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(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲科，重慶 400037)

超聲化療通過(guò)低強(qiáng)度超聲激勵(lì)造影劑微泡空化，暫時(shí)性開(kāi)放血管壁、增加細(xì)胞膜通透性(聲孔效應(yīng))，提高腫瘤局部化療藥物濃度，因有望逆轉(zhuǎn)部分化療抵抗而成為目前相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[1-3]。利用診斷超聲實(shí)施腫瘤超聲化療，兼具實(shí)時(shí)影像定位、能量低、安全性高、臨床轉(zhuǎn)化快等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。診斷超聲調(diào)控微泡空化的最主要參數(shù)為機(jī)械指數(shù)(mechanical index, MI)。本研究建立裸鼠人胰腺癌荷瘤模型，分析不同MI條件下診斷超聲聯(lián)合微泡對(duì)腫瘤局部血流及化療藥物釋放的影響。

1 材料與方法

1.1 模型建立及分組 選取4周齡雄性裸鼠45只[由陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SYXK(渝)20170002]，體質(zhì)量10～12 g。將人源胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞置于37℃、5% CO2孵化箱內(nèi)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合面積時(shí)行胰酶消化處理。以1 000 rot/min轉(zhuǎn)速離心5 min后，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline， PBS)重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×107～8×107/ml。采用無(wú)菌注射器分別于裸鼠雙側(cè)后腿內(nèi)側(cè)注射0.1 ml細(xì)胞懸液，成功建立裸鼠人胰腺癌荷瘤模型33只，約20天后觸診評(píng)估腫瘤大小，待腫瘤最大徑0.5～1.0 cm時(shí)將其隨機(jī)分為A、B、C組，每組11只。

1.2 化療及超聲處理 將荷瘤裸鼠按0.007 ml/g體質(zhì)量腹腔注射1%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉后，仰臥位保定于操作臺(tái)，建立尾靜脈通道。采用飛依諾VINNO 70彩色多普勒超聲診療一體機(jī)，X4-12L淺表高頻線陣探頭，靜脈團(tuán)注0.02 ml脂氟顯微泡造影劑(由陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲科自行研發(fā)，外層為磷脂外膜，核心氣體為全氟丙烷，粒徑2.0 μm，濃度2×109～9×109/ml)行超聲造影。造影結(jié)束后，按0.010 ml/g體質(zhì)量靜脈緩慢推注1 mg/ml阿霉素(doxorubicin， DOX)。之后隨機(jī)選取荷瘤裸鼠一側(cè)后腿為治療側(cè)，行超聲輻照；另一側(cè)為對(duì)照側(cè)，行超聲假照。超聲診療設(shè)備具有調(diào)控微泡空化的Vflash模式，可調(diào)節(jié)與微泡空化相關(guān)參數(shù)，主要包括MI、中心頻率、脈沖寬度(pulse length, PL)、脈沖重復(fù)頻率(pulse repetition frequency, PRF)和脈沖/間歇時(shí)間。對(duì)3組荷瘤裸鼠治療側(cè)均采用中心頻率4 MHz、PL 18個(gè)周期、PRF 50 Hz，脈沖/間歇時(shí)間0.48 s/2 s進(jìn)行輻照；A組MI 0.3，B組MI 0.7，C組MI 1.1。超聲輻照時(shí)，探頭距腫瘤表面1 cm，調(diào)整治療ROI，使其包括腫瘤及周邊0.5 cm范圍組織(圖1)后開(kāi)始輻照，共輻照10 min。輻照/假照過(guò)程中，實(shí)時(shí)推注微泡(0.02 ml脂氟顯微泡造影劑稀釋于1 ml生理鹽水，整個(gè)輻照過(guò)程共推注0.4 ml)。輻照后約10 min，待造影劑基本廓清后，再次行荷瘤裸鼠雙側(cè)后腿腫瘤超聲造影。

1.3 DOX藥物濃度檢測(cè) 每組中任意選取10只荷瘤裸鼠，于超聲輻照/假照結(jié)束后1 h，在充分麻醉情況下剪開(kāi)裸鼠胸腔，充分暴露心臟，經(jīng)左心室插入8號(hào)平頭針至主動(dòng)脈，緩慢灌注生理鹽水，同時(shí)剪開(kāi)右心房引流出灌注液，直至流出液變清亮后剪取裸鼠雙側(cè)后腿部腫瘤組織。將腫瘤組織標(biāo)本置于1 ml高氯酸溶液中(濃度0.1 mmol/L)，采用Bertin Precellys 24型研磨細(xì)胞破碎儀，以6 000 rot/min速率勻漿5 s，間歇20 s，循環(huán)3次。于4℃條件下靜放置30 min后，以 14 000 rot/min高速離心5 min，取上清液，萃取腫瘤內(nèi)DOX。采用Waters 2475高效液相色譜儀測(cè)定腫瘤組織內(nèi)的DOX藥物濃度。

1.4 超聲造影定量分析 分析超聲輻照/假照前后造影圖像，勾畫(huà)包含整個(gè)腫瘤組織的ROI，通過(guò)時(shí)間-強(qiáng)度曲線獲得峰值強(qiáng)度(peak intensity, PI)及AUC。

1.5 組織病理檢查 對(duì)每組中DOX藥物濃度檢測(cè)后剩余的1只荷瘤裸鼠腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行取材，方法同前。將腫瘤組織標(biāo)本固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋、切片、HE染色后，采用Olympus BX63正置熒光顯微鏡觀察腫瘤組織結(jié)構(gòu)改變。

1.6 MI對(duì)應(yīng)峰值負(fù)壓測(cè)定 超聲輻照/假照前，采用ONDA薄膜水聽(tīng)器測(cè)量不同MI對(duì)應(yīng)的峰值負(fù)壓范圍(探頭單根線測(cè)量，取幅值最大的線)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)各組治療側(cè)與對(duì)照側(cè)、超聲輻照/假照前與超聲輻照/假照后進(jìn)行比較；不符合正態(tài)分布則以中位數(shù)(上下四分位數(shù))表示，采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織DOX藥物濃度 A、B、C組治療側(cè)腫瘤組織DOX藥物濃度分別為(1.45±0.53)μg/g、1.75(1.60，1.80)μg/g和1.13(0.65，1.33)μg/g，對(duì)照側(cè)分別為(1.07±0.46)μg/g、1.76(1.72，1.78)μg/g和1.04(0.71，1.33)μg/g。A組治療側(cè)藥物濃度明顯高于對(duì)照側(cè)(t=-5.163，P=0.001)；B組及C組治療側(cè)與對(duì)照側(cè)藥物濃度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-0.297、-0.357，P=0.766、0.721)。

2.2 超聲造影定量指標(biāo) 與超聲輻照/假照前比較，A、B、C組輻照后治療側(cè)PI均升高、AUC均增大(圖1)，A、C組假照后對(duì)照側(cè)PI均升高，A組假照后對(duì)照側(cè)AUC增大(P均<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 腫瘤組織病理表現(xiàn) 大體觀察，A、B、C組腫瘤組織超聲輻照/假照后均未見(jiàn)明顯改變，瘤塊呈淡黃色，質(zhì)地堅(jiān)韌，腫瘤中心未見(jiàn)明顯壞死區(qū)域。HE染色后鏡下觀察見(jiàn)腫瘤組織主要由胰腺癌細(xì)胞和結(jié)締組織構(gòu)成，腫細(xì)胞呈索狀排列，核大、深染，呈明顯異型性，未見(jiàn)明顯出血及細(xì)胞腫脹(圖2)。

2.4 實(shí)測(cè)峰值負(fù)壓 A組(MI 0.3)實(shí)測(cè)峰值負(fù)壓0.81～0.83 MPa，B組(MI 0.7)為0.96～1.32 MPa，C組(MI 1.1)為2.29～2.53 MPa。

3 討論

目前已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[6]及臨床研究[7]證實(shí)低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡可有效增強(qiáng)腫瘤化療療效,空化效應(yīng)在其中起到關(guān)鍵作用。調(diào)控空化效應(yīng)的目的是在提高腫瘤局部化療藥物濃度的同時(shí)，避免由其造成的不良反應(yīng)，其中調(diào)節(jié)峰值負(fù)壓尤為重要。峰值負(fù)壓在診斷超聲中主要以MI的形式呈現(xiàn)。Dimcevski等[8]利用MI為0.2的診斷超聲聯(lián)合微泡增強(qiáng)胰腺癌的化療效果，使患者中位生存期延長(zhǎng)8.9個(gè)月。Lin等[9]利用1.2 MPa低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡增益荷瘤裸鼠化療的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明其有效提高了腫瘤局部藥物濃度。

表1 各組裸鼠人胰腺癌荷瘤模型輻照前后超聲造影定量指標(biāo)比較(n=10)

圖1 裸鼠人胰腺癌荷瘤模型超聲造影表現(xiàn)，A組(MI 0.3) A.超聲輻照/假照前裸鼠雙側(cè)后腿移植瘤超聲造影圖像，左側(cè)為治療側(cè)，右側(cè)為對(duì)照側(cè)，白色圓形區(qū)域?yàn)镽OI； B.超聲輻照后超聲造影示治療側(cè)(左側(cè))微泡灌注量較超聲輻照前明顯增多； C.ROI的時(shí)間-強(qiáng)度曲線

圖2 裸鼠人胰腺癌荷瘤模型組織病理圖(HE，×100) A、B.A組(MI 0.3)對(duì)照側(cè)(A)及治療側(cè)(B)； C.B組(MI 0.7)治療側(cè)； D.C組(MI 1.1)治療側(cè)

超聲化療雖能增強(qiáng)腫瘤局部藥物濃度，從而提高化療療效，但目前對(duì)超聲輻照MI的選擇缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究中，選取3種不同MI的診斷超聲聯(lián)合微泡作用于裸鼠人胰腺癌荷瘤模型，發(fā)現(xiàn)當(dāng)MI為0.3時(shí)，治療側(cè)腫瘤組織內(nèi)DOX藥物濃度較對(duì)照側(cè)明顯升高，提示在此條件下利用診斷超聲聯(lián)合微泡可顯著提高化療效果； MI取0.7和1.1時(shí)，治療側(cè)與對(duì)照側(cè)DOX藥物濃度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。既往研究[10-12]報(bào)道，微泡在血管內(nèi)發(fā)生瞬態(tài)空化所對(duì)應(yīng)的峰值負(fù)壓閾值為0.5～1.0 MPa，峰值負(fù)壓>2.0 MPa時(shí)，高強(qiáng)度的瞬態(tài)空化可使微血管壁發(fā)生機(jī)械毀損，導(dǎo)致腫瘤組織發(fā)生暫時(shí)性水腫，從而壓迫阻斷腫瘤血液循環(huán)，產(chǎn)生抑制腫瘤血流效應(yīng)，反而不能促進(jìn)腫瘤局部化療藥物釋放。本研究中MI為0.3時(shí)對(duì)應(yīng)實(shí)測(cè)峰值負(fù)壓為0.81～0.83 MPa，此時(shí)超聲能量已可使微泡在血管內(nèi)發(fā)生瞬態(tài)空化，且不會(huì)引發(fā)因峰值負(fù)壓高而產(chǎn)生的不良反應(yīng)；MI為0.7時(shí)對(duì)應(yīng)實(shí)測(cè)峰值負(fù)壓為0.96～1.32 MPa，同樣處于可激發(fā)瞬態(tài)空化的范圍內(nèi)，但在此條件下DOX藥物靶向釋放濃度較超聲輻照/假照前并無(wú)顯著提高，提示隨峰值負(fù)壓逐漸增高，瞬態(tài)空化所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)在空化效應(yīng)中所占比例逐漸升高，穩(wěn)態(tài)空化所占比例逐漸下降，腫瘤血流抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng)；MI為1.1時(shí)對(duì)應(yīng)的實(shí)測(cè)峰值負(fù)壓為2.29～2.53 MPa，符合以瞬態(tài)空化為主的腫瘤血管抑制效應(yīng)的發(fā)生條件。

腫瘤血管的異質(zhì)性可能是影響腫瘤血管局部藥物濃度的另一重要因素，主要體現(xiàn)在腫瘤血管結(jié)構(gòu)和相關(guān)血流動(dòng)力學(xué)方面[13-15]。腫瘤血管發(fā)育缺損時(shí)，較正常血管的組織結(jié)構(gòu)更為薄弱。MI為0.3時(shí)，超聲聯(lián)合微泡作用于腫瘤血管，脆弱的血管可能產(chǎn)生更顯著的聲孔效應(yīng)，從而提高腫瘤局部藥物濃度。腫瘤血管血流動(dòng)力學(xué)的異質(zhì)性體現(xiàn)在腫瘤周邊部位的血管與腫瘤中心的血管相比，血流量更大、流速更快，微泡濃度也更高，可產(chǎn)生更為顯著的空化效應(yīng)。隨著超聲能量升高，當(dāng)MI≥0.7時(shí)，腫瘤周邊部位血管內(nèi)微泡迅速空化，造成局部組織水腫，對(duì)管壁更薄的腫瘤中心血管產(chǎn)生擠壓，導(dǎo)致腫瘤中心血管內(nèi)微泡空化更為困難，局部藥物釋放受到抑制，而這樣的抑制作用可能是一過(guò)性或功能性的[16]。

本研究超聲造影定量分析顯示，治療側(cè)超聲輻照后PI及AUC均較輻照前明顯提升；對(duì)照側(cè)超聲假照后亦有一定提升，其中A、C組PI及A組AUC與超聲假照前比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因，可能是由于裸鼠體質(zhì)量過(guò)低，實(shí)驗(yàn)中微泡及生理鹽水推注量約0.6 ml，接近循環(huán)血量的60%(裸鼠循環(huán)血量約0.8～1.0 ml)，使得循環(huán)負(fù)荷顯著增加，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，MI=0.3的診斷超聲聯(lián)合微泡能促進(jìn)人胰腺癌荷瘤裸鼠腫瘤局部化療藥物釋放； MI≥0.7時(shí)無(wú)法有效提高腫瘤局部藥物濃度。本研究未對(duì)峰值負(fù)壓<0.5 MPa(對(duì)應(yīng)MI<0.2)的超聲聯(lián)合微泡進(jìn)行腫瘤局部化療藥物釋放分析，將在今后進(jìn)一步研究。