陳 興，張 璐，吳詩華，王 濤，高思佳，王 丹，趙艷玲

(1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川 成都 611137； 2.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心藥學部，北京 100039； 3.浙江中醫(yī)藥大學藥學院，浙江 杭州310053)

目前，心血管疾病已成為全球第1位致死、致殘的疾病原因，危害甚至超過惡性腫瘤；其中，缺血性心臟病是臨床上心血管疾病中較為常見的病理現(xiàn)象，其發(fā)病率更呈逐年升高趨勢[1-2]。因此，保護缺血心肌一直是心血管領(lǐng)域的研究重點，國內(nèi)外眾多專家學者都在致力于探索預(yù)防和治療此類心血管疾病的有效手段。人參為五加科人參屬植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，人參“主補五臟，安精神，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智”[3]。人參作為最著名的中草藥之一，貴為中草藥中的“百草之王”，在我國已被廣泛應(yīng)用了幾千年，是我國重要的中藥寶藏。關(guān)于人參的研究和應(yīng)用一直受到國內(nèi)外的普遍重視，隨著科技不斷進步和發(fā)展，對人參化學成分及藥理作用的研究已取得了重大進展。現(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，人參在心血管疾病方面具有明確的療效，能夠改善心肌缺血、調(diào)控心律失常、抑制血管細胞凋亡和舒張血管等[4-9]。然而，大多數(shù)關(guān)于人參改善心肌缺血的作用機制研究都是基于離體細胞或動物模型，其對人體的作用機制尚不明確[10-13]。因此，探索人參改善人體心肌缺血的作用機制具有重要的意義。

中藥多成分、多靶點的特點導致中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不清晰，作用基礎(chǔ)不明確，甚至很難從整體到組織、器官、細胞和分子水平進行全面系統(tǒng)的中藥研究，使得中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展一再遇到困阻。因此，闡明中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機制是排除中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展障礙亟待解決的重大問題[14]。網(wǎng)絡(luò)藥理學在此契機下應(yīng)運而生，其概念由英國藥理學家Hopkins率先提出，是一種基于系統(tǒng)生物學、多向藥理學、計算生物學及網(wǎng)絡(luò)分析等多學科技術(shù)和內(nèi)容的研究手段，運用各種組學、高通量篩選、網(wǎng)絡(luò)可視化和網(wǎng)絡(luò)分析等多種技術(shù)，建立“藥物成分-基因-靶點-通路-疾病”之間的多層次網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，從多維度視角考察中藥對多種信號通路的調(diào)節(jié)作用，系統(tǒng)揭示中藥核心分子靶點和藥效學生物網(wǎng)絡(luò)，并理解疾病的分子基礎(chǔ)，預(yù)測藥物的藥理學作用機制，評估藥物的有效性、作用途徑及不良反應(yīng)，從而發(fā)現(xiàn)高效低毒的藥物，提高臨床藥物的治療效果[15]。因此，本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學為研究方法，旨在對人參改善心肌缺血的作用機制進行探討，以期為人參治療心血管疾病的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的建立

首先在中草藥綜合數(shù)據(jù)庫(traditional Chinese medicine database @Taiwan，TDT)(http：//tcm.cmu.edu.tw/)中獲得人參所含有的活性成分結(jié)構(gòu)，再經(jīng)中草藥活性成分數(shù)據(jù)庫(herbal ingredients’ targets database，HIT)(http：//lifecenter.sgst.cn/hit/)及治療靶點數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD)(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)篩選人參活性成分的作用靶點，建立人參性成分靶點數(shù)據(jù)集。通過人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM)(http：//www.omim.org/)篩選出心肌缺血相關(guān)基因和蛋白靶點，建立心肌缺血靶點數(shù)據(jù)集。通過交互蛋白數(shù)據(jù)庫(database of interacting protein，DIP)(http：//dip.doe-mbi.ucla.edu)獲得靶點連接蛋白。以上所有靶點均轉(zhuǎn)化成UniProt數(shù)據(jù)庫識別碼格式，以便于統(tǒng)一的研究分析。

1.2 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為更合理地闡明人參中活性成分與心肌缺血靶點之間的關(guān)系，對其進行網(wǎng)絡(luò)藥理學分析，通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(http：//www.genome.jp/kegg/)分析，將人參的化學成分、成分對應(yīng)的靶點、心肌缺血對應(yīng)的靶點和交互蛋白對應(yīng)的靶點進行整合，構(gòu)建“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 2.8.3軟件將以上網(wǎng)絡(luò)分析圖進行可視化，并通過CentiScape 1.2軟件對每節(jié)點的中介中心性、點度中心性和接近中心性等3個拓撲參數(shù)進行分析評估，選擇點度中心性2倍中位數(shù)的靶點，作為人參改善心肌缺血的目標蛋白靶點。

1.3 基因本體(gene ontology，GO)富集分析

為了說明中藥化合物的靶點蛋白在基因功能中的作用，利用Cytoscape 2.8.3軟件對蛋白靶點進行GO富集分析，分別從功能、參與的生物途徑及細胞中的定位對基因產(chǎn)物進行標準化描述，并繪制GO分析條目圖。

1.4 京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

為了說明中藥化合物的靶點蛋白在信號通路中的作用，利用ArrayTrack v.3.5.0軟件，將“1.2”項下所得直接作用靶點的UniProt數(shù)據(jù)庫識別碼導入其中，進行KEGG通路富集分析，得出交互網(wǎng)絡(luò)中直接作用靶點分布的相關(guān)通路。

2 結(jié)果

2.1 “成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

基于數(shù)據(jù)庫構(gòu)建方法，共篩選出人參活性成分59個、交互蛋白40個及藥物與疾病共同直接作用的蛋白靶點15個，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學構(gòu)建出人參改善心肌缺血作用的交互網(wǎng)絡(luò)圖，采用不同形狀圖形使其可視化后，可清晰直觀地看出藥物化學成分與疾病靶點之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，見圖1。其中，三角形為藥物化學活性成分，圓形為交互作用蛋白，正方形為藥物化學成分和疾病共同直接作用的蛋白靶標。為了更具特異性地反應(yīng)出“成分-蛋白-疾病”的之間關(guān)系，再以圖1中的共同直接作用蛋白靶點為中心，進一步構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)交互圖，見圖2。

2.2 人參活性成分及心肌缺血共同直接作用靶點及其拓撲參數(shù)

“成分-靶點-疾病“交互網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，藥物與疾病共同直接作用的蛋白靶點有15個，其可能是人參改善心肌缺血作用的最相關(guān)蛋白靶點，因此，對該15個蛋白靶標進行拓撲參數(shù)進行計算，結(jié)果見表1。

圖1 人參改善心肌缺血作用的“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)Fig 1 Interactive network of “compound-target-disease” of ginseng in treatment of myocardial ischemia

圖2 人參改善心肌缺血作用的“成分-直接作用靶點”交互網(wǎng)絡(luò)Fig 2 Interactive network of “compound-direct targets” of ginseng in treatment of myocardial ischemia

表1 人參改善心肌缺血作用的“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)中直接作用靶點的拓撲參數(shù)分析Tab 1 Topological parameter analysis of direct targets of interactive network of “compound-target-disease” of ginseng in treatment of myocardial ischemia

2.3 GO分析

對相關(guān)蛋白靶點在基因功能中的作用進行研究，共得到GO分析條目24個，見圖3。根據(jù)人參改善心肌缺血作用預(yù)測靶點的GO分析結(jié)果，可知相關(guān)蛋白涉及的基因功能包括“negative regulation of caleium iontransport”(鈣離子運輸?shù)呢撜{(diào)節(jié))、“negative regulation of extrinsic apoptotic signaling pathway”(外源性凋亡信號通路的負調(diào)控)、“active regulation of active oxygen metabolism”(活性氧代謝調(diào)節(jié))和“nitric oxide biosynthetic process”(一氧化氮生物合成過程)等方面。

2.4 KEGG通路分析

對網(wǎng)絡(luò)中所有點的拓撲參數(shù)分析結(jié)果顯示，所有相關(guān)蛋白靶標的3個拓撲參數(shù)點度中心性、中介中心性和接近中心性的中位數(shù)分別為1、0和0.248 394 73。KEGG通路富集分析共富集出43條通路與人參改善心肌缺血的功效相關(guān)，主要包括甲狀腺激素信號通路、鞘脂信號通路、FcεRI信號通路、血管內(nèi)皮生長因子信號通路和腫瘤壞死因子信號通路等，見表2。

3 討論

心肌缺血是指心臟的血液灌注減少，進而導致心臟的供氧不足，心肌能量代謝不正常，難以支持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)。導致心肌缺血因素有很多，除個人飲食、生活習慣、心理、社會和環(huán)境等多種外界因素外，冠狀動脈阻塞，血壓降低、主動脈供血減少，血液黏稠度變化和心肌本身病變等內(nèi)在因素為導致心肌缺血的直接因素；其中，冠狀動脈粥樣硬化導致的冠狀動脈狹窄或閉塞又為引起心肌缺血最主要、最常見的病因[16-18]。近年來，眾多學者對人參在心血管疾病方面的作用進行了大量而深入的研究，發(fā)現(xiàn)人參在改善心肌缺血時，可以顯著提高氧自由基水平[8]；明顯增加冠狀動脈血流量和心輸出量，增加左心室內(nèi)壓最大上升速率，降低左心室舒張末壓、冠狀動脈阻力和總外周阻力[9]；改善血流動力學、調(diào)節(jié)血管功能，刺激血管再生，抑制缺血心肌細胞凋亡[11，19]；還能保護心血管系統(tǒng)，封閉鈣離子運動通道，并刺激人體內(nèi)皮細胞，使其釋放更多的一氧化氮，進一步促進血管舒張[4，20-21]。

圖3 人參改善心肌缺血作用的GO分析Fig 3 GO analysis of ginseng in treatment of myocardial ischemia

序號通路計數(shù)百分比/%P1甲狀腺激素信號通路1025.03.20×10-92鞘脂信號通路922.51.00×10-73雌激素信號通路820.04.80×10-74局部粘著1025.05.60×10-75催乳素信號通路717.51.20×10-66神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路820.01.80×10-67磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B信號通路1127.55.10×10-68細胞凋亡615.01.30×10-59wnt信號通路717.55.70×10-510ErbB信號通路615.06.80×10-511血管內(nèi)皮生長因子信號通路512.52.30×10-412p53信號通路512.53.40×10-413細胞周期615.03.60×10-414轉(zhuǎn)錄因子信號通路615.05.20×10-415促性腺激素信號通路512.51.10×10-316催產(chǎn)素信號通路615.01.10×10-317絲裂原活化蛋白激酶信號通路717.51.60×10-318T細胞受體信號通路512.51.70×10-319胰島素抵抗512.52.00×10-320FcεRI信號通路410.04.80×10-321泛素介導的蛋白水解512.54.80×10-322B細胞受體信號通路410.05.00×10-323Jak-STAT信號傳送途徑512.55.90×10-324孕酮介導的卵母細胞成熟410.09.40×10-325蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的加工512.51.00×10-226低氧誘導因子-1信號通路410.01.30×10-227趨化因子信號通路512.51.40×10-228Toll樣受體信號通路410.01.60×10-229腫瘤壞死因子信號通路410.01.60×10-230環(huán)磷酸腺苷信號傳導途徑512.51.70×10-231多巴胺能突觸410.02.60×10-232血小板活化410.02.70×10-233破骨細胞分化410.02.80×10-234核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體信號通路37.53.10×10-235胰島素信號通路410.03.20×10-236胞吞作用512.54.00×10-237長時程增強作用37.54.40×10-238脂肪細胞因子信號通路37.54.90×10-239環(huán)磷酸鳥苷-蛋白激酶G信號通路410.05.10×10-240瞬時受體電位通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)37.58.80×10-241Rap1信號通路410.08.90×10-242胰高糖素信號通路37.58.90×10-243黑素原生成37.59.10×10-2

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，篩選出人參中59個活性、成分40個交互蛋白及15個藥物與疾病共同直接作用的蛋白靶點，構(gòu)建了“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)圖，并對靶點進行GO富集分析和KEGG通路注釋分析，明確了相關(guān)蛋白靶點的功能類別及參與改善心肌缺血作用的信號通路。GO功能富集分析結(jié)果證實，人參改善心血管疾病的基因功能主要體現(xiàn)在鈣離子運輸?shù)呢撜{(diào)節(jié)、外源性凋亡信號通路的負調(diào)控、活性氧代謝調(diào)節(jié)和一氧化氮生物合成等過程。在基因的KEGG通路富集中，共篩選得到43條信號通路，其中，與內(nèi)分泌調(diào)節(jié)相關(guān)的信號通路有甲狀腺激素信號通路、絲裂原活化蛋白激酶通路，磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B信號通路，孕酮介導的卵母細胞成熟，促性腺激素信號通路等；與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的信號通路有FcεRI信號通路、T細胞受體信號通路等；與信號轉(zhuǎn)導相關(guān)的信號通路有血管內(nèi)皮生長因子信號通路、轉(zhuǎn)錄因子信號通路等；與抑癌相關(guān)的信號通路有p53信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等。因此，推測人參中的活性成分可能通過作用于上述信號通路中的關(guān)鍵因子達到改善心肌缺血的目的。

網(wǎng)絡(luò)藥理學為中醫(yī)藥研究的一種新方法，研究思路遵循中醫(yī)藥的整體觀，從整體的角度去探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，明確中藥是一種多成分的協(xié)同作用體系，通過作用于不同的蛋白靶標，調(diào)控機體的多種生物功能及信號通路，進而發(fā)揮整體的治療機制。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，探討了人參改善心肌缺血的作用機制，明確了中藥治療疾病具有多成分、多靶點、多通路和整合調(diào)節(jié)作用等特點，同時揭示了人參改善心肌缺血的多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為人參用于改善心肌缺血的藥物研究提供了依據(jù)，為中醫(yī)藥的研究和發(fā)展提供了新的思路和方法。