黃宇哲，桂雙英, 2, 儲(chǔ)曉琴, 2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，安徽 合肥 230012)

索拉非尼是一種新型小分子多靶點(diǎn)、多激酶抑制劑[1]，可直接阻斷RAF/MEK/ERK介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[2-3]，對(duì)肝癌、肺癌、非小細(xì)胞癌等多種實(shí)體瘤療效確切[4-5]，尤其可顯著延長(zhǎng)晚期肝癌患者總生存期。索拉非尼難溶于水，臨床將其制成甲苯磺酸鹽口服給藥，但仍存在生物利用度低、臨床劑量大、不良反應(yīng)多等缺點(diǎn)，因而開發(fā)索拉非尼新劑型，提高靶向性、降低不良反應(yīng)成為目前研究者面臨的共同挑戰(zhàn)[6]。

聚合物納米粒(polymer nanoparticles, PNP)作為一種新型藥物載體，具有增加藥物溶解度，延緩藥物釋放時(shí)間，提高藥物穩(wěn)定性和靶向性等優(yōu)勢(shì)[7]。PNP經(jīng)靜脈注射入血后能夠?qū)驳乃幬餄饧诟?、脾等部位，同時(shí)降低藥物在其他組織中的分布。納米粒(nanoparticles, NPs)的靶向性通常受粒徑的大小和表面電荷分布影響，因此控制這兩種因素能夠使NPs在給藥部位起到更好的靶向作用。選擇合適的載體材料是制備NPs的重要因素之一，常用的PNP材料有聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]、聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚氰基丙烯酸烷酯(polyalkylcya-nocraylate，PACA)等。研究報(bào)道，GAO等[8]、LIN等[9]應(yīng)用PLGA為載體材料制備索拉非尼聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)-PLGA NPs(PEG-PLGA NPs)聚合物，與游離藥物相比，負(fù)載PEG-PLGA NPs半衰期增加9倍，藥時(shí)曲線面積增加24倍，顯著延長(zhǎng)索拉非尼在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，增強(qiáng)索拉非尼抗腫瘤效果。維生素E-聚乙二醇1000琥珀酸酯(D-ɑ-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate, TPGS)是由維生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate, VES)中羧基與聚乙二醇1000(polyethylene glycol 1000, PEG1000)中羥基酯化形成的維生素E水溶性衍生物[10]，可通過抑制p-gp的外排，改善膜的滲透性，增加藥物的蓄積，提高藥物療效。WIN等[11]制備出TPGS乳化的負(fù)載紫杉醇PLGA NPs，其在大鼠體內(nèi)48 h藥時(shí)曲線下面積是紫杉醇溶液劑的4.9倍，且NPs在體內(nèi)的作用時(shí)間明顯延長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)在確定PLGA為內(nèi)核的基礎(chǔ)上，采用TPGS作為乳化劑進(jìn)行包裹，采用超聲乳化-溶劑揮發(fā)法以期制備出新型索拉非尼PLGA-TPGS NPs聚合物[12]。通過Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化處方，以期能夠制備出提高索拉非尼水溶性、粒徑合適、包載量高以及體外釋放理想的NPs，并對(duì)所制備出的NPs進(jìn)行表征，為后期索拉非尼PLGA-TPGS NPs的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。制備出的NPs與臨床現(xiàn)有片劑甲苯磺酸鹽相比，期望能夠提高生物利用度，降低給藥劑量，減少不良反應(yīng)，并且可通過控制粒徑和表面電荷等因素主動(dòng)靶向至腫瘤部位。

1 儀器與材料

LC-20ADXR高效液相色譜儀：日本島津儀器有限公司；Zetasizer 3000HS激光粒度儀：英國(guó)Malvern公司；JEOL-2010高分辨透射電子顯微鏡：日本電子；92-IIN細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技有限公司；ZD-88B恒溫?fù)u床：江蘇省太倉(cāng)市博萊特實(shí)驗(yàn)儀器廠；UV757CRT紫外可見光分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；Centrifuge 5430R臺(tái)式超速離心機(jī)：美國(guó)Eppendorf公司；AB135-S電子天平：瑞士Mettler Toledo公司；85-2恒溫磁力攪拌器：江蘇省常州普天儀器制造有限公司；KQ-100DA數(shù)控超聲波清洗器：江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；XW-80A渦旋混合器：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；Milli-Q一體式超純水機(jī)：美國(guó)Milipore公司。

PLGA(50∶50，分子量30 000)：濟(jì)南岱罡生物工程有限公司；TPGS(批號(hào)Y21A8D41711)、索拉非尼(批號(hào) 284461-73-0，純度>99%)：上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 聚合物NPs的制備 按照文獻(xiàn)[12]方法制備聚合物NPs。精密稱取一定量索拉非尼，以1 mL DMSO溶解作為內(nèi)水相；精密稱取一定量PLGA，以5 mL丙酮渦旋溶解作為有機(jī)相；將內(nèi)水相與有機(jī)相混合，冰浴中超聲破碎形成初乳(W/O)；將初乳使用注射器逐滴加入一定濃度乳化劑TPGS的溶液中，形成復(fù)乳(W/O/W)，冰浴下磁力攪拌一定時(shí)間，揮發(fā)有機(jī)試劑；低溫超速離心(12 000 r/min, 20 min, 4 ℃)，用去離子水洗滌3次，制得索拉非尼PLGA-TPGS NPs。

2.2 含量測(cè)定方法

2.2.1 樣品溶液配制

(1)供試品溶液配制 精密吸取索拉非尼納米混懸液2 mL，置10 mL量瓶中，乙腈超聲破乳，并用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，即得。

(2)陰性樣品溶液配制 精密吸取空白納米混懸液2 mL，置10 mL量瓶中，乙腈超聲破乳，并用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，即得。

(3)對(duì)照品溶液配制 精密稱取索拉非尼對(duì)照品10.0 mg，置50 mL量瓶中，乙腈超聲破乳，并用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 取索拉非尼對(duì)照品溶液適量，于200～400 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果在266 nm處有最大吸收峰，而輔料在此無吸收，因此選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為266 nm。

2.2.3 色譜及檢測(cè)條件 按照文獻(xiàn)[13]的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(63∶37，0.03%三乙胺)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：266 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.4 專屬性考察 分別精密移取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。該色譜條件下，索拉非尼峰形較好，保留時(shí)間為10.7 min，溶劑和輔料無干擾。

圖1對(duì)照品(A)、陰性樣品溶液(B)和樣品溶液(C)的高效液相色譜圖(1.索拉非尼)

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取對(duì)照品溶液，分別配制成濃度為5、50、100、250、300、400 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次進(jìn)樣20 μL，以質(zhì)量濃度(c)對(duì)峰面積(A)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=2.141 1c+0.289 3(r=0.999 9)。結(jié)果表明，在5～400 μg/mL濃度范圍內(nèi)，索拉非尼的質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取質(zhì)量濃度為5、250、400 μg/mL的對(duì)照品溶液，于1 d內(nèi)0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣6次，計(jì)算日內(nèi)精密度；每日進(jìn)樣1次，連續(xù)進(jìn)樣6 d，計(jì)算日間精密度。低、中、高濃度日間和日內(nèi)精密度(RSD)均小于2%。

2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份索拉非尼供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算RSD，結(jié)果RSD=1.53%(n=5)，表明索拉非尼樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批索拉非尼納米混懸液5份，依法制備索拉非尼供試品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果RSD<2%(n=5)，表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.9 回收率實(shí)驗(yàn) 取0.5 mL空白NPs混懸液9份，分別置10 mL量瓶中，分別加入低、中、高濃度的對(duì)照品溶液5 mL、乙腈5 mL，超聲破乳，并加入流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，依法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果平均回收率為98.60%，RSD=1.38%(n=9)。見表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.3 索拉非尼載藥量和包封率測(cè)定 采用低溫超速離心法測(cè)定NPs的包封率。取索拉非尼納米混懸液，過膜，進(jìn)樣20 μL，測(cè)得總含量(W總)；離心(12 000 r/min, 20 min, 4 ℃)，得上清液，精密移取上清液20 μL，依法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算未包封的索拉非尼量(W1)。另取索拉非尼納米混懸液，用流動(dòng)相定容，測(cè)定索拉非尼的含量，計(jì)算NPs中索拉非尼的總量(W2)。計(jì)算公式如下：

載藥率=(W2-W1)/W總×100%；
包封率=(W2-W1)/W2×100%。

2.4 索拉非尼PLGA-TPGS NPs的處方優(yōu)化

2.4.1 Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)方案 參考文獻(xiàn)[14-15]的方法，并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以索拉非尼與PLGA的質(zhì)量比(x1)、有機(jī)相與水相的容積比(x2)、乳化劑TPGS的濃度(x3)為考察指標(biāo)，以包封率(y1)和載藥量(y2)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按表2設(shè)計(jì)因素水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平表

2.4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型擬合 采用Hassan公式將包封率和載藥量進(jìn)行“歸一化”處理，計(jì)算其幾何均數(shù)歸一值(overall desirability，OD)。OD=(d1×d2×…×dn)1/n，n為指標(biāo)數(shù)；di=(yi-ymin)/(ymax-ymin)，yi為實(shí)測(cè)值，ymin和ymax為某一指標(biāo)在不同試驗(yàn)中的最小值和最大值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用Design-expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果分別進(jìn)行多元非線性回歸和二次多項(xiàng)式方程擬合，得索拉非尼與PLGA的質(zhì)量比(x1)、有機(jī)相與水相的容積比(x2)、乳化劑TPGS的濃度(x3)與OD值之間的二次多項(xiàng)回歸方程：OD= 0.77+0.17x1-0.040x2-0.057x3-0.014x1x2-0.19x1x3-0.22x2x3-0.17x12-0.19x22-0.22x32。對(duì)OD值進(jìn)行方差分析，得出方程決定系數(shù)R2=0.947 3，表明該回歸模型的擬合情況良好。響應(yīng)面擬合的二次模型方差分析結(jié)果(見表4)提示該模型的預(yù)測(cè)價(jià)值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且失擬值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明該模型能較好地?cái)M合并對(duì)響應(yīng)值準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)。此外，一項(xiàng)式中x1對(duì)模型的預(yù)測(cè)價(jià)值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，x1x3和x2x3的交互作用對(duì)模型的預(yù)測(cè)價(jià)值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。二項(xiàng)式中x12、x22、x32對(duì)模型的預(yù)測(cè)價(jià)值均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化處方 根據(jù)二次多項(xiàng)式擬合方程，應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件模擬出實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的三維響應(yīng)面圖和等高線圖，見圖2、圖3、圖4。圖2顯示乳化劑TPGS濃度為0.05%，索拉非尼與PLGA質(zhì)量比的最優(yōu)區(qū)域是1∶10～1∶12，有機(jī)相和水相容積比的最優(yōu)區(qū)域?yàn)?∶4～1∶6。圖3顯示有機(jī)相、水相比為5倍的條件下，索拉非尼與PLGA質(zhì)量比的最優(yōu)區(qū)域是1∶10～1∶12，乳化劑TPGS濃度的最優(yōu)區(qū)域是0.03%～0.07%。圖4顯示PLGA是藥物質(zhì)量10倍的條件下，有機(jī)相和水相容積比的最優(yōu)區(qū)域?yàn)?∶4～1∶6，乳化劑TPGS濃度的最優(yōu)區(qū)域是0.03%～0.07%。根據(jù)上述所選最優(yōu)區(qū)域，結(jié)合二次回歸方程，求解得到最佳制備工藝條件：索拉非尼與PLGA的質(zhì)量比(x1)為1∶11.56；有機(jī)相與水相的容積比(x2)為1∶5.56；乳化劑TPGS的濃度(x3)為0.03%。

2.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)最佳處方條件，制備3批樣品，測(cè)定其包封率和載藥率。結(jié)果包封率的預(yù)測(cè)值為90.35%，實(shí)測(cè)值為89.78%±1.54%，RSD=0.63%(n=5)；載藥率的預(yù)測(cè)值為9.65%，實(shí)測(cè)值為9.41%±0.35%，RSD=2.49%。各項(xiàng)指標(biāo)實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間偏差均小于5%，說明最佳處方條件可靠，預(yù)測(cè)性較好。

表4 OD值響應(yīng)面二次回歸模型方差分析結(jié)果

圖2 索拉非尼與PLGA的質(zhì)量比(x1)和有機(jī)相與水相容積比(x2)對(duì)OD值影響的等高線圖(A)與響應(yīng)面圖(B)

圖3索拉非尼與PLGA的質(zhì)量比(x1)和乳化劑TPGS濃度(x3)對(duì)OD值影響的等高線圖(A)與響應(yīng)面圖(B)

2.5 體外釋藥性能研究

2.5.1 釋放介質(zhì)的配制 參照《中華人民共和國(guó)藥典》(2015版)方法，分別配制不同pH值的磷酸鹽緩沖液。①pH 5.0磷酸鹽緩沖液：取0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液一定量，用氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH值至5.0，即得。②pH 7.4磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀1.36 g，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液79 mL，用水稀釋至200 mL，即得。

2.5.2 藥物釋放測(cè)定 采用透析法考察索拉非尼PLGA-TPGS NPs在磷酸緩沖鹽溶液[pH 5.0(腫瘤偏酸性環(huán)境)和pH 7.4(中性環(huán)境)]中的釋放行為。將5 mL NPs或索拉非尼溶液裝入預(yù)處理好的透析袋中，平行3份，除去袋內(nèi)的氣泡，兩端系好，放入含100 mL的磷酸鹽緩沖液中，釋放液中加入1%吐溫-80保證藥物在漏槽條件下釋放，于恒溫?fù)u床上震蕩(37 ℃，120 r/min)分別在1、2、3、4、8、12、24、48、72、96、120 h時(shí)間點(diǎn)取樣2 mL，每次均補(bǔ)充新鮮的釋放介質(zhì)2 mL，將樣液過膜(0.22 μm)取濾液20 μL進(jìn)樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。由結(jié)果可知，索拉非尼PLGA-TPGS NPs和索拉非尼原料藥的釋放行為存在較大的差異。其中索拉非尼原料快速釋放，24 h處釋放度達(dá)92.82%±4.06%，120 h內(nèi)完全釋藥。索拉非尼PLGA-TPGS NPs在pH 5.0和pH 7.4的磷酸鹽緩沖液模擬腫瘤環(huán)境和血液環(huán)境，釋放表現(xiàn)為二相特征，可看出前20 h出現(xiàn)突釋效應(yīng)，其原因?yàn)樯杏幸徊糠炙骼悄嵊坞x于NPs外或附著于NPs表面，在溶出介質(zhì)中釋放速度快。隨后，表現(xiàn)為緩慢釋放，在120 h，索拉非尼PLGA-TPGS NPs在腫瘤微環(huán)境和血液環(huán)境中的累計(jì)釋放量分別為80.69%±4.70%和40.67%±3.77%，這表明NPs能夠在腫瘤部位更多地釋放出藥物，而在血液中藥物釋放量少。

圖4有機(jī)相、水相容積比(x2)和乳化劑TPGS濃度(x3)對(duì)OD值影響的等高線圖(A)與響應(yīng)面圖(B)

圖5 索拉非尼PLGA-TPGS NPs和索拉非尼溶液體外累積釋放曲線

2.6 NPs表征 采用激光粒度儀表征納米混懸液的粒徑結(jié)果。其粒徑為249.2 nm，多分散指數(shù)(polydispersity，PDI)為0.082，Zeta電位為-29 mV。結(jié)果表明所制備的NPs具有良好的分散性和穩(wěn)定性。見圖6。

2.7 NPs形態(tài)觀察 取少量NPs混懸液，滴至有400目碳膜的銅網(wǎng)上，靜置2 min后，再滴加2%的磷鎢酸負(fù)染片刻，吸去多余的負(fù)染液，晾干后通過透射電鏡觀察NPs的形態(tài)，見圖7。索拉非尼PLGA-TPGS NPs為球形，結(jié)構(gòu)完整。

圖6 索拉非尼PLGA-TPGS粒徑分布圖(A)及電位圖(B)

圖7透射電鏡下索拉非尼PLGA-TPGS NPs形態(tài)(A、B分別放大3 000、5 000倍)

3 討論

索拉非尼為難溶性藥物[16]，實(shí)驗(yàn)中通過溶劑、非溶劑法使索拉非尼在水性介質(zhì)中形成NPs，在制備過程中加入聚合物材料和乳化劑，對(duì)減小NPs的粒徑及提高穩(wěn)定性有重要作用。本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是有機(jī)溶劑的選擇，需要選擇一種既能溶解藥物，又能溶解載體的溶劑。在實(shí)驗(yàn)初期，曾選用甲醇、乙醇、乙酸乙酯作為有機(jī)溶劑，但所制備的NPs粒徑大小、分散系數(shù)及穩(wěn)定性都不理想。最終確定采用二甲基亞砜-丙酮(1∶5)為有機(jī)溶劑，通過調(diào)節(jié)pH至酸性，達(dá)到提高藥物溶解性的目的。在乳化劑的選擇上，實(shí)驗(yàn)最初使用聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)對(duì)聚合物NPs進(jìn)行包裹，制得的樣品粒徑和包封率低，最終通過篩選采用0.03% TPGS作為乳化劑增加藥物的包封率，所制備出的NPs各項(xiàng)理化指標(biāo)較優(yōu)，粒徑均在240 nm左右，PDI值均小于0.2。

藥物制劑工藝復(fù)雜，影響因素眾多，且各因素之間存在交互作用[17]。Box-Behnken響應(yīng)面法采用非線性數(shù)學(xué)模型對(duì)多個(gè)影響因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于藥學(xué)制劑處方優(yōu)化和篩選[18]。與均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)比較，響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、精度高、預(yù)測(cè)性好[19]。本實(shí)驗(yàn)通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化制備索拉非尼PLGA-TPGS NPs，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，考察了制備工藝中各因素對(duì)NPs的包封率、載藥量、Zeta電位、NPs粒徑等指標(biāo)的影響，相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)各因素對(duì)NPs粒徑分布和Zeta電位的影響不顯著。載藥量是決定藥物進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮作用的重要指標(biāo)，包封率是體現(xiàn)藥物與納米材料的相容性[20]，綜合考慮最終選定包封率和載藥量為本實(shí)驗(yàn)考察指標(biāo)，響應(yīng)面法優(yōu)化得到索拉非尼PLGA-TPGS NPs最優(yōu)工藝的包封率為89.78%，載藥量為9.41%，與已研究的索拉非尼新劑型[21]相比，在載藥量相當(dāng)?shù)那闆r下，包封率顯著提高，這為后續(xù)進(jìn)一步開展索拉非尼PLGA-TPGS NPs體內(nèi)研究奠定良好的制備工藝基礎(chǔ)。藥物的釋放行為表明，在酸性環(huán)境下，藥物釋放更快，這是由于外層的聚合物材料更容易解離，而在血液環(huán)境中，納米藥物釋放量少，后期通過靜脈注射入血后NPs可攜帶藥物至靶點(diǎn)，并在腫瘤微酸性環(huán)境中完全釋放。