牟秋杰，嵇 波，李昱頡，劉俊彤，楊利娟，盧夢晗，李志剛

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD),又稱為“老年性癡呆”，約占所有癡呆的60%～80%，是以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶力減退為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]，其發(fā)病與年齡密切相關(guān)，在老年群體中屬常見病和多發(fā)病[2]，嚴(yán)重危害老年人的身心健康，且死亡率較高[3]。據(jù)國際阿爾茨海默病協(xié)會(huì)(ADI)發(fā)布的《2016年全球阿爾茨海默病報(bào)告》顯示，全球AD患者近4 700萬人，預(yù)計(jì)到本世紀(jì)中葉將會(huì)達(dá)到1.3億人，僅2018年全球用于治療AD的費(fèi)用就會(huì)達(dá)到1萬億美元。AD的發(fā)病與環(huán)境、遺傳、年齡、機(jī)體功能狀態(tài)等諸多因素相關(guān)，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，且各種機(jī)制相互影響，互為因果，所以AD的治療也相對復(fù)雜，而且療效不佳，只能在一定程度上改善其臨床癥狀，并不能延緩或阻止疾病的發(fā)展。因此，對AD發(fā)病機(jī)制、治療方案的探究顯得尤為緊迫和重要。

研究顯示，AD患者腦內(nèi)會(huì)出現(xiàn)大量β-淀粉樣蛋白(Aβ)的沉積并產(chǎn)生具有神經(jīng)毒性的老年斑(SP)；另外，AD患者腦內(nèi)還會(huì)出現(xiàn)Tau蛋白過度磷酸化[4]，導(dǎo)致神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)形成。Aβ沉積形成的SP和Tau蛋白過度磷酸化形成的NFTs被認(rèn)為是AD的兩大主要病理改變[5]，但隨著研究的深入，越來越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)活化所誘導(dǎo)的神經(jīng)炎性反應(yīng)已成為AD的第三大病理改變，大量Aβ的沉積會(huì)激活MG，產(chǎn)生具有嚴(yán)重神經(jīng)毒性炎性介質(zhì)[6]，導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷及凋亡，另外還會(huì)加速Aβ的沉積，形成惡性循環(huán)?！巴ǘ絾⑸瘛狈ㄊ潜本┲嗅t(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院李志剛教授經(jīng)過多年的臨床實(shí)踐總結(jié)出來的一套對神志類疾病有確切療效的針法，李志剛教授團(tuán)隊(duì)前期研究證實(shí)，“通督啟神”法電針能夠抑制AD模型小鼠海馬炎性反應(yīng)[7]、改善海馬神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)[8]、提高大腦葡萄糖代謝水平[9]等?；诖?，本實(shí)驗(yàn)選取7月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為模型小鼠，采用Morris水迷宮觀察其行為學(xué)變化，Western blot檢測其大腦皮層COX-2、TGF-β1表達(dá)情況，闡釋“通督啟神”法兩種電針治療AD的機(jī)理及療效差異。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

AD模型動(dòng)物為7月齡、SPF級、雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，正常對照組為同背景C57BL/6小鼠，體質(zhì)量(24.6±4.3)g，由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供，批號：SCXK(蘇)2015-0001。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑、藥物及儀器

兔多克隆COX-2抗體(英國，Abcam，ab15191)；兔多克隆TGF-β1抗體(美國，Proteintech，18978-1-AP)；鹽酸多奈哌齊(中國，衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，H20050978，5 mg/片×10片)；一次性使用無菌針灸針(中國，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司，ZYTH2013030504，0.25 mm×13 mm)；韓氏電針儀(中國，北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司，HANS-LH202)；音樂電針儀(中國，深圳圣祥高科技有限公司，ZJ-12H)；Morris水迷宮系統(tǒng)(中國，上海欣軟信息科技公司，XR-XM101)。

1.3 分組及干預(yù)

40只AD模型小鼠隨機(jī)分為模型組(AD model group，AD)、藥物組(Medicine group，M)、脈沖電針組(Electro-Acupuncture group，EA)、音樂電針組(Musical Electro-Acupuncture group，MEA)，C57BL/6小鼠為正常對照組(Normal Control Group，N)，每組10只，常規(guī)、單籠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)。

N組、AD組：與其他組同等條件束縛20 min；M組：鹽酸多奈哌齊0.92 mg/kg劑量灌胃給藥并同等條件束縛20 min；EA組：將小鼠固定于自制鼠套內(nèi)，印堂、百會(huì)均向后15°平刺進(jìn)針0.5 cm，針柄連接HANS-LH202電針儀20 min，疏密波，輸出頻率為2～50 Hz，水溝點(diǎn)刺不留針；MEA組：針刺同EA組，針柄連接ZJ-12H音樂電針儀20 min。每天1次，共15天。

1.4 檢測方法

1.4.1 隱蔽平臺實(shí)驗(yàn) 治療結(jié)束后第1天，為讓實(shí)驗(yàn)小鼠熟悉水迷宮環(huán)境，撤除目標(biāo)象限(第3象限)平臺，從第1象限將實(shí)驗(yàn)小鼠放入水池中自由游泳90 s；第2天至第6天恢復(fù)目標(biāo)象限平臺并正式實(shí)驗(yàn)，入水前將每只實(shí)驗(yàn)小鼠放于平臺上停頓10 s，然后頭朝水池壁，分別從第1象限和第2象限中點(diǎn)放入水池中，游泳登臺5 s停止記錄時(shí)間，即為當(dāng)次的逃避潛伏期，最長為90 s，兩次游泳時(shí)間的算術(shù)平均值即為當(dāng)天的逃避潛伏期。本實(shí)驗(yàn)主要測試實(shí)驗(yàn)小鼠的空間學(xué)習(xí)能力。

1.4.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)結(jié)束次日撤除目標(biāo)象限平臺，使實(shí)驗(yàn)小鼠頭朝水池壁，從第1象限中點(diǎn)放入水池中，記錄其目標(biāo)象限游泳時(shí)間/總時(shí)間和穿越平臺次數(shù)。本實(shí)驗(yàn)主要測試實(shí)驗(yàn)小鼠的空間記憶能力。

1.4.3 Western blot檢測 每組隨機(jī)選取5只實(shí)驗(yàn)小鼠斷頭處死(剩余5只用于本課題組其他相關(guān)指標(biāo)檢測)，迅速剝離大腦，取出大腦皮層置于無菌凍存管中液氮保存。每組新鮮大腦皮層加入含1 mmol/L-1PMSF的RIPA裂解液勻漿并提取總蛋白；然后4℃、10 000 r/min離心10 min，計(jì)算上樣量；SDS-PAGE電泳；把蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉37℃振蕩封閉1 h，加入一抗(COX-2 1∶1 500；TGF-β1 1∶3 000；β-actin 1∶5 000)4℃過夜；次日洗膜，加入二抗(1∶7 500)37℃振蕩孵育1 h；添加發(fā)光液，曝光顯影，標(biāo)定Marker，沖洗晾干，掃描分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠逃避潛伏期均呈下降趨勢，其中N組最明顯，其次依次為MEA組、EA組、M組，最后為AD組。見圖1。

實(shí)驗(yàn)第1天至第5天，N組與AD組的逃避潛伏期比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)，且差異逐漸加大；與AD組相比，第1天至第2天M組、EA組、MEA組的逃避潛伏期均減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，第3天至第5天出現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；與M組相比，第1天至第3天EA組、MEA組的逃避潛伏期均減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，第4天至第5天出現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，說明3種干預(yù)方法均能改善AD模型小鼠的空間學(xué)習(xí)能力，且EA組、MEA組優(yōu)于M組，但EA組、MEA組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1、圖1。

表1 不同組別逃避潛伏期比較

注：與N組相比，*P<0.05，**P<0.01；與AD組相比，##P<0.01；與M組相比，△P<0.01。

圖1 不同組別逃避潛伏期變化趨勢圖

2.2 各組空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

與N組相比，AD組目標(biāo)象限游泳時(shí)間/總時(shí)間、穿越平臺次數(shù)均減少(P<0.01)；與AD組相比，M組、EA組、MEA組目標(biāo)象限游泳時(shí)間/總時(shí)間、穿越平臺次數(shù)均增加(P<0.05或P<0.01)；與M組相比，MEA組目標(biāo)象限游泳時(shí)間/總時(shí)間增加(P<0.01)。說明3種干預(yù)方法均能改善AD模型小鼠的空間記憶能力，就目標(biāo)象限游泳時(shí)間/總時(shí)間而言，MEA組優(yōu)于M組，就穿越平臺次數(shù)而言，三者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

表2 不同組別目標(biāo)象限游泳時(shí)間/總時(shí)間、穿越平臺次數(shù)比較

注：與N組相比，**P<0.01；與AD組相比，#P<0.05，##P<0.01;與M組相比，△△P<0.01。

2.3 各組Western blot結(jié)果比較

與N組相比，AD組COX-2、TGF-β1表達(dá)均增加(P<0.01)；與AD組相比，M組、EA組、MEA組COX-2、TGF-β1表達(dá)均減少(P<0.01)，說明3種干預(yù)方法均能抑制模型小鼠大腦皮層炎性因子的表達(dá)；與M組相比，EA組、MEA組大腦皮層COX-2、TGF-β1表達(dá)減少(P<0.05或P<0.01)，但兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表3、圖2。

注：1為N組；2為AD組；3為M組；4為EA組；5為MEA組。圖2 不同組別大腦皮層COX-2、TGF-β1表達(dá)情況

表3 不同組別大腦皮層COX-2、TGF-β1表達(dá)比較

注：與N組相比，**P<0.01；與AD組相比，##P<0.01；與M組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

3 討論

AD屬中醫(yī)學(xué)“呆證”范疇，病機(jī)為“督脈受阻，神機(jī)失用”“髓消腦減”[10]?！澳X為元神之府”，與人的精神、神志功能密切相關(guān)；“督脈者，貫脊屬腎……入絡(luò)腦……”，督脈是貫通腦與腎的橋梁；腦為髓海，其源于腎之真陰真陽，緣督脈貫注于腦，若督脈受阻，則會(huì)髓消腦減、神機(jī)失用。“通督啟神”法的物質(zhì)基礎(chǔ)為“督脈-腦”系統(tǒng)，以“通督”為治療方案，達(dá)到“啟神”的目的，主要治療精神、神志類疾病[11]?！巴ǘ絾⑸瘛狈ㄓ捎√?、百會(huì)、水溝3穴組成：印堂屬于督脈穴，位于兩眉連線的中點(diǎn)，主要有通督安神的功效；百會(huì)位于頭的巔頂部位，為手太陽經(jīng)、足太陽經(jīng)、督脈、足厥陰經(jīng)的交會(huì)處，又稱為三陽五會(huì),直接與腦髓相通，對頭部疾病具有很好的療效；水溝穴位于人中溝中，又稱人中穴，為督脈穴位，對癔癥、呆證、癲狂癇、急慢驚風(fēng)等神志病癥療效較好，屬“十三鬼穴”。3穴皆位于頭部督脈循行線上，與腦髓相通，由“病變在腦，首取督脈”[12]“經(jīng)脈所過，主治所及”可知，印堂、百會(huì)、水溝3穴合用具有“通督啟神”之效。

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠是國際公認(rèn)的AD模型小鼠，廣泛用于AD的相關(guān)機(jī)理研究[13]。該模型小鼠大腦皮層Aβ沉積速度最快[14]，學(xué)習(xí)記憶功能隨著Aβ的沉積逐漸下降[15]；其腦內(nèi)Aβ沉積的分布區(qū)與AD患者的分布區(qū)比較相似[16]，在4、5月齡時(shí)大腦皮層就已經(jīng)出現(xiàn)了SP的沉積并出現(xiàn)了認(rèn)知功能障礙[17]，且漸進(jìn)性加重，對AD患者的病理變化和行為學(xué)改變有很好的模擬作用[18]，較10月齡而言，6～7月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠對認(rèn)知功能的模擬作用更優(yōu)，其可能是電針干預(yù)AD的最佳時(shí)期[19]，因此本實(shí)驗(yàn)的研究對象為7月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠。另外，通過長期臨床實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)評估，第二代膽堿酯酶抑制劑鹽酸多奈哌齊具有高選擇性、可逆性優(yōu)勢，可提高膽堿系統(tǒng)的活性和藥物的敏感性[20]、減少乙酰膽堿的水解、降低Aβ的神經(jīng)毒性等，從而起到改善患者臨床癥狀的作用，是治療輕、中度AD的經(jīng)典有效藥和首選藥，因此本實(shí)驗(yàn)選取鹽酸多奈哌齊為藥物組的治療用藥。

Aβ在AD患者腦內(nèi)的大量沉積會(huì)激活MG，產(chǎn)生能夠?qū)е律窠?jīng)元損傷及凋亡的炎性介質(zhì)。由前列腺素(PGs)合成的誘導(dǎo)型限速酶環(huán)氧化酶2(COX-2)是環(huán)氧化酶(COX)的一種亞型，當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞激活后其表達(dá)水平顯著增加，催化花生四烯酸產(chǎn)生PGs參與神經(jīng)系統(tǒng)的炎性反應(yīng)，是炎性反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的決定因素之一，與AD的發(fā)病密切相關(guān)，能促進(jìn)SP的形成并加速M(fèi)G的活化。研究證實(shí)，APP轉(zhuǎn)基因小鼠中COX-2表達(dá)的增加會(huì)引起小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的變性，產(chǎn)生慢性炎癥和神經(jīng)毒性作用，損傷神經(jīng)系統(tǒng)[21]。由于COX-2與AD關(guān)系密切，神經(jīng)元中COX-2的早期表達(dá)是AD患者發(fā)展為癡呆的重要標(biāo)志，揭示其可能增加AD的易感性，可能成為治療AD的新靶點(diǎn)。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是TGF-β的一種亞型，其在正常腦組織中的表達(dá)水平不高，僅少量表達(dá)于大腦皮質(zhì)、腦膜及脈絡(luò)膜叢細(xì)胞，但在病理?xiàng)l件下，病變部位的表達(dá)水平就明顯增加[22]，研究證實(shí)，APP轉(zhuǎn)基因小鼠如果同時(shí)表達(dá)TGF-β1，其腦內(nèi)Aβ的沉積便會(huì)加速，同時(shí)還會(huì)誘導(dǎo)APP的高表達(dá)，加速腦內(nèi)Aβ的沉積[23],因此，TGF-β1在Aβ的沉積和SP的形成中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，“通督啟神”法兩種電針均能改善模型小鼠的認(rèn)知功能，降低大腦皮層COX-2、TGF-β1的表達(dá)，說明兩種電針均是治療AD行之有效的方法，但兩者的療效并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其治療AD的機(jī)理可能與抑制MG活化、降低大腦皮層COX-2、TGF-β1的表達(dá)有關(guān)，但其深層機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。