趙艷雪，閆朝麗

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059）

蛋白質(zhì)組學(xué)（proteome）現(xiàn)已得到大家廣泛認(rèn)可并應(yīng)用在動物血清、細(xì)胞及組織中，可鑒定出大量蛋白質(zhì)。該技術(shù)主要通過雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）及質(zhì)譜法（mass spectrometry,MS）的方法可發(fā)現(xiàn)大量差異蛋白具有共同的生理病理作用，可作為相關(guān)聯(lián)的一組蛋白群整體研究[1]。目前對糖尿病背后的基因、蛋白變化等具體發(fā)病機制仍未明確，自從有研究者[2]通過該技術(shù)定量并鑒定到糖尿病患者及對照組的組織、細(xì)胞或細(xì)胞器中存在差異蛋白的表達(dá)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)就越來越受到廣泛關(guān)注。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展過程

蛋白質(zhì)組學(xué)的研究對象是蛋白質(zhì)組，蛋白質(zhì)組的概念首次由wlkins和williamstochu提出，當(dāng)時定義為由一個基因組編碼的全部蛋白質(zhì)[3]。隨后有學(xué)者對此定義進(jìn)行了完善，即在細(xì)胞中由基因組表達(dá)的及表達(dá)后修飾的所有相關(guān)蛋白質(zhì)。隨著科學(xué)不斷發(fā)展，目前認(rèn)為蛋白質(zhì)組是一個包含生物體所能表達(dá)全部蛋白質(zhì)的領(lǐng)域，且存在時間和空間上動態(tài)變化。簡而言之，蛋白質(zhì)組學(xué)就是通過整體、動態(tài)、定量的方法對蛋白質(zhì)組成的研究，并由此進(jìn)一步獲得對疾病發(fā)生、發(fā)展等機制的具體過程。

目前血清蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究得到普遍應(yīng)用，首先在血清中尋找出差異蛋白質(zhì)位點，然后從差異蛋白中鑒定與疾病相關(guān)的血清蛋白質(zhì)，通過生物信息學(xué)處理后研究差異蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度來看，2型糖尿病是一種多種病理生理機制共同作用的疾病，會有多種異常蛋白的表達(dá)。因此通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分析2型糖尿病組織和血清的蛋白質(zhì)表達(dá)譜變化，為2型糖尿病的發(fā)病機制、早期診斷的相關(guān)特異性標(biāo)志物和藥物靶點治療等方面開辟新方法[4,5]。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)的主要方法學(xué)

2.1 雙向凝膠電泳（two dimensional electrophoresis,2-DE） 2-DE的技術(shù)路線最早由Smithies等[6]提出，后來O’Farrell等學(xué)者[7]對此做了進(jìn)一步的優(yōu)化，使雙向凝膠電泳分辨率得到了提高。雙向電泳的原理主要是以膠條和SDS聚丙烯酰胺凝膠為介質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)PH和蛋白質(zhì)分子量大小不同進(jìn)行電泳分離，分為稱為等電聚焦分離（IEF）和SDS聚丙烯酰胺凝膠，兩者分離方法后后會在SDS聚丙烯酰胺凝膠上留下位點，從而把復(fù)雜的蛋白混合物根據(jù)PH和分子量不同在二維平面上分布，最后用硝酸銀或考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色，得到蛋白質(zhì)表達(dá)譜。

2.2 質(zhì)譜技術(shù)（biological mass spectrometry,BMS） 質(zhì)譜技術(shù)基本原理是通過質(zhì)譜分析儀以離子源、質(zhì)量分析器和離子檢測器為核心檢測出離子的質(zhì)量與電荷比大小來分析鑒定未知的蛋白質(zhì)。傳統(tǒng)的質(zhì)譜技術(shù)僅可用于分析小分子物質(zhì)，但隨著離子技術(shù)經(jīng)過不斷升級改良，對于生物大分子物質(zhì)特別是蛋白質(zhì)類的分析也成為現(xiàn)實。目前改良的技術(shù)主要為基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI time-of-flight mass spectrometry,MALDITOF-MS）技術(shù)、表面增強激光解析電離（SELDI time-offlight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS）技術(shù)以及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandemmasss pectrometry,LC-MS-MS）等技術(shù)。這些技術(shù)的改良成為蛋白質(zhì)組學(xué)的支撐技術(shù)，最主要的是應(yīng)用更為廣泛、方便、精確且重復(fù)率得以保證[8]。（1）基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時問質(zhì)譜（MALDI time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）：MALDI-TOF-MS技術(shù)原理是將微量蛋白質(zhì)與過量的小分子的混合液體點到樣品靶上后先將樣品離子化，然后再使用基質(zhì)與激光直接照射離子化樣品與之結(jié)合成結(jié)晶薄膜，最后用高電壓使待測的樣品經(jīng)過電離過程后得到肽質(zhì)量指紋譜（PMF）的方法。最終質(zhì)譜分析所得肽質(zhì)量指紋譜與多肽蛋白數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)的理論肽段進(jìn)行比較，從而對所測蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。它具有準(zhǔn)確性好、靈敏度高、重復(fù)性及高通量性等特點[9]，在2型糖尿病發(fā)病機制方面有很多重要研究成果應(yīng)用涉及該技術(shù)，如有國內(nèi)學(xué)者[10]應(yīng)用MALDI-TOF-MS法檢測視黃醇結(jié)合蛋白4基因多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)RBP4基因多態(tài)性位rS17484721AA基因型攜帶者增加胰島素抵抗的風(fēng)險。（2）表面增強激光解析電離（SELDI-TOF-MS）：SELDI-TOFMS技術(shù)是一種軟電離生物質(zhì)譜，其原理為設(shè)置好離子裝置中的飛行時間后，使用脈沖氮激光能量直接照射在固相吸附蛋白質(zhì)芯片的表面，將獲取的樣品蛋白從芯片表面中電離出來，最后根據(jù)樣品蛋白電離飛行時間測量計算出樣品蛋白的電荷和質(zhì)量。利用這種技術(shù)可對待測樣品進(jìn)行直接檢測，具有高靈敏度、技術(shù)難度低、高通量性等特點，相關(guān)研究更證明此技術(shù)適用于臨床篩選新的疾病標(biāo)志物、早期診斷和預(yù)后評估提供了可能[11,12]。黃波等[13]利用此項技術(shù)結(jié)和生物信息學(xué)建立了敏感性和特異性均較高的T2DM腎病診斷模型，為糖尿病腎病的診斷作出了貢獻(xiàn)。（3）液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem masss pectrometry,LC-MS-MS）：該技術(shù)是一種具有高靈敏度、高準(zhǔn)確度以及分離范圍廣的快速分離方法，且能將的對未知化合物的結(jié)構(gòu)破環(huán)性小，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣品要求比較低。液相的色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的結(jié)合可將離子化水平發(fā)揮更為極致，能夠使通過色譜純化后的離子在電場和磁場的綜合作用下，按照質(zhì)量數(shù)和電荷數(shù)的比值大小依次成譜被記錄下來。從而可直接獲得待測樣品蛋白的相關(guān)結(jié)構(gòu)信息。然后利用混合編程掃描，進(jìn)一步獲的待測蛋白的相關(guān)信息。有學(xué)者用LC-MS-MS技術(shù)研究2型糖尿病患者血清氨基酸水平與胰島素抵抗時與臨床資料結(jié)合分析后得出血清氨基酸水平在糖尿病患者中具有顯著的差異，且相關(guān)氨基酸表達(dá)水平與糖脂代謝狀況密切相關(guān)[14]。

2.3 生物信息學(xué)（biological information） 生物信息學(xué)的主要內(nèi)容是對蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫檢索，數(shù)據(jù)庫通過連接數(shù)學(xué)、計算機以及統(tǒng)計學(xué)等學(xué)科衍生而來各種方法獲得生物大分子相關(guān)的信息[15]。具體包括為進(jìn)行蛋白注釋、差異表達(dá)蛋白的功能分類、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位及功能富集聚類分析等內(nèi)容。簡單來說，蛋白質(zhì)組學(xué)的生物信息學(xué)就是將質(zhì)譜后得到的譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理后將網(wǎng)上現(xiàn)有的生物基因蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，即可得到待測樣品差異蛋白的相關(guān)信息。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)在2型糖尿病中的研究進(jìn)展

2型糖尿病是一種在遺傳、環(huán)境等因素刺激下導(dǎo)致高糖毒性、胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂等多種危害機體慢性代謝性疾病。目前已成為人類健康殺手最主要的慢性疾病之一。但是糖尿病患病人數(shù)仍在全球范圍持續(xù)增長，據(jù)統(tǒng)計，2017年全球糖尿病的患病人數(shù)已高達(dá)4.25億，預(yù)計2015年將達(dá)到6.29億[16]。目前蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在新發(fā)2型糖尿病領(lǐng)域主要研究內(nèi)容為：①新發(fā)2型糖尿病標(biāo)記物的篩選鑒定及早期篩查；②探索2型糖尿病發(fā)病機制及與環(huán)境的發(fā)生發(fā)展關(guān)系；③尋找新的治療靶點、療效評估及預(yù)后判斷等研究，現(xiàn)就蛋白質(zhì)組學(xué)在新發(fā)2型糖尿病研究中的基礎(chǔ)及臨床做一敘述。

3.1 蛋白質(zhì)組學(xué)在2型糖尿病發(fā)病機制的研究 有學(xué)者[17]運用蛋白質(zhì)組學(xué)方法揭示了2型糖尿病發(fā)病的可能機制，具體為機體接受多種發(fā)病信號后蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)域和翻譯后修飾發(fā)生多態(tài)性改變引起。Ahmed團(tuán)隊[18]于2005年首次描繪出了人胰島素的蛋白質(zhì)圖譜，為糖尿病是胰島功能方面的研究提供了便利，圖譜共有700多個蛋白被檢測到，且具有很高的重復(fù)性。同時還發(fā)現(xiàn)與糖尿病的疾病發(fā)展有關(guān)的差異蛋白表達(dá)如熱休克蛋白、膜聯(lián)蛋白等差異蛋白。Rutter等學(xué)者[19]通過蛋白質(zhì)組學(xué)對健康和疾病中胰島素的差異的研究中發(fā)現(xiàn)在mRNA和蛋白水平中某些關(guān)鍵因子表達(dá)變化可能是導(dǎo)致胰島功能分泌缺陷的原因。研究表明胰腺癌也許會導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。Basso等[20]在胰腺癌相關(guān)糖尿病的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)了胰腺癌相關(guān)糖尿病的致病因子S-100鈣結(jié)合蛋白，并且此蛋白與腫瘤相關(guān)的蛋白具有同源性。

3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)與2型糖尿病并發(fā)癥的研究 目前關(guān)于蛋白質(zhì)組學(xué)在2糖尿病并發(fā)癥領(lǐng)域研究多為糖尿病腎病和視網(wǎng)膜病變的研究。研究已發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病的發(fā)病機制及早期標(biāo)記物取得一些成就，在一項用尿蛋白組學(xué)預(yù)測糖尿病腎病的實驗中通過比較正常人和高發(fā)人群的尿蛋白檢測出700多個尿蛋白峰后得出蛋白峰中存在很好的預(yù)見性，即可以較好的預(yù)見糖尿病腎病的發(fā)生趨勢，為糖尿病腎病患者早期診斷提供線索，優(yōu)于尿微量白蛋白2型對糖尿病早期腎病的診斷[21]。

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病微血管病變最常見的并發(fā)癥，是目前中老年人導(dǎo)致失明的主要原因。它的發(fā)病機制不僅只與體內(nèi)糖脂代謝相關(guān)，原因是許多血糖控制較好的患者仍可發(fā)生，且視網(wǎng)膜病變的病理變化與免疫、炎癥等反應(yīng)密切相關(guān)。有學(xué)者在雙向電泳在視網(wǎng)膜蛋白研究中，通過對比正常大鼠和糖尿病SD大鼠的視網(wǎng)膜組織差異蛋白表達(dá)情況得出兩者之間的確存在差異，觀察到糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織蛋白發(fā)生了改變，為差異蛋白的鑒定和功能分析提供重要基礎(chǔ)[22]。Takahashi等[23]應(yīng)用iTRAQ技術(shù)在研究小鼠2型糖尿病的相關(guān)血清蛋白中發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞滲透性的改變可能與人類的同系物SERPINA3有關(guān)，這可能是糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制。所以，上述這些差異蛋白的檢出及鑒定，可以為糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制的了解提供了很好的線索。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)作為研究2型糖尿病及其并發(fā)癥一種重要橋梁，它不僅提高了人們對此疾病從宏觀表型到微觀蛋白質(zhì)組更為深刻的認(rèn)識作用，還提供了新的方式使我們更加了解該病的發(fā)病機制是多種因素共同作用的結(jié)果，且遺傳、環(huán)境、免疫因素相互作用，十分復(fù)雜。但可以通過鑒定疾病相關(guān)的的分子標(biāo)志物，為早期診斷、尋找新的藥物靶點等方面提供新的途徑[24]。

4 蛋白質(zhì)組學(xué)研究存在的問題以及展望

雖然蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究對2型糖尿病分子水平上的研究具有推動作用，但該技術(shù)仍存一些技術(shù)局限性、血清蛋白未能有效提取、重復(fù)性不理想、研究耗時長、費用昂貴等諸多問題需要完善和解決。

首先排除高豐度蛋白質(zhì)對低豐度蛋白質(zhì)的掩飾是血清樣品預(yù)處理的關(guān)鍵所在。血清標(biāo)本的特殊性會對結(jié)果產(chǎn)生干擾，主要原因為血清中與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵的低豐度的蛋白可被存在的80%左右的高豐度蛋白質(zhì)（包括白蛋白、IgG等）產(chǎn)生干擾，妨礙有效差異蛋白的檢出。除此之外，雙向電泳中的凝膠由于自身存在局限性，所以很難將血清中濃度范圍較大蛋白全面地展示出來。其次該研究技術(shù)中的分離技術(shù)和圖譜鑒定的對于具有極酸性、極低拷貝的蛋白上的應(yīng)用存在困難。此外，建立一個可反映系統(tǒng)性變化中的蛋白質(zhì)系統(tǒng)很難實現(xiàn)，主要是由于蛋白組學(xué)技術(shù)本身重復(fù)性有限難以統(tǒng)一動態(tài)變化的蛋白差異結(jié)果所致。最后，在探索2型糖尿病發(fā)病機制及與環(huán)境的發(fā)生發(fā)展關(guān)系過程中，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)存在即使有相同的研究目的，但不同的研究人員結(jié)論也有可能偏差的問題，主要與待測樣品及研究技術(shù)不統(tǒng)一相關(guān)，如樣本獲取途徑、保存方式以及蛋白質(zhì)芯片不同，所以解決這些問題的關(guān)鍵就是要對研究技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的提高[25]。