張楠楠， 李鳳祥， 宋志鵬， 康金森， 李學(xué)軍， 毛新民,4

(1新疆醫(yī)科大學(xué)省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 2新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011；3北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系, 北京 100191； 4新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，為終末期腎衰的主要原因之一[1]，目前幾乎占所有終末期腎臟疾病的50%[2]，1型和2型糖尿病有20%～40%發(fā)展成為糖尿病腎病，嚴(yán)重威脅著糖尿病患者的生命及生活質(zhì)量。其病變進(jìn)展最終導(dǎo)致腎臟硬化、纖維化。如今，研究腎間質(zhì)纖維化以及腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化 (epithelial to mesenchymal transition，EMT)的發(fā)病機(jī)制、阻斷參與纖維化的信號(hào)通路，延緩糖尿病腎病纖維化，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。本文通過用高糖(HG)干預(yù)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)，建立體外糖尿病腎病模型，為課題組后期糖尿病腎病機(jī)制的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株 人近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2)，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清、0.2%雙抗的MEM培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱。

1.1.2 試劑 類胎牛血清/FBS(美國(guó),GBICO)，MEM培養(yǎng)液(美國(guó)，HYCLONE)，磷酸鹽緩沖液/PBS(以色列，BI),細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑盒/MTS(美國(guó)，PROMEGA),D-Glucose(美國(guó)，SIGMA),一抗E-cadherin，F(xiàn)N，β-actin(美國(guó),ABCAM),一抗GAPDH以及二抗(中國(guó),BIOSS)。

1.1.3 主要儀器 GelDocXR+凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad,美國(guó))，156-8001垂直電泳槽(Bio-Rad,美國(guó))，ZESS Axio Observer Z1倒置顯微鏡(ZEISS，德國(guó))，5427R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf,德國(guó))，Steri-Cult CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞活性與增殖試驗(yàn) 在96孔板中接種約每孔5 000個(gè)細(xì)胞，100 μL，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄上清液，用無血清的培養(yǎng)基配置不同濃度的D-glucose溶液，每孔加100 μL，設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24/48 h，然后每孔加入MTS溶液20 μL，37℃ 2 h后在酶標(biāo)儀中于490 nm處測(cè)吸光度(實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)。

1.2.2 Western Blot試驗(yàn)方法 接種HK-2細(xì)胞于10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合至70%～80%后，去掉上清液，加不同濃度的D-glucose的MEM培養(yǎng)基(不含血清)干預(yù)24/48 h，然后用RIPA裂解液提蛋白(含1%蛋白酶抑制劑，1%磷酸酶抑制劑，1%EDTA),BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度，加4×loading buffer在100℃變性蛋白5 min, 最終蛋白的濃度定至2 μg/μL，上樣10 μL，制備10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行上樣跑電泳(80 V濃縮膠，120 V分離膠)，至溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到玻璃板0.5 mm處停止電泳，在100 V條件下冰浴轉(zhuǎn)模，5%的脫脂奶粉封閉1.5 h，4℃搖床中孵育一抗(E-cadherin 1∶1 000, FN 1∶8 000, β-actin 1∶2 000,GAPDH 1∶2 000)過夜，TBST洗3次，每次10 min，避光常溫孵育二抗2 h，TBST洗3次，每次10 min，加顯色劑顯色，凝膠成像儀上拍照，測(cè)灰度值(實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)。

2 結(jié)果

2.1高糖對(duì)HK-2細(xì)胞活性的影響高糖是DN的獨(dú)立危險(xiǎn)因子,能使一些重要致纖維化細(xì)胞因子生成增加,進(jìn)一步誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，所以用D-glucose造EMT模型。從細(xì)胞水平確定造模濃度如圖1 所示，隨著高糖濃度和作用時(shí)間的增加，HK-2細(xì)胞活性呈現(xiàn)劑量依賴性的下降。高糖作用24 h時(shí)，與Control組相比,高糖在其濃度為60 mM時(shí)活性明顯下降(P<0.05)。高糖作用48 h時(shí)，與Control組相比，高糖在其濃度為30 mM出現(xiàn)了明顯下降(P<0.05)，60 mM時(shí)差異更顯著(P<0.01)。

2.2高糖對(duì)HK-2細(xì)胞形態(tài)的影響不同濃度的高糖干預(yù)HK-2細(xì)胞48 h后，可見部分細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣外觀: 細(xì)胞拉長(zhǎng)、肥大，呈長(zhǎng)梭形，由橢圓形貼壁生長(zhǎng)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，喪失其鋪路石樣生長(zhǎng)方式(EMT特征)。高糖濃度越大其形態(tài)變化越明顯，且細(xì)胞活性越差，細(xì)胞數(shù)量越少(圖2)。

2.3高糖抑制E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)FN的表達(dá)從蛋白水平確定造模濃度，與Control組相比，HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化前的標(biāo)志物E-cadherin隨著高糖濃度的增加表達(dá)量降低(圖3)。與Control組相比，HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化后的標(biāo)志物FN隨著高糖濃度的增加表達(dá)量逐漸增加，到150 mM時(shí)FN表達(dá)量下降可能是因?yàn)榧?xì)胞凋亡的緣故(圖4)。因此選擇高糖60 mM 為造模濃度，干預(yù)時(shí)間為48 h。

[細(xì)胞活性百分比用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)，與Control組相比, *P<0.05， **P<0.01, ***P<0.001]

Control HG 30 mM HG 60 mM HG 90 mM

[E-cadherin的蛋白表達(dá)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3); 與Control組相比, *P<0.05, **P<0.01， ***P<0.001]

[FN的蛋白表達(dá)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3); 與Control組相比, *P<0.05, **P<0.01]

3 討論

高糖是DN的獨(dú)立危險(xiǎn)因子,高糖能使一些重要致纖維化細(xì)胞因子生成增加,進(jìn)一步誘導(dǎo)EMT過程。加速腎臟纖維化是 DN 發(fā)病的潛在機(jī)制之一。研究表明D-葡萄糖可通過調(diào)節(jié)不同的通路從而促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究通過MTS細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn),顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化，以及Western Blot方法確定高糖的建模濃度為60 mM。與Control組相比，高糖以60 mM濃度作用48 h時(shí)，HK-2細(xì)胞活性顯著下降；細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生明顯變化：由橢圓形貼壁生長(zhǎng)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形樣；HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化前的標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)量明顯下降，轉(zhuǎn)分化后的標(biāo)志物FN明顯增加。

DN以細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM)蛋白的積累為特征(主要包括腎小球和腎小管間質(zhì)的各種膠原蛋白，層黏連蛋白和纖維連接蛋白以及基底膜的增厚),ECM的沉積隨后導(dǎo)致腎纖維化—腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化、炎性介質(zhì)的滲透，并激活α-SMA陽(yáng)性的肌成纖維細(xì)胞[3-6]。DN在發(fā)病早期即可出現(xiàn)糖尿病腎病纖維化，且不依賴腎小球病變直接加速腎功能惡化。在尿糖、尿蛋白、氧化應(yīng)激等病理性刺激下，腎小管上皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生多個(gè)結(jié)構(gòu)和功能的改變[7]，部分腎小管上皮細(xì)胞為對(duì)抗環(huán)境的損傷，逃脫潛在的凋亡，通過表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)入間質(zhì)，異常合成細(xì)胞外基質(zhì)，這一過程即為腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。而其中膠原、黏連蛋白等ECM組成物在腎小球系膜和腎小管間質(zhì)過度積累，占據(jù)正常組織的空間，最終導(dǎo)致蛋白尿、高血壓及腎功能損害[8]。因此，探索腎間質(zhì)纖維化以腎小管的EMT的發(fā)病機(jī)制、信號(hào)通路，延緩糖尿病腎病纖維化，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

腎病纖維化的精確程度雖然難以具體量化，但大量文獻(xiàn)表明EMT是糖尿病腎病肌成纖維細(xì)胞的主要來源。EMT主要發(fā)生于近曲小管細(xì)胞和足細(xì)胞。越來越多的證據(jù)表明EMT是患病腎臟中腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞的主要途徑[9-10]。Loeffler等[11]提出，EMT的存在在DN纖維化的發(fā)展過程中是不能忽視的，腎小管上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞具體在DN中轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞的量還未知。腎小管間質(zhì)纖維化是各種腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎(chǔ),研究證實(shí)腎小管間質(zhì)的損害程度與慢性腎衰竭患者的腎功能損害程度呈正相關(guān)。因此,腎小管間質(zhì)纖維化越來越受學(xué)者們的重視。故本文通過用高糖干預(yù)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)，建立體外糖尿病腎病模型，為課題組后期糖尿病腎病機(jī)制的研究打下基礎(chǔ)。