的指標化合物[12]。苯并芘主要通過食物、飲用水及吸入污染空氣而進入人體，隨血液循環(huán)遍布全身，并在脂肪和乳腺細胞中不斷蓄積。Malik等[13]證實了苯并芘誘導乳腺癌發(fā)生的發(fā)病機理。張雪蓮等[14]研究表明，苯并芘暴露會增加肺癌發(fā)病率，并且隨誘導時間的延長，肺癌發(fā)病率和腫瘤數(shù)不斷升高。Widziewicz等[15]研究了部分燃燒煤炭、木材較多的地區(qū)，發(fā)現(xiàn)空氣中的苯并芘濃度高于2007/107/EC指令中苯并芘濃度目標值(1 ng/m3)2～5倍，長期暴露在含有苯并芘的空氣環(huán)境中，會造成慢性中毒，吸入性肺癌的發(fā)病率明顯提高。苯并芘還有生殖毒性，會導致哺乳類動物精子畸變[16]，導致胚胎畸變或死亡[17]。由于苯并芘的強致癌性，美國環(huán)境保護署已將其作為優(yōu)先污染物，并對其進行日常環(huán)境監(jiān)測[18]。

3 食用檳榔中苯并芘的檢測方法

3.1 前處理方法

被污染的食品中苯并芘含量極低，但微量的苯并芘對人體的危害也較大，且苯并芘性質(zhì)穩(wěn)定，因此對于較復雜的食品基質(zhì)，做好樣品的前處理對檢測結(jié)果的準確性尤為重要。目前，檢測苯并芘的前處理方法有固相萃取法[19]、超聲輔助基質(zhì)分散固相萃取法[20]、渦旋輔助液液萃取法[21]、QuEChERS法[22]等，其中固相萃取法是應用最廣泛的前處理方法。檳榔中粗纖維含量高，有機酸、多酚類物質(zhì)、生物堿等種類多樣，含量豐富，而脂肪、蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì)含量較少，且主要分布在檳榔果核中，果皮和果肉中含量較低[23-26]。基于食用檳榔這種特殊基質(zhì)，苯并芘檢測的前處理方法主要有固相萃取法(Solid Phase Extraction，SPE)、凝膠滲透色譜法(Gel Permeation Chromatography，GPC)和分散固相萃取法(Dispersive Solid Phase Extraction，DSPE)。

3.1.1 固相萃取法 SPE法是利用固體吸附劑將樣品中的待測組分與干擾組分分離的方法，該方法將待測組分吸附在萃取柱上，而干擾組分被洗脫除去，達到樣品凈化的目的。通常根據(jù)樣品性質(zhì)和提取溶劑性質(zhì)，選擇不同的吸附填料。常用的固相萃取柱有中性氧化鋁柱、分子印跡柱、PSA固相萃取柱、弗洛里硅土固相萃取柱等?，F(xiàn)行苯并芘國家檢測標準(GB 5009.27—2016《食品安全國家標準 食品中苯并芘的測定》)采用的前處理方法為正己烷溶劑提取，再用中性氧化鋁柱或分子印跡柱凈化樣品，液相色譜—熒光法檢測。梁振綱[27]基于國標方法對檳榔中苯并芘的前處理方法進行了改進，用正己烷提取，再用二甲基亞砜二次提取，采用PSA固相萃取柱凈化樣品，將凈化液用液相色譜—熒光檢測器進行檢測。由于PSA固相萃取柱對檳榔中的有機酸、色素、酚類等物質(zhì)有較好的分離效果，該方法顯著減少了圖譜雜峰，干擾峰響應降低了60%，而苯并芘響應無明顯變化，方法平均回收率為83.0%～114.5%，RSD為1.27%～ 6.78%，檢出限為1 μg/kg。何秀芬等[28]提出了一種測定干檳榔中痕量苯并-α-芘的氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法，樣品經(jīng)氫氧化鉀皂化，用正己烷溶劑提取，再用弗洛里硅土固相柱凈化，正已烷—二氯甲烷混合液(6+2)洗脫、濃縮，最后以氣—質(zhì)聯(lián)用進行檢測，該方法檢出限為0.5 μg/kg。

3.1.2 凝膠滲透色譜法 GPC法的分離原理為物理分離，不同體積大小的粒子流經(jīng)不同孔徑的色譜柱時，根據(jù)相對分子質(zhì)量的不同將分子進行分離，從而使樣液達到分離純化的效果[29]。喻璽等[30]研究了高效液相色譜—熒光檢測法檢測食用油中的苯并芘，發(fā)現(xiàn)凝膠滲透色譜法精密度高于中性氧化鋁柱和分子印跡柱兩種方法；凝膠滲透色譜、氧化鋁柱法、分子印跡柱法的平均回收率分別為100%，119%，90%，前者準確度高于后兩者。凝膠色譜能有效分離待測樣品中的油脂、蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì)，適用于脂肪等大分子物質(zhì)含量較高的物質(zhì)的檢測。

3.1.3 分散固相萃取法 DSPE法是將吸附填料直接加入到樣品提取液中，使之充分混合。干擾物則通過吸附劑吸附除去，得到凈化液，再上機分析[31-33]。王利等[34]建立了檢測食用檳榔中多環(huán)芳烴的氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用的方法，該方法將樣品用正己烷提取，提取液先經(jīng)凝膠滲透色譜柱凈化分離，收集凈化液，再選用硅膠作為分散吸附劑，與凈化液充分混合得到二次凈化液，再上機分析；同時對比了硅膠、Alumina-N、PSA 3種分散吸附劑，發(fā)現(xiàn)硅膠的加標回收效果最好，準確度最高；檢出限為0.2～1.0 ng/mL，RSD≤4.38%。

3.1.4 其他方法 鑒于只針對食用檳榔中苯并芘的檢測方法研究較少，而谷物類基質(zhì)與檳榔基質(zhì)相接近，以谷物及其制品為參考對象，學習借鑒谷物中苯并芘的檢測方法。黃坤等[35]建立了一種簡單、快速、準確可靠的高效液相色譜—熒光法檢測大米和小麥粉中苯并芘殘留的方法，該方法的檢出限為0.1 μg/kg，加標回收率為86.08%～98.17%。于海燕等[36]應用液相色譜—熒光法檢測谷物中15種多環(huán)芳烴，該方法的檢出限為0.02 μg/kg，加標回收率為90.0%～110%，靈敏度高、重現(xiàn)性好。阮麗萍等[37]建立了高效液相色譜—熒光法測定果蔬及谷物中PHAs的檢測方法，該方法的檢出限為0.1 μg/kg，回收率為60.0%～137.8%。上述方法簡化了前處理過程，精密度高、回收率穩(wěn)定，同時降低了檢測成本。

3.2 儀器分析方法

常見的食品中苯并芘的儀器分析方法有高效液相色譜—熒光法(High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detection，HPLC-FLD)、液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用檢測法(Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer，LC-MS)、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用檢測法(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)、表面增強拉曼光譜檢測法(Surface-enhanced Raman Spectroscopy，SERS)[38]。最常用的方法是HPLC-FLD法和GC-MS法。

3.2.1 HPLC-FLD法 利用苯并芘的熒光屬性，其熒光響應值與濃度構(gòu)成一定比例關系，可根據(jù)響應值計算得出樣品中的苯并芘含量。該方法結(jié)合了液相色譜的高效分離和熒光檢測器高靈敏度的優(yōu)點，但對樣品前處理要求較高。與液相色譜—紫外檢測法相比，HPLC-FLD法靈敏度和準確度更高。宋長虹等[39]比較了檢測食品中苯并芘的4種不同的前處理方法和2種不同的檢測器，發(fā)現(xiàn)熒光檢測器精密度高于紫外檢測器，最低檢出限分別為0.1，2.8 μg/kg。張海龍等[40]建立了高效液相色譜法檢測菜籽油中苯并芘的方法，該方法的加標回收率為87.0%～98.5%。

3.2.2 GC-MS法 利用氣相色譜將待測組分與干擾組分分離，再用質(zhì)譜對待測組分進行定性定量分析。質(zhì)譜檢測器具有高定性能力的優(yōu)點，幾乎能檢測出經(jīng)氣相色譜分離后的所有組分，但對色譜柱要求較高[41]。王磊等[42]利用GPC-GC-MS技術(shù)結(jié)合選擇離子掃描模式(Selective ion mode，SIM)建立了檢測花生油中苯并芘的方法，該方法的檢出限為0.5 ng/kg，平均回收率為93.2%～98.6%。楊玲等[43]對比了GC-MS和HPLC兩種測定苯并芘的儀器方法，發(fā)現(xiàn)GC-MS法的保留時間略短，兩種方法的精密度和檢出限均能較好地滿足環(huán)境水樣中苯并芘的檢測，但對基質(zhì)較復雜的實樣，GC-MS法可較好地避免雜峰的干擾。

3.2.3 LC-MS法 結(jié)合了液相色譜有效分離熱不穩(wěn)定性及高沸點化合物的分離能力和質(zhì)譜儀較強的定性定量分析能力，具有快速分析、高靈敏度、高分辨率鑒定和可分析多個化合物等優(yōu)點，是一種分離分析復雜有機混合物的有效方法。吳春英等[44]建立了超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測地溝油中黃曲霉毒素和苯并芘的分析方法，該方法的回收率為80.9%～115.6%，各目標物檢出限為0.091～0.210 μg/L。目前該方法由于溶劑難揮發(fā)，基質(zhì)效應高，不利于分辨，還處于發(fā)展階段，應用不夠普遍。

3.2.4 SERS法 利用待測物被吸附在金、銀等粗金屬表面時，拉曼散射的信號會較大程度地提高的原理，將待測物與表面增強拉曼光譜的活性基底結(jié)合，再利用光的拉曼散射效應對待測物進行定性定量分析。由于該方法具有快速、無標記、無損檢測等優(yōu)點，已被廣泛應用于食品和生物樣品中化學物質(zhì)的檢測。肖旺[45]制備了硫醇修飾的銀納米點陣列作為SERS活性基底，實現(xiàn)了水中苯并芘的快速檢測，并結(jié)合分子印跡技術(shù)分離凈化待測物，SERS方法進行分析，實現(xiàn)了食用油中苯并芘的檢測。王珊[46]制備了納米金修飾的氨基改性硅烷化擔體新材料作為SERS活性基底，用于快速檢測食用油中苯并芘殘留，檢出限為5.6 ng/mL。目前，SERS法還不夠成熟，不同物質(zhì)對基底的選擇性要求較高，不同材料同基底的吸附性也存在差異，穩(wěn)定性和重復性難以控制。

4 結(jié)論與展望

研究表明，苯并芘的前處理過程分為提取和凈化兩個過程，用固相萃取技術(shù)凈化居多，前處理過程仍存在操作繁瑣、耗時長、試劑毒性大等問題，且凈化過程中由于吸附劑會對待測物有一定吸附作用而造成待測物的損失，使得檢測結(jié)果偏低。由于目前對食用檳榔中的苯并芘殘留檢測技術(shù)研究較少，急需研究簡單、快速、準確的檳榔中苯并芘的檢測技術(shù)。

鑒于食用檳榔基質(zhì)相對簡單，在研究苯并芘化學檢測方法時可參考谷物類，省略凈化過程，改進儀器分析條件來提高目標物與雜質(zhì)的分離度。目前最常用的分析儀器是HPLC-FLD，具有較高的精密度和靈敏度，能滿足低含量樣品的精確定量分析。GC-MS和LC-MS具有高靈敏度和高分離能力，但成本較大，且耗時長，不適于大批量樣品的快速檢測。SERS技術(shù)適用于基質(zhì)簡單的樣品的快速檢測，具有簡單便攜、無標記、無損檢測等優(yōu)點，但目前技術(shù)發(fā)展還不夠成熟，對檳榔嚼塊中苯并芘的檢測有待研究。