,3

(1.北京市疾病預(yù)防控制中心，北京 100013；2.北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100013；3.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069)

1 引言

非食用色素的濫用已成為食品安全的主要隱患。我國原衛(wèi)生部自2008年以來陸續(xù)發(fā)布了5批食品中可能添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單[1]，堿性橙2和酸性橙II因?qū)倥嫉悏A性工業(yè)染料，均為中等毒性致癌化合物，已明確禁止在食品中使用[2]，但由于二者著色牢固且不易被水浸泡出，價廉，高溫下穩(wěn)定等特點，較少的添加量即可達(dá)到理想的著色效果，一些不法商販將其非法添加到辣椒粉、鹵制品及豆制品中，使其在賣相上更加吸引消費者，而且二者聯(lián)合添加，效果會更好，在辣椒粉中有被檢出的報道[3]，迫切需要建立這兩種物質(zhì)同時測定的分析方法，以確保食品安全。

目前針對兩種物質(zhì)的檢測方法最常用的有高效液相色譜法(HPLC)[4-7]、LC-MS[3, 8-16]、GC-MS[17，18]等。這些方法靈敏度高、選擇性好并能夠?qū)衔镞M(jìn)行確認(rèn)，但其冗長的樣品前處理：或固相萃取法，或濃縮富集，或低溫下冷凍2h，都將導(dǎo)致檢測時間的延長?，F(xiàn)有的國標(biāo)法[4]僅能檢測堿性橙2，且其加標(biāo)回收率低。

特別適合極性小分子物質(zhì)分析的毛細(xì)管電泳法(CE)具有高效、快速、簡便、耗樣量小、溶劑消耗少、柱效高等特點，已用于工業(yè)染料的分析[20-24]，但未見CE同時分離堿性橙2和酸性橙II的文獻(xiàn)報道。本研究的目的在于建立一種同時檢測辣椒粉和豆制品中非法添加的酸性橙Ⅱ和堿性橙2的反向MEKC方法，為食品衛(wèi)生安全提供技術(shù)支持。

2 實驗部分

2.1 儀器和試劑

Beckman PA 800 plus 型毛細(xì)管電泳儀，配PDA檢測器；Beckman P/ACE Station 工作站(貝克曼庫爾特有限公司，美國)；未涂層熔融石英毛細(xì)管(河北邯鄲鑫諾光纖色譜有限責(zé)任公司)；Vortex-Genie 2渦旋混合器(美國Scientific Industries)；11B S25 型研磨機(jī)(IKA，德國)；Milli-Elix/RiOs超純水儀(美國Millipore公司)；F-50A酸度計(北京屹源電子儀器科技公司)；Mettler Toledo電子天平(梅特勒-托利多，瑞士)；德國Hettich Universal 32離心機(jī)高速離心機(jī)。

十二烷基硫酸鈉(SDS，純度≥99%，Sigma-Aldrich，USA)；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，99%， Sigma-Aldrich，USA)；乙腈(色譜純, DIMA公司)；H3PO4(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；NaH2PO4(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；NaOH(優(yōu)級純，北京化學(xué)試劑公司)；冰乙酸(CH3COOH，純度≥99.8%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；實驗室用水為超純水。

標(biāo)準(zhǔn)品：酸性橙Ⅱ(Acid OrangeⅡ，純度≥98%，Sigma-Aldrich公司)。堿性橙2(Basic Orange2，純度≥98.2%，北京振翔工貿(mào)有限公司)。

實驗中的樣品購于北京郊區(qū)農(nóng)貿(mào)市場、當(dāng)?shù)爻泻驮缡小ｊ栃愿駱悠窞楸緦嶒炇易灾啤?/p>

2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

稱取折算純度后的酸性橙Ⅱ和堿性橙2標(biāo)準(zhǔn)品，分別放入10 mL容量瓶中，加入適量超純水溶解、稀釋后，再加入超純水至刻度，充分混勻，配制1.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置4℃冰箱冷藏保存。

2.3 電泳條件

未涂層石英毛細(xì)管：75 μm (70 cm(有效長度：60 cm)，樣品溫度：25°C；分離緩沖溶液：30 mmol/L NaH2PO4+ 30 mmol/L H3PO4+ 30 mmol/L SDS + 0.5 mmol/L CTAB；分離電壓：-17 kV；進(jìn)樣壓力及進(jìn)樣時間：0.5 psi，12 s；檢測波長：酸性橙Ⅱ和堿性橙2分別為490 nm和460 nm。分離緩沖溶液：30 mmol/L NaH2PO4+ 30 mmol/L H3PO4+ 30 mmol/L SDS + 0.5 mmol/L CTAB；樣品提取溶液：以60%乙腈與20%乙酸為樣品提取溶液，但進(jìn)樣時溶液需用超純水稀釋，即最后含有15%乙腈與5%乙酸。

為保證校正峰面積和遷移時間的重現(xiàn)性，新裝毛細(xì)管使用前在20 psi壓力下，分別用1 mol/L NaOH溶液沖洗20 min；超純水和分離緩沖液均沖洗5 min。每次進(jìn)樣前依次用1 mol/L NaOH溶液、超純水和分離緩沖液分別沖洗3 min、3 min、2 min，從而保證結(jié)果的重現(xiàn)性。

2.4 樣品處理

2.4.1 辣椒粉樣品

稱取辣椒樣品大約0.5 g于15 mL離心管中，分別加入1 mL冰乙酸、3 mL乙腈，加入超純水至5 mL刻度，渦旋混勻2 min，離心5 min，上清液需用超純水稀釋4倍，方可進(jìn)樣。

2.4.2 腐竹樣品

腐竹樣品為本實驗室自制，具體方法：將腐竹樣品用研磨機(jī)粉碎、加入適量堿性橙2標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混勻，冷凍干燥后備用。需要時稱取腐竹樣品約0.5 g于1.5 mL離心管中，依次加入200 μL冰乙酸、600 μL乙腈和超純水共計1 mL，渦旋混勻后，離心5 min，上清液需用超純水稀釋4倍，方可進(jìn)樣。

2.4.3 豆制品(豆泡、豆腐干、豆腐皮)

將豆制品用研磨機(jī)打碎，裝入50 mL離心管中，放入冰箱(-18℃)冷凍備用。需要時準(zhǔn)確稱取豆制品約0.5 g于1.5 mL離心管中，加入200 μL冰乙酸、600 μL乙腈和超純水共計1 mL，渦旋混勻后，離心10 min，上清液需用超純水稀釋4倍，方可進(jìn)樣。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測波長的選擇

文獻(xiàn)報道的酸性橙Ⅱ和堿性橙2的檢測波長一般分別在450 nm～490 nm和430 nm～490 nm。本研究將酸性橙Ⅱ和堿性橙2的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液分別用樣品提取液稀釋成100 mg/L，在190～600 nm內(nèi)進(jìn)行紫外-可見吸收光譜掃描，酸性橙Ⅱ和堿性橙2分別在490 nm和460 nm處有明顯吸收，如圖1a和圖1b所示。利用二極管陣列檢測器可實現(xiàn)兩種組分在其最大吸收波長處被檢測。

圖1 在線掃描的酸性橙Ⅱ和堿性橙2的紫外-可見吸收光譜圖

3.2 分離緩沖體系的選擇

有研究選擇pH 2.5的磷酸和磷酸二氫鉀為分離緩沖體系[24]，但在本研究初期，采用磷酸和磷酸二氫鈉作為分離緩沖溶液時，20 min內(nèi)并未見待測物峰。其原因為：酸性橙Ⅱ?qū)倥嫉惢撬崛玖蠋ж?fù)電，堿性橙2為偶氮類染料，其pKa=3.1，在pH 2.5時被質(zhì)子化而帶正電。故帶負(fù)電的酸性橙Ⅱ因與電滲流(EOF)的方向相反而無法遷移到負(fù)極端被檢測，而帶正電的堿性橙2因pH 2.5時EOF低，導(dǎo)致其遷移到檢測窗口的時間比較長，在可接受的20 min未能出峰。

受本實驗室以前研究[25]的啟發(fā)，往磷酸和磷酸二氫鈉緩沖液中同時加入SDS和CTAB后，電滲流(EOF)反向，結(jié)果在短時間內(nèi)檢測到待測物的峰；可能的原因是：加入陰離子表面活性劑SDS后，形成膠束，將帶負(fù)電的酸性橙II和帶正電的堿性橙2包裹在膠束中，使待測物表面帶負(fù)電荷，當(dāng)加入EOF改性劑CTAB后，EOF反向，使待測物與EOF的方向一致，遷移到檢測窗口被檢測。0.5 mmol/L CTAB足以使EOF反向，且穩(wěn)定性好[26]，故選擇0.5 mmol/L CTAB。故本研究選用H3PO4-NaH2PO4體系作為分離緩沖溶液。

3.3 分離緩沖溶液濃度的選擇

本研究雖然只分析酸性橙Ⅱ和堿性橙2，但針對的樣品一般為基質(zhì)復(fù)雜的辣椒粉和豆制品，故本研究選用同時含有酸性橙Ⅱ和堿性橙2的辣椒粉樣品進(jìn)行分離條件的優(yōu)化。一般情況下，分離緩沖溶液中緩沖鹽的濃度高低影響著EOF的大小，鹽濃度越高，EOF越低，遷移時間就會延長，分離度增加，而鹽濃度過高會產(chǎn)生大量的焦耳熱，使峰形變寬。分別考察了20、30和40 mmol/L NaH2PO4溶液對酸性橙Ⅱ和堿性橙2的遷移時間和分離度的影響，如圖2所示，隨著NaH2PO4濃度的增高，遷移時間不斷延長，但分離效率增加，堿性橙2的靈敏度在40 mmol/L NaH2PO4時最高，但酸性橙Ⅱ的反而降低。綜合考慮兩者的分離度和靈敏度，30 mmol/L NaH2PO4為最佳選擇。

圖2 分離緩沖溶液中NaH2PO4濃度對辣椒粉樣品中兩種待測物質(zhì)分離的影響NaH2PO4濃度(mmol/L)a. 20；b. 30；c. 40；其它電泳條件見2.3;出峰順序：1.堿性橙2；2. 酸性橙Ⅱ

3.4 分離緩沖溶液pH的優(yōu)化

分離緩沖溶液的pH在磷酸鹽的緩沖范圍(pH 2.12±1)時，緩沖體系有較好的緩沖容量，才能保證良好的定性及定量重現(xiàn)性。本研究中，保持30 mmol/L NaH2PO4、30 mmol/L SDS和0.5 mmol/L CTAB不變的前提下，分別考察了pH值為2.3、2.25和2.2對分離的影響，相對應(yīng)的H3PO4濃度分別為20、30和40 mmol/L。隨著H3PO4濃度的增加，遷移時間逐漸延長，兩者分離度和靈敏度得到明顯改善，但是，堿性橙2與基質(zhì)的分離并未隨著H3PO4濃度的增加而顯著增加，但分離時間顯著延長，如圖3所示。故在保證分離度的前提下，最終確定pH為2.25，相應(yīng)磷酸濃度為30 mmol/L。

圖3 分離緩沖溶液pH對辣椒粉樣品中兩種待測物質(zhì)分離的影響pH a. 2.3；b. 2.25；c. 2.2；其它電泳條件見2.3;出峰順序：1.堿性橙2；2. 酸性橙Ⅱ

3.5 分離緩沖溶液中十二烷基硫酸鈉濃度的優(yōu)化

分離緩沖溶液中適當(dāng)加入陰離子表面活性劑SDS，不僅可以改善分離，還有增溶增敏的作用[27]。保持30 mmol/L NaH2PO4、30 mmol/L H3PO4和0.5 mmol/L CTAB不變，對SDS濃度分別為20、30和40 mmol/L進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，SDS濃度分別為20和40 mmol/L時，堿性橙2與樣品基質(zhì)不能分離，且酸性橙Ⅱ的靈敏度明顯低于30 mmol/L SDS，基于分離度和靈敏度的考慮，最終選擇30 mmol/L SDS為最佳，如圖4所示。

圖4 分離緩沖溶液中SDS濃度對辣椒粉樣品中堿性橙2和酸性橙Ⅱ分離的影響SDS濃度(mmol/L)a. 20；b. 30；c. 40；其它電泳條件見2.4;出峰順序：1. 堿性橙2；2. 酸性橙Ⅱ

3.6 樣品提取溶液的選擇

染料的著色能力強，導(dǎo)致樣品前處理方法在染料的準(zhǔn)確測定中起著非常關(guān)鍵的作用。根據(jù)文獻(xiàn)[7]中的樣品前處理方法，選用水-乙腈-乙酸為提取液，在本試驗過程中發(fā)現(xiàn)，隨著乙腈和乙酸含量的同比例增高，乙腈層的顏色越深，提取得更徹底，經(jīng)試驗，選擇含60%乙腈和20%乙酸為提取液可有效提取堿性橙2，然而含有如此高含量有機(jī)溶劑的樣品溶液直接進(jìn)樣，易造成儀器報錯，斷電等情況而導(dǎo)致儀器運行停止，將此提取液用超純水稀釋4倍后進(jìn)樣，即進(jìn)樣時樣品提取液含15%乙腈和5%乙酸，既能取得較高靈敏度和分離度，也能保證實驗過程中不斷電而使實驗順利進(jìn)行。

3.7 分離電壓的選擇

分離電壓直接影響著分析時間的長短，設(shè)置的電壓越高，待測物遷移就越快，分離時間越短；但電壓過高將產(chǎn)生大量焦耳熱而導(dǎo)致峰展寬，靈敏度下降；而分離電壓將使遷移時間增加，降低分析效率。經(jīng)優(yōu)化，-17 kV為最佳分離電壓。

3.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、精密度及加標(biāo)回收率

3.8.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限及定量限

將1 g/L堿性橙2、酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)儲備液用15%乙腈-5%冰乙酸依次稀釋成質(zhì)量濃度分別為1、2、4、8、16、32 mg/L以及2、4、8、16、32、64 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在上述MEKC條件下，由低到高質(zhì)量濃度依次進(jìn)樣檢測，用校正峰面積(峰面積除以遷移時間)外標(biāo)法定量，以電泳峰的校正峰面積(A)為縱坐標(biāo)，與其對應(yīng)的質(zhì)量濃度(ρ, mg/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性范圍、r、檢出限(LOD)及定量限(LOQ)見表1。

表1 線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

3.8.2 儀器精密度

堿性橙2和酸性橙Ⅱ的儀器精密度測定分別在2、4、8 mg/L和4、8、16 mg/L3個質(zhì)量濃度水平進(jìn)行，每個質(zhì)量濃度平行進(jìn)樣7次，計算遷移時間及校正峰面積的RSD%，結(jié)果見表2。

表2 儀器精密度(n=7)

3.8.3 方法精密度

方法日內(nèi)精密度：按2.4中的處理方法，將辣椒粉樣品，在一日內(nèi)平行處理7份，在最優(yōu)MEKC條件下進(jìn)行測定，計算含量的RSD%，堿性橙2和酸性橙II的結(jié)果分別為4.7%和3.2%。

方法日間精密度：按2.4中的處理方法，在7個連續(xù)的工作日內(nèi)，每日平行處理3份辣椒粉樣品，得到當(dāng)天質(zhì)量濃度平均值，最后計算7天含量平均值的RSD%，結(jié)果分別為4.0%和4.5%。

3.8.4 加標(biāo)回收率

選用陰性辣椒粉樣品作為加標(biāo)回收實驗的本底，堿性橙2和酸性橙Ⅱ分別在2、4、8 mg/L以及4、8、16 mg/L3個質(zhì)量濃度水平下進(jìn)行加標(biāo)回收實驗的測定，3個質(zhì)量濃度的樣品平行處理5份，加入標(biāo)準(zhǔn)后室溫放置過夜，使加標(biāo)溶液與樣品基質(zhì)充分混合，第二天再行提取。所得低質(zhì)量濃度加標(biāo)電泳圖如圖5所示，加標(biāo)回收率及RSD%列于表3。與文獻(xiàn)[7]相比，本方法的回收率高，說明本方法對樣品的提取更徹底。而HPLC法受色譜柱的限制，不能用太強的酸或堿進(jìn)行提取，故回收率較本法低。

表3 加標(biāo)回收結(jié)果(n=5)

-：未檢出

圖5 辣椒粉樣品低質(zhì)量濃度加標(biāo)回收電泳圖a. 樣品本底；b. 2 mg/L堿性橙2和4 mg/L酸性橙Ⅱ混標(biāo)；c. 本底加標(biāo)二混標(biāo)；1. 堿性橙2；2. 酸性橙Ⅱ；其余電泳條件見2.3

3.8.5 樣品分析

辣椒粉樣品從北京農(nóng)貿(mào)市場及超市購買，豆制品購買于早市，共計18件，分別編號后，依照文中2.4的方法進(jìn)行樣品前處理，每個平行處理5份進(jìn)行測定，陽性樣品含量及RSD%見表4，部分樣品電泳圖見圖6、圖7和圖8。

圖6 1#辣椒粉樣品電泳圖1. 堿性橙2；2. 酸性橙Ⅱ；其它電泳條件見2.3

圖7 2#辣椒粉樣品電泳圖1. 堿性橙2；其它電泳條件見2.3

圖8 9#腐竹樣品電泳圖1. 堿性橙2；其它電泳條件見2.3

樣品堿性橙2(mg/kg)RSD(%)酸性橙Ⅱ(mg/kg)RSD(%)1#50.564.760.083.22#158.310.3--3#172.812.6--4#59.874.2--5#79.065.3--6#45.394.4--7#143.152.0--8#77.145.0--9#27.675.1--

-：未檢出

4 結(jié)論

建立了辣椒粉和豆制品中堿性橙2和酸性橙Ⅱ的反向MEKC分析新方法。選擇含60%乙腈和20%乙酸水體系作為樣品提取液有利于沉淀豆制品中蛋白；對于辣椒粉樣品也有很好的提取作用，能夠提高檢測靈敏度，方法簡單，省時省力，易于操作。加標(biāo)回收率在91.5%～109.9%之間，解決了國標(biāo)方法對堿性橙2回收率低的問題。方法的精密度均在6%以下，滿足定性及定量分析要求。而HPLC法受色譜柱的限制，不能用太強的酸如本法中的提取液進(jìn)行提取，導(dǎo)致HPLC法[7]的回收率較本法低，充分證明了本法優(yōu)勢，可避免因提取不完全而導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。