孫曉偉，劉婷婷，孫忠人，王 博，劉 昊，張 菶，劉 丹，陳英華，金 弘，李洪濤，△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江省立同德醫(yī)院，浙江 杭州 310012)

腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)是急性腦梗死再通后常見的病理過程，腦缺血再灌注后會引發(fā)一系列的損傷級聯(lián)反應(yīng)，包括鈣穩(wěn)態(tài)失衡、興奮性氨基酸的毒性作用、氧化應(yīng)激損傷、線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元程序性死亡等[1-2]。自噬作為新發(fā)現(xiàn)的程序性細(xì)胞死亡方式，對于CIRI后神經(jīng)細(xì)胞的“生存”與“死亡”意義重大[3]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，頭針對腦缺血再灌注后腦損傷及腦水腫具有拮抗作用[4]，可抑制TLR4/MyD88介導(dǎo)的免疫炎性反應(yīng)[5]，降低大鼠腦組織中相關(guān)凋亡基因的表達(dá)，從而抑制缺血灶周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡[6]，對CIRI后神經(jīng)細(xì)胞和血腦屏障具有保護(hù)作用。因此，本研究以局灶性大腦中動脈缺血再灌注(MCAO/R)模型大鼠為研究對象，探討頭穴透刺配合電針對MCAO/R大鼠不同時間點(diǎn)神經(jīng)功能以及自噬相關(guān)蛋白LC3A/B動態(tài)表達(dá)的影響，以期闡明針刺是否通過調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞自噬發(fā)揮其拮抗CIRI的作用，為電針治療急性腦梗死提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

75只SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量260～300 g，采購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號：SCXK(黑)2015-0023。自噬抑制劑3-MA(美國Abcam，ab120841)；Anti-LC3A/B(美國Abcam，ab128025)；PV-6001二步免疫組化檢測試劑盒(中杉金橋)；多聚甲醛(分析純，天津福辰化學(xué)試劑公司)；Na2HPO4·12H2O(分析純，北京化學(xué)試劑公司)；NaH2PO4·2H2O(分析純，北京化學(xué)試劑公司)；二甲苯(北京化學(xué)試劑公司)；蘇木精(北京化學(xué)試劑公司)；伊紅(北京化學(xué)試劑公司)；無水乙醇(北京化工廠)；HCL(北京化工廠)；NaOH(北京化工廠)；NaCl(北京化工廠)；固體蠟(Mccormick，56℃融點(diǎn))；甘油(科海軍舟)。華佗牌針灸針(蘇州醫(yī)療用品有限公司)；OLYMPUS BX 43顯微鏡；Image-Pro Plus6.0計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(美國，Larser Sharp)。

1.2 動物分組

Sprague-Dawley大鼠75只，隨機(jī)分為A組(假手術(shù)組)、B組(模型組)、C組(電針組,模型+電針)、D組(3-MA組,模型+3-MA)、E組(電針+3-MA組,模型+3-MA+電針)，每組15只，同時每組又隨機(jī)分為腦缺血2 h再灌注24 h、72 h、7天3個亞組，每個亞組5只。

1.3 模型制作

采用線栓法(即改良的Zea Longa法[7])，進(jìn)行右側(cè)MCAO缺血2 h再灌注大鼠模型制作；評價模型是否成功主要參照Zea Longa 5分法進(jìn)行，評分在1至3分之間者被認(rèn)定為成功模型，并納入到實(shí)驗(yàn)中。A組(假手術(shù)組)大鼠在手術(shù)過程中不中斷大腦中動脈血流，僅將線栓插至12 mm處即可。

1.4 干預(yù)處理

C組和E組于大鼠造模蘇醒后15 min，立即行針刺治療。參考《實(shí)驗(yàn)動物穴位圖譜》進(jìn)行大鼠穴位定位，選取病灶側(cè)百會穴、曲鬢穴、前頂穴和懸厘穴，分別從百會穴透刺至曲鬢穴、從前頂穴透刺至懸厘穴，15°進(jìn)針，透刺深度約20 mm，連接G6805-Ⅱ型電針治療儀，百會透曲鬢穴接負(fù)極，前頂透懸厘穴接正極，選用疏密波、4/20 Hz頻率、1～3 mA電流，治療30 min，每12 h針刺1次。D組和E組于大鼠造模前30 min側(cè)腦室注射自噬抑制劑3-MA(400 nM)。A組和B組大鼠不給予任何干預(yù)。

1.5 神經(jīng)功能評分測定

采用Krafft[8]復(fù)合神經(jīng)功能評分,見表1，最低分3分、最高分21分;懸線測試評分,見表2，最低分0分、最高分5分;平衡行走測試評分,見表2，最低分0分、最高分5分。分別在IR24 h、IR72 h、IR7 d，測定各組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分，損傷越重分值越低。

表1 復(fù)合神經(jīng)功能評分

表2 懸線測試和平衡行走測試評分

1.6 免疫組化檢測LC3 A/B蛋白方法

各組大鼠在IR24 h、IR72 h、IR7 d神經(jīng)功能評分測定完畢后，將大鼠進(jìn)行麻醉，打開胸腔，充分暴露心臟，分別用0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛進(jìn)行灌注，斷頭取腦，后固定液固定24 h，脫水透明后進(jìn)行石蠟包埋，切成4 μm厚切片。將切片進(jìn)行脫蠟、脫水、抗原修復(fù)、酶滅活、封閉，1∶1 000濃度LC3A/B抗體濕盒孵育過夜，復(fù)溫后二抗孵育30 min，DAB顯色、復(fù)染、酒精透明、甘油封片，顯微鏡攝片，用病理圖像分析系統(tǒng)計(jì)算5個不同視野的陽性細(xì)胞數(shù)，并取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠復(fù)合神經(jīng)功能評分結(jié)果

再灌注后不同時間點(diǎn)，A組(假手術(shù)組)大鼠表現(xiàn)正常，無明顯的神經(jīng)缺損體征出現(xiàn)，而MCAO/R造模成功的大鼠均表現(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損的體征。與A組比較,差異極顯著(P<0.01)。B組(模型組)大鼠再灌注后不同時間點(diǎn)神經(jīng)功能表現(xiàn)出不同程度的損傷：再灌注24 h(IR24 h)大多數(shù)大鼠自發(fā)性活動差，其運(yùn)動范圍只能接觸到籠子的其中一個面，四肢肢體運(yùn)動出現(xiàn)不對稱，側(cè)身轉(zhuǎn)動反應(yīng)慢，軸向感覺和觸須本體感覺基本缺失，爬行能力較弱，僅能向上不對稱爬行小段距離，或僅原地轉(zhuǎn)圈；IR72 h上述神經(jīng)功能缺損體征表現(xiàn)最為嚴(yán)重；而IR7 d其各項(xiàng)神經(jīng)功能逐漸有所恢復(fù)，說明大鼠自身有一定的神經(jīng)功能恢復(fù)能力。C組(電針組)：針刺干預(yù)治療24 h后，MCAO/R大鼠未見明顯神經(jīng)功能恢復(fù)，隨著針刺時間的延長和針刺次數(shù)的增多，在IR72 h、IR7 d時大鼠神經(jīng)功能缺失均有明顯減輕,與B組比較差異極顯著(P<0.01)。D組(3-MA組)：給予自噬抑制劑3-MA的大鼠在IR24 h、IR72 h神經(jīng)功能缺損體征均較B組更為嚴(yán)重,兩組比較差異顯著(P<0.05)；而IR7 d時與B組神經(jīng)功能缺損體征基本一致。E組(電針+3-MA組)：在3-MA干預(yù)的基礎(chǔ)上給予針刺治療的MCAO/R大鼠，其神經(jīng)功能缺損情況無明顯改善,與B組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠復(fù)合神經(jīng)功能評分比較

注：與A組比較,△P<0.01；與B組比較,#P<0.05。

2.2 各組大鼠懸線測試評分結(jié)果

再灌注后不同時間點(diǎn)，評估MCAO/R造模成功的大鼠1 min之內(nèi)懸線測試，均表現(xiàn)出不同程度的損傷。B組(模型組)：IR24 h時部分大鼠能在距離地面40 cm高、50×0.15 cm線上堅(jiān)持至少30 s，或在線上移動幾十厘米；IR72 h時表現(xiàn)最差，堅(jiān)持時間不足30 s或有少數(shù)大鼠掉落現(xiàn)象；IR7 d時逐漸恢復(fù)，爬行距離延長。C組(電針組)：IR24 h、IR72 h時懸線測試得分無明顯改善，隨著針刺次數(shù)和治療時間的延長，在IR7 d時懸線測試得分有所提高,與B組比較差異顯著(P<0.05)；D組(3-MA組)：各個時間點(diǎn)與B組比較無明顯差異；E組(電針+3-MA組)：在3-MA干預(yù)的基礎(chǔ)上給予電針治療無明顯改善。見表4。

表4 各組大鼠懸線測試評分比較

注：與A組比較,△P<0.01；與B組比較,#P<0.05。

2.3 各組大鼠平衡行走測試評分結(jié)果

再灌注后不同時間點(diǎn)，評估MCAO/R造模成功的大鼠1 min之內(nèi)平衡行走測試，均表現(xiàn)出不同程度的損傷。B組(模型組)：IR24 h時部分大鼠能在距離地面40 cm高、90×1 cm的水平木板上，60 s內(nèi)至少移動22.5 cm；IR72 h時表現(xiàn)最差，60 s內(nèi)移動距離小于22.5 cm或少數(shù)大鼠不移動；IR7 d時逐漸恢復(fù)，部分大鼠能在60 s內(nèi)達(dá)到平臺。C組(電針組)：IR24 h、IR72 h時平衡行走測試得分無明顯改善，隨著針刺次數(shù)和治療時間的延長，在IR7 d時平衡行走測試得分有所提高,與B組比較差異顯著(P<0.05)；D組(3-MA組)：各個時間點(diǎn)與B組比較無明顯差異；E組(電針+3-MA組)：在3-MA干預(yù)的基礎(chǔ)上給予電針治療無明顯改善。見表5。

表5 各組大鼠平衡行走測試評分比較

注：與A組比較,△P<0.01；與B組比較,#P<0.05。

2.4 各組大鼠腦組織LC3A/B蛋白免疫組化結(jié)果

光學(xué)顯微鏡下，DAB顯色的LC3A/B陽性細(xì)胞呈淡黃色或棕黃色，主要表達(dá)于缺血神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中。由表6可見，A組(假手術(shù)組)在再灌注不同時間點(diǎn)LC3A/B蛋白表達(dá)無明顯差異，而B組(模型組)大鼠在IR24 h、IR72 h、IR7 d有明顯的LC3A/B蛋白表達(dá)上升,與A組比較差異顯著(P<0.05)，并在IR72 h時達(dá)到高峰。C組(電針組)大鼠在IR72 h，LC3A/B蛋白表達(dá)較B組明顯升高(P<0.05)，而在IR7 d時LC3A/B蛋白表達(dá)較B組又出現(xiàn)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。D組(3-MA組)能明顯下調(diào)LC3A/B蛋白含量表達(dá)，而在抑制劑基礎(chǔ)上給予電針干預(yù)能在IR72 h、IR7 d上調(diào)蛋白的表達(dá),與D組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05。見表6、封三彩圖1。

表6 各組大鼠腦組織中LC3A/B蛋白陽性細(xì)胞的比較

注：與A組比較,△P<0.01；與B組比較,#P<0.05；與D組比較,☆P<0.05。

3 討論

自噬是存在于真核細(xì)胞中的一種溶酶體降解途徑[9]，參與了多種細(xì)胞的蛋白降解過程，主要是指利用自噬-溶酶體系統(tǒng)，通過吞噬胞質(zhì)內(nèi)容物形成自噬體，包裹受損的細(xì)胞器(如線粒體、過氧化物酶體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，對其內(nèi)容物進(jìn)行降解，從而達(dá)到對受損細(xì)胞器的自我修復(fù)的目的。目前，越來越多的研究表明,腦缺血及缺血再灌注均可激活自噬溶酶體途徑[10-11]，因此，調(diào)控與自噬有關(guān)的信號通路、調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞自噬水平有望成為治療缺血性卒中的新策略[12-15]。

針灸治療中風(fēng)病歷史悠久、療效確切，且中風(fēng)病現(xiàn)已被WHO推薦為針灸療法治療有效的43個優(yōu)勢病種之一。針刺“百會”透“曲鬢”“前頂”透“懸厘”是課題組根據(jù)中醫(yī)學(xué)臟腑經(jīng)絡(luò)理論和現(xiàn)代大腦機(jī)能定位在頭皮部投影理論，總結(jié)的治療中風(fēng)病療效突出的經(jīng)驗(yàn)要穴?！端貑枴っ}要精微論》:提出“頭者精明之府”，頭部是經(jīng)氣匯集的重要部位，與人體各臟腑器官的功能有密切關(guān)系，“百會”透“曲鬢”“前頂”透“懸厘”橫跨額、頂、顳3區(qū)，有督脈、足太陽膀胱經(jīng)和足少陽膽經(jīng)貫穿，可開竅醒神；同時此穴區(qū)正是運(yùn)動區(qū)和感覺區(qū)在頭皮的投影部位，因此在此穴區(qū)進(jìn)行透刺，可明顯改善患者的運(yùn)動、感覺障礙。配合電針療法又可進(jìn)一步持久地將針刺刺激產(chǎn)生的效應(yīng)傳導(dǎo)至大腦皮層，從而促進(jìn)神經(jīng)功能的修復(fù)與重塑[16]。

細(xì)胞自噬主要分為基礎(chǔ)自噬和誘導(dǎo)自噬。每個正常機(jī)體，體內(nèi)細(xì)胞均存在基礎(chǔ)自噬(屬生理性自噬)，為細(xì)胞代謝提供所需能量、維持其穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)其生長發(fā)育[17-18]。如果機(jī)體的營養(yǎng)充足，細(xì)胞自噬只為較低水平的基礎(chǔ)自噬；而一旦發(fā)生缺血缺氧、再灌注或營養(yǎng)缺乏時，機(jī)體就會啟動多種信號發(fā)生誘導(dǎo)自噬，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，進(jìn)而對細(xì)胞損傷起保護(hù)作用。但是如果誘導(dǎo)自噬激活太過，又往往會引起過多的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡(即Ⅱ型程序性死亡)，并與凋亡、壞死發(fā)生交互作用，進(jìn)一步加重機(jī)體損傷[19-22]。

由此可見，自噬具有雙重作用，腦缺血再灌注后，由于缺血缺氧、氧化應(yīng)激、能量供應(yīng)障礙等可使機(jī)體發(fā)生誘導(dǎo)自噬，在再灌注早期，自噬的適度激活可幫助清除受損的細(xì)胞器和異常蛋白，從而對神經(jīng)細(xì)胞損傷起保護(hù)作用；而再灌注中晚期由于再灌注損傷引起的一系列級聯(lián)瀑布反應(yīng)的持續(xù)刺激，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞過度激活，從而引起自噬性細(xì)胞死亡或凋亡，加重神經(jīng)細(xì)胞損傷。中醫(yī)學(xué)的針灸療法具有整體的良性雙向調(diào)節(jié)作用，且其治病具有多途徑、多角度、多水平、多階段的整體調(diào)節(jié)作用特點(diǎn)，因此，本研究以MCAO/R大鼠為研究對象，探討電針對腦缺血再灌注模型大鼠缺血半暗帶區(qū)自噬相關(guān)蛋白LC3A/B表達(dá)的影響，旨在闡明該療法是否通過調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞自噬水平發(fā)揮其拮抗CIRI的作用。

LC3是目前應(yīng)用最廣泛的自噬體分子標(biāo)記物，包括LC3-II(LC3B)和LC3-I(LC3A)兩種存在形式，并且這兩種形式可互相轉(zhuǎn)換。在細(xì)胞內(nèi)新合成的LC3，經(jīng)過加工后成為可溶形式的LC3-I，在泛素化修飾與自噬體膜表面PE結(jié)合形成膜結(jié)構(gòu)的LC3-II[23]。LC3-II與自噬體的形成密切相關(guān)，LC3-II的數(shù)量或LC3-II/I的比例大小反應(yīng)了自噬水平的高低[24]。本研究采用免疫組化染色方法對MCAO/R大鼠缺血半暗帶區(qū)皮層組織的LC3A/B蛋白表達(dá)進(jìn)行了觀察，結(jié)果表明模型組大鼠在再灌注不同時間點(diǎn)LC3A/B蛋白均具有較高表達(dá)，并在IR72 h時達(dá)到高峰，說明CIRI后自噬被誘導(dǎo)激活；電針組在IR72 h，明顯上調(diào)LC3A/B蛋白的表達(dá)，使得LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化，進(jìn)而增加自噬體的數(shù)目，提高了自噬的水平；而在IR7d，又明顯下調(diào)LC3A/B蛋白的表達(dá)，減少自噬體的形成，抑制誘導(dǎo)自噬的過度激活。在造模前給予自噬抑制劑3-MA后，3-MA可通過抑制細(xì)胞自噬，解除電針的神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，通過比較各組大鼠神經(jīng)功能缺損體征評分可以看到，頭針透刺配合電針具有很好的降低受損大鼠神經(jīng)功能缺損評分的作用，而抑制自噬則可進(jìn)一步加重大鼠神經(jīng)功能缺損。結(jié)合自噬相關(guān)蛋白檢測結(jié)果分析，頭針透刺配合電針促進(jìn)MCAO/R大鼠自噬水平具有雙向良性調(diào)節(jié)作用，在腦缺血再灌注早期可通過上調(diào)缺血半暗帶LC3A/B蛋白表達(dá)、適度激活MCAO/R大鼠的神經(jīng)細(xì)胞自噬，保護(hù)受損的神經(jīng)元；而在再灌注中晚期又可下調(diào)缺血半暗帶LC3A/B蛋白表達(dá)、抑制MCAO/R大鼠神經(jīng)細(xì)胞自噬的過度激活，從而發(fā)揮其拮抗腦缺血再灌注損傷的作用。