徐 卓，秦旭華，王 濤,，李浩田，高思佳,，王 丹,，孟祥博，張 璐，趙艷玲#

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137； 2.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心藥學(xué)部，北京 100039； 3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053)

冠心病(coronary heart disease，CHD)是臨床常見的心血管疾病，是由于冠狀動(dòng)脈供血和供氧不足，導(dǎo)致心肌急劇、短暫性地缺血與缺氧而引起的發(fā)作性心臟疾病[1]；如不及時(shí)治療，極易發(fā)展為心肌梗死，危及生命。近年來，全球范圍內(nèi)CHD的發(fā)病率和患病率呈逐年升高趨勢，嚴(yán)重威脅著人類健康[2]。高血壓病、糖尿病患者或有吸煙、不運(yùn)動(dòng)等不良生活習(xí)慣的人群，患有CHD的概率明顯高于其他人群[3-6]。長期以來，丹參一直被應(yīng)用于多種心血管微循環(huán)障礙性疾病的治療，其含有的水溶性丹酚酸類成分作用于血管和心肌，具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗氧化及保護(hù)心肌等效應(yīng)，其脂溶性丹參酮等成分還具有抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[7-8]。但以往對(duì)丹參的研究主要集中在其單個(gè)成分的生物活性或者其在處方中發(fā)揮的功效，而丹參作為一種多組分協(xié)同系統(tǒng)，可以對(duì)疾病的整體調(diào)節(jié)起到治療作用，采用傳統(tǒng)方法研究其多組分的藥理作用機(jī)制有很多局限性[9]。因此，基于系統(tǒng)藥理學(xué)的整合策略框架，尋找丹參治療CHD的基因、通路、生物過程和已知藥物靶點(diǎn)可以揭示其新的研究方向。同時(shí)，以往對(duì)丹參及其化合物的研究主要集中在防治器官微循環(huán)障礙和靶器官損傷，在CHD方面的作用機(jī)制研究較少，現(xiàn)有的機(jī)制依舊不明晰[10]。因此，本研究旨在通過系統(tǒng)藥理學(xué)的方法，預(yù)測和分析丹參中主要效應(yīng)化合物對(duì)CHD的作用機(jī)制，以期為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究和臨床用藥提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的建立及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過檢索中草藥綜合數(shù)據(jù)庫(traditional Chinese medicine database @Taiwan，TDT)(http：//tcm.cmu.edu.tw/)、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，獲得丹參所含的115種活性成分，再通過中草藥活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(herbal ingredients’ targets database，HIT)(http：//lifecenter.sgst.cn/hit/)和治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD)(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)篩選與CHD相關(guān)靶點(diǎn)，建立丹參靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。通過人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM)(http：//www.omim.org/)篩選CHD相關(guān)基因和蛋白靶點(diǎn)，建立CHD靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集，其中靶點(diǎn)連接蛋白通過交互蛋白數(shù)據(jù)庫(database of interacting protein，DIP)(http：//dip.doe-mbi.ucle.edu)獲得。本研究所使用的藥物體內(nèi)過程[吸收(absorption)、分布(distribution)、代謝(metabolism)及排泄(excretion)，ADME]模型主要是口服生物利用度(OB)。OB是口服藥物最重要的藥動(dòng)學(xué)特性之一，其體現(xiàn)了口服藥物后，藥物進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)的效率。采用計(jì)算機(jī)篩選模型(OBioavail 1.1)計(jì)算丹參活性成分的OB，OB≥30%的化合物被認(rèn)為是進(jìn)一步研究的活性成分。為便于統(tǒng)一分析，以上所有靶點(diǎn)均轉(zhuǎn)化為UniProt數(shù)據(jù)庫識(shí)別碼格式。將丹參的化學(xué)成分、成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)、疾病對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)和交互蛋白對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)整合，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)表示活性成分、靶點(diǎn)或作用通路。

1.2 京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集及生物基因本體(gene ontology，GO)分析

為更合理地闡明丹參中活性成分與CHD之間的關(guān)系，對(duì)其體內(nèi)療效機(jī)制進(jìn)行通路富集分析。利用Cytoscape 3.5.1軟件將以上網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，并對(duì)每個(gè)節(jié)點(diǎn)的中介中心性、點(diǎn)度中心性和接近中心性等3個(gè)拓?fù)鋮?shù)通過CentiScape 1.2軟件進(jìn)行評(píng)估，選擇點(diǎn)度中心性≥2倍中位數(shù)的靶點(diǎn)，作為丹參治療CHD的目標(biāo)靶點(diǎn)。通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(http：//www.genome.jp/kegg/)分析，將丹參的化學(xué)成分、成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)、疾病對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)和交互蛋白對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)整合篩選，進(jìn)行KEGG通路富集分析。此外，為使通路更為清晰地展現(xiàn)，進(jìn)一步使用生物GO分析進(jìn)行“靶點(diǎn)-生物功效”關(guān)聯(lián)分析，對(duì)丹參治療CHD的具體生物功效進(jìn)行整合分析。丹參對(duì)應(yīng)的靶蛋白直接映射到通路上，藥物靶點(diǎn)富集的通路被認(rèn)為是藥物調(diào)控的通路。

2 結(jié)果

2.1 “成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

基于數(shù)據(jù)庫構(gòu)建方法，對(duì)丹參治療CHD的療效機(jī)制進(jìn)行“成分-靶點(diǎn)-疾病”系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)丹參對(duì)CHD的療效基于其有效成分對(duì)多靶點(diǎn)的系統(tǒng)調(diào)控，見圖1。發(fā)現(xiàn)了12個(gè)疾病與藥物共同直接作用蛋白，見表1；并以此為重點(diǎn)關(guān)注的潛在靶標(biāo)。此外，為更為清楚展現(xiàn)其系統(tǒng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，進(jìn)一步以上述12個(gè)潛在靶標(biāo)進(jìn)行次級(jí)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，共發(fā)現(xiàn)32個(gè)與療效直接相關(guān)的活性成分以及47個(gè)潛在交互作用蛋白，見圖2。通過系統(tǒng)藥理學(xué)構(gòu)建丹參治療CHD作用的交互網(wǎng)絡(luò)，采用不同形狀使其可視化后，可清晰直觀地看出藥物化學(xué)成分與疾病靶點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。其中，三角形為藥物化學(xué)成分，圓形為藥物與疾病的作用蛋白靶標(biāo)，方形為藥物化學(xué)成分和疾病共同直接作用的蛋白靶標(biāo)。

圖1 丹參治療CHD的“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)Fig 1 The “ingredients-target-disease” interactive network of salvia miltiorrhiza in treatment of coronary heart disease

表1 丹參治療CHD的“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)中直接作用靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)分析Tab 1 Topological parameters analysis of direct targets in the “ingredients -target-disease” interactive network of salvia miltiorrhiza in treatment of coronary heart disease

圖2 丹參治療CHD的“成分-靶點(diǎn)-疾病”直接作用次級(jí)交互網(wǎng)絡(luò)Fig 2 The “ingredients-target-disease” secondary interactive network of salvia miltiorrhiza in treatment of coronary heart disease

2.2 KEGG通路富集分析

對(duì)二級(jí)網(wǎng)絡(luò)圖中的全部潛在靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，以中介中心性、點(diǎn)度中心性和接近中心性等3個(gè)主要拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行相關(guān)度分析，并求出拓?fù)鋮?shù)中位值分別為0、1和0.260 346 35。以拓?fù)鋮?shù)中位值為條件，進(jìn)行潛在靶點(diǎn)篩選，最終得到相關(guān)度最高可能的潛在靶點(diǎn)29個(gè)，見表2。采用Array Track v.3.5.0軟件進(jìn)行通路富集分析，根據(jù)CHD的特性，挑取出14條相關(guān)信號(hào)通路，見表3。

2.3 丹參潛在靶點(diǎn)GO分析

為更進(jìn)一步闡明丹參抗CHD作用的療效機(jī)制，采取生物GO分析對(duì)上述通路具體調(diào)控的生物過程進(jìn)行深入分析。結(jié)果顯示，上述14條通路共參與了62種生物體內(nèi)調(diào)節(jié)過程，見圖3。對(duì)上述生物過程進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并按照相關(guān)度排列，發(fā)現(xiàn)丹參主要通過調(diào)控5種生物過程進(jìn)而發(fā)揮對(duì)CHD的治療作用，分別為調(diào)節(jié)活性氧代謝過程、正調(diào)控平滑肌細(xì)胞增殖、雄激素受體信號(hào)通路、由p53類介導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)以及積極調(diào)節(jié)活性氧代謝過程，見圖4。此外，通過構(gòu)建“靶點(diǎn)-生物功效”網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步深入揭示了潛在作用靶標(biāo)與具體生物過程調(diào)控之間的關(guān)系，見圖5?？梢郧逦乜吹?，胰島素、微囊蛋白1、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素10、C反應(yīng)蛋白和3-羥基-3-甲基戊二?；o酶A還原酶重組蛋白可以同時(shí)調(diào)控活性氧代謝和平滑肌細(xì)胞增殖過程。

表2 丹參治療CHD通路蛋白靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)分析Tab 2 Pathway analysis of protein target of salvia miltiorrhiza in treatment of coronary heart disease

表3 丹參治療CHD的14條體內(nèi)通路Tab 3 The 14 internal pathways of salvia miltiorrhiza in treatment of coronary heart disease

3 討論

丹參的通路富集分析結(jié)果顯示，丹參多組分所作用的靶點(diǎn)主要富集于磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信號(hào)通路、叉頭轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路等，這些信通路可能是未來研究丹參治療CHD的關(guān)鍵通路。丹參的GO富集分析結(jié)果顯示，丹參多成分所作用的靶點(diǎn)主要富集于多個(gè)與CHD有關(guān)的生物過程，主要包括調(diào)節(jié)活性氧代謝過程、正調(diào)控平滑肌細(xì)胞增殖、雄激素受體信號(hào)通路、由p53類介導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)以及積極調(diào)節(jié)活性氧代謝過程等5個(gè)方面。目前，關(guān)于丹參成分的研究已部分揭示了丹參多組分治療CHD的功效。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信號(hào)通路進(jìn)而顯著改善大鼠心肌缺血再灌注損傷，顯著改善其氧化應(yīng)激損傷，抑制心肌細(xì)胞凋亡[11]。近年來，叉頭轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路在心血管疾病調(diào)控中的作用逐步成為研究熱點(diǎn)，其在緩解心臟老化，心肌保護(hù)等方面具有重要作用[12-13]。關(guān)月等[14]的研究結(jié)果表明，丹參素能夠通過調(diào)節(jié)叉頭轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路參與心臟保護(hù)作用。心臟長期處于缺血缺氧狀態(tài)，可促進(jìn)心血管新生，進(jìn)而引起心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)，而近年來有研究指出，丹參水煎液可激活絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路上調(diào)自噬抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌重構(gòu)[15]。上述結(jié)果與本研究結(jié)果相符。此外，本研究的GO分析所得出的較為相關(guān)的5種參與CHD的生物途徑更為詳細(xì)地揭示了丹參對(duì)于治療CHD的療效機(jī)制。有研究指出，CHD模型大鼠存在嚴(yán)重的心肌細(xì)胞凋亡、活性氧高表達(dá)以及心肌線粒體DNA損傷[16-17]。丹參通過參與上述生物過程的調(diào)控或許正是其發(fā)揮療效的作用基礎(chǔ)。

圖3 生物調(diào)節(jié)過程分析Fig 3 Analysis of biological regulation process

圖4 生物調(diào)節(jié)過程相關(guān)度分析Fig 4 Correlation analysis of biological regulation process

圖5 “潛在靶點(diǎn)-生物過程”網(wǎng)絡(luò)Fig 5 “Potential target-biological process” network

系統(tǒng)藥理學(xué)是從系統(tǒng)水平研究藥物與機(jī)體相互作用及其規(guī)律和作用機(jī)制的一門學(xué)科[18]，即從分子、網(wǎng)絡(luò)及細(xì)胞到組織、器官等不同水平上研究藥物治療疾病時(shí)引起機(jī)體功能變化的機(jī)制，建立藥物對(duì)于機(jī)體的作用從微觀到宏觀的各水平之間相互關(guān)聯(lián)的學(xué)問。其目的是為了從整體了解系統(tǒng)的行為，而不是了解個(gè)體行為。傳統(tǒng)中藥是多組分、多靶點(diǎn)及其組分間具有協(xié)同作用的復(fù)雜體系。因此，傳統(tǒng)藥理學(xué)方法難以對(duì)其深入研究，而系統(tǒng)藥理學(xué)則為龐大的中藥系統(tǒng)研究提供了新視角和思路。采用系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)，研究中藥活性成分及組合、識(shí)別藥效成分靶點(diǎn)及其與疾病關(guān)系的理論和方法，從而建立系統(tǒng)水平的中藥研究理論。

本研究通過系統(tǒng)藥理學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)了丹參有效成分，探究其潛在作用靶點(diǎn)，并通過KEGG通路注釋和GO富集分析獲取丹參治療CHD的信號(hào)通路及生物過程，體現(xiàn)了其作用機(jī)制。不僅為丹參治療CHD的研究提供了基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)其進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究、臨床合理用藥以及其他傳統(tǒng)中藥機(jī)制的研究提供了新的范式。