顏虹 陸勤康 王惠云

結(jié)晶樣視網(wǎng)膜變性（Bietti’s crystalline dystrophy，BCD）是一組以常染色體隱性遺傳為主要遺傳方式的視網(wǎng)膜退行性疾病，其臨床特征為視網(wǎng)膜后極部結(jié)晶樣物質(zhì)沉積，伴進(jìn)行性視力下降及視野縮小[1]。雖然大多數(shù)患者在20歲左右時(shí)即可根據(jù)典型的視網(wǎng)膜結(jié)晶樣物質(zhì)沉積進(jìn)行臨床診斷，但多數(shù)情況下，早期患者往往因?yàn)橐暪δ軗p害輕微而未予及時(shí)就診，從而延誤診斷，單一的臨床診斷存在明顯的滯后性。自2004年Li等[2]發(fā)現(xiàn)了CYP4V2基因的13個(gè)突變位點(diǎn)，證實(shí)CYP4V2基因?yàn)锽CD的致病基因以來，CYP4V2基因的突變位點(diǎn)不斷涌現(xiàn)[3-6]，至今發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)已高達(dá)82個(gè)[5]。因此，針對(duì)患者個(gè)體的精準(zhǔn)化定位變得極為重要，對(duì)臨床表現(xiàn)為BCD癥狀的患者進(jìn)行相關(guān)突變篩查，有利于加強(qiáng)BCD的診斷，并提供遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育。本研究對(duì)3個(gè)BCD家系進(jìn)行CYP4V2基因的突變篩查，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2017年6月至2018年2月就診于寧波市鄞州人民醫(yī)院眼科門診并確診為BCD的患者3例（即先證者）。從先證者出發(fā)，尋找并收集家系中其他成員納入研究。共搜集BCD家系3個(gè)，患者及其家系成員合計(jì) 20例，其中男 9例，女 11例；年齡 3～73（35.8±19.2）歲。先證者均為男性。同時(shí)招募150名無血緣關(guān)系的健康志愿者作為健康對(duì)照組進(jìn)行CYP4V2基因測(cè)序比對(duì)，其中男 89 人，女 61 人；年齡 22～62（38.8±11.7）歲。本研究遵守赫爾辛基宣言，經(jīng)寧波市鄞州人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2017KY616），參與本研究的個(gè)體均簽署知情同意書。

1.2 臨床檢查 對(duì)3個(gè)BCD家系的家系成員進(jìn)行詳細(xì)的病史、家族史詢問及全面的眼科檢查并記錄。臨床檢查包括裸眼視力（5m視力表購(gòu)于上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）、最佳矯正視力（BCVA）（日本拓普康DK-600綜合驗(yàn)光儀）、裂隙燈下眼前節(jié)及眼底檢查（重慶康華瑞明科技股份有限公司SLM-5E）、眼底照相（北京高視遠(yuǎn)望科技有限責(zé)任公司KOWA-nonmyda-DⅢ）、眼部光學(xué)相干斷層成像技術(shù)（OCT）檢查（德國(guó)海德堡Spectralis OCT+Multicolor）、視野檢查（德國(guó)蔡司 HUMPHTRY 750i）、電生理檢查（法國(guó) METROVISION MonPack3）及眼底熒光造影檢查（德國(guó)海德堡Spectralis HRA）。

1.3 外周血DNA的提取與擴(kuò)增 采集所有家系成員及健康對(duì)照組外周血 5ml，EasyPure Blood Genomic DNA Ki（t北京全式金生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：50rxns，批號(hào)：Lot#M10420）提取基因組DNA。通過PCR擴(kuò)增目標(biāo) DNA 序列，50.0μl反應(yīng)體系中，DNA 模板 1.0μl，上、下游引物各1.0μ（l10μM），2×EasyTaqCR SuperMix 25.0μl，超純水 22.0μl。94℃預(yù)變性 5min，94℃變性 30s，50～65℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。CYP4V2基因11個(gè)外顯子的上、下游引物見表1。操作步驟及流程嚴(yán)格按照寧波市鄞州人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心生化實(shí)驗(yàn)室要求進(jìn)行。

表1 CYP4V2基因11個(gè)外顯子的上、下游引物[7]

1.4 基因檢測(cè) 對(duì)經(jīng)過PCR擴(kuò)增的目標(biāo)DNA序列產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，測(cè)序由上海桑尼生物科技有限公司完成，測(cè)序結(jié)果與Genbank、千人基因組計(jì)劃中的野生型CYP4V2基因參考序列（GenBank：KR710969.1）進(jìn)行對(duì)比分析，同時(shí)與150名健康志愿者的基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，確定突變位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 BCD患者的臨床特征 3例先證者均為散發(fā)患者，家系圖見圖 1。家系 1（F1）及家系 3（F3）中的先證者（F1:Ⅱ:1和F3:Ⅱ:1）首發(fā)癥狀均為夜盲，分別發(fā)生在25和 34 歲，家系 2（F2）中的先證者（F2:Ⅱ:1）主訴“雙眼視力下降10余年”。3例先證者BCVA差異較大，從0.2～1.0不等；眼前節(jié)均未見明顯異常，眼底見不同程度的結(jié)晶樣物質(zhì)沉積，伴或不伴視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）層萎縮及色素沉著；視野檢查可見不同程度的視野缺損；3例先證者的臨床表現(xiàn)見表2。先證者F1:Ⅱ:1的雙眼眼底照相示：后極部大量散在黃白色結(jié)晶樣物質(zhì)沉積（圖2，見插頁(yè)）；眼部OCT示：雙眼神經(jīng)上皮外叢狀層信號(hào)紊亂，色/脈反射帶反射信號(hào)薄，黃斑區(qū)及高反光物質(zhì)堆積（圖3）；雙眼視覺誘發(fā)電位示：雙眼b波波峰未見明顯延遲，但波峰下降；視網(wǎng)膜電圖（ERG）示：暗視下b波波幅下降（左眼較重），明視下未見明顯異常；雙眼眼底熒光造影示：全視網(wǎng)膜見透見與遮蔽熒光相間，后級(jí)部中央低熒光，周邊透見熒光（圖4）。先證者F2:Ⅱ:1眼部OCT示：雙眼黃斑區(qū)囊樣水腫，雙眼ERG示：暗視下b波振幅下降，OPS震蕩電位輕度下降，明視下b波振幅輕度下降?；颊咭蚓驮\時(shí)血壓高（180/110mmHg），而未行眼底熒光造影。先證者F3:Ⅱ:1因自身原因未完成全部眼科檢查。其余家系成員未見發(fā)病。

圖1 BCD患者家系圖（黑箭為先證者）

表2 3例先證者臨床表現(xiàn)

圖3 先證者F1:Ⅱ:1雙眼OCT圖所見，箭頭表示黃斑區(qū)及高反光物質(zhì)堆積

2.2 基因檢測(cè)結(jié)果 先證者F1:Ⅱ:1和F2:Ⅱ:1檢測(cè)出c.802-8_810dell7insGC（Exon7del）突變，而 F1 和 F2 其他家系成員均未發(fā)現(xiàn)該突變。先證者F3:Ⅱ:1檢測(cè)出c.219T＞A（p.F73L）突變，F(xiàn)3其他家系成員中未見此突變。3個(gè)家系的所有成員均存在c.775C＞A（p.Q259K）突變。在健康對(duì)照組中進(jìn)行驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)150名健康志愿者均不存在 c.802-8_810dell7insGC（Exon7del）和 c.219T＞A（p.F73L）突變，但有32名健康志愿者存在c.775C＞A（p.Q259K）突變?；驕y(cè)序結(jié)果見表3和圖5-7。

圖4 先證者F1:Ⅱ:1雙眼眼底熒光造影圖像（a：右眼早期熒光造影圖像；b：右眼晚期熒光造影圖像；c：左眼早期熒光造影圖像；d：左眼晚期熒光造影圖像）

表3 3例先證者基因測(cè)序結(jié)果

圖5 第7外顯子DNA測(cè)序圖（a：先證者F1:Ⅱ:1及先證者F2:Ⅱ:1 的 c.802-8_810dell7insGC 突變；b：除 F1:Ⅱ:1、F2:Ⅱ:1 外其余個(gè)體的基因測(cè)序結(jié)果）

圖6 第2外顯子DNA測(cè)序圖[a：先證者F3:Ⅱ:1的c.219T＞A（p.F73L）突變（黑箭）；b：除F3:Ⅱ:1外其余個(gè)體的基因測(cè)序結(jié)果，相應(yīng)位點(diǎn)不存在突變]

圖7 第6外顯子DNA測(cè)序圖 （[a：3例先證者及其家系成員和32名健康志愿者基因測(cè)序圖，其上存在c.775C＞A（p.Q259K）突變（黑箭）；b：健康對(duì)照組中剩余健康志愿者基因測(cè)序圖，其上未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)突變]

3 討論

早在2000年時(shí)，就有研究發(fā)現(xiàn)BCD的發(fā)病與細(xì)胞色素氧化酶 P450（CYP450）相關(guān)[8]，隨后，人們找到了BCD的致病基因——CYP4V2基因[2]。該基因編碼蛋白CYP4V2，屬于CYP450超家族。CYP450主要參與內(nèi)源性及部分外源性物質(zhì)的代謝[9]，而CYP450超家族中的CYP1-4蛋白被普遍認(rèn)為是多不飽和脂肪酸ω-3及ω-6氧化反應(yīng)的催化劑[10]，推測(cè)BCD的發(fā)病與脂質(zhì)代謝異常相關(guān)。最新一項(xiàng)研究顯示降低細(xì)胞內(nèi)的游離膽固醇可能是BCD的一種有效療法[11]，但CYP4V2基因所主導(dǎo)的生化途徑尚未被闡明。BCD具有高度遺傳異質(zhì)性，至今已發(fā)現(xiàn)的BCD致病突變位點(diǎn)達(dá)82個(gè)，遍布全部11個(gè)外顯子區(qū)域[5]。因此，針對(duì)個(gè)體的基因篩查以明確病變基因，對(duì)于BCD患者的診斷、治療及遺傳咨詢等有重要意義。

本文研究的3個(gè)BCD家系，先證者均具有明顯的BCD表現(xiàn)：首發(fā)癥狀為夜盲或視力下降，眼底存在典型的結(jié)晶樣物質(zhì)沉積，伴有不同程度的RPE萎縮。筆者通過基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)突變位點(diǎn)（c.775C＞A、c.802-8_810dell7insGC、c.219T＞A、c.870T＞G、c.846T＞C），其中兩個(gè)為同義突變（c.870T＞G、c.846T＞C）不造成蛋白質(zhì)改變。對(duì)于F1及F2，筆者通過基因篩查，找到了c.802-8_810dell7insGC突變。經(jīng)國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究證實(shí)，這是東亞人群中最為常見的突變方式[12-13]，該突變引起的臨床表現(xiàn)多樣，國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究針對(duì)CYP4V2基因進(jìn)行了一系列基因型-表型研究[14-19]，但未得出明確的結(jié)論。有研究指出，相較于其他突變，CYP4V2基因中存在c.802-8_810dell7insGC突變的BCD患者的臨床表現(xiàn)較為嚴(yán)重[15]，而擁有復(fù)合雜合突變c.802-8_810dell7insGC的臨床表現(xiàn)又較純合突變嚴(yán)重，可合并黃斑水腫、脈絡(luò)膜新生血管、黃斑裂孔等[6，14，18]。但也有研究指出 BCD患者的基因型-表型無明確關(guān)聯(lián)，Meng等[16]首次對(duì)中國(guó)BCD人群進(jìn)行大樣本的人口特征及基因型-表型研究，發(fā)現(xiàn)兩者之間表現(xiàn)出高度變異性，但并不存在明確的基因型-表型關(guān)聯(lián)，提示環(huán)境因素在BCD進(jìn)展中的重要作用。

F3中發(fā)現(xiàn)的c.219T＞A（p.F73L）突變最早報(bào)道于2014年，Yin等[6]在17例BCD患者的34對(duì)等位基因中檢出7個(gè)該突變。因?yàn)榇送蛔冊(cè)谡€(gè)體中未被發(fā)現(xiàn)，73號(hào)位的苯丙氨酸又是一個(gè)高度保守序列，再加上存在該變異的BCD患者未發(fā)現(xiàn)其他致病突變，故Yin等[6]認(rèn)為c.219T＞A（p.F73L）為BCD的致病突變。之后Meng等[16]對(duì)92個(gè)BCD家系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)該突變的頻率為3/184，Tian等[3]的研究檢測(cè)到突變頻率為1/10，以上均表明c.219T＞A（p.F73L）突變可能為BCD的致病突變。F3中先證者F3:Ⅱ:1檢測(cè)出c.219T＞A（p.F73L）突變，而其他家系成員及150名健康對(duì)照志愿者中均未發(fā)現(xiàn)該突變，且在先證者F3:Ⅱ:1中未發(fā)現(xiàn)其他已明確報(bào)道的致病突變，由此推測(cè)c.219T＞A（p.F73L）突變可能為F3的致病突變。

此外，3個(gè)BCD家系的所有成員均檢測(cè)出c.775C＞A（p.Q259K）突變。2013年Rossi等[20]檢測(cè)了15例BCD患者的CYP4V2基因，發(fā)現(xiàn)2例c.775A＞C（p.K259Q）突變，他們判斷此為良性突變。2017年Jiao等[5]在58例BCD患者中發(fā)現(xiàn)4例c.775A＞C（p.K259Q）突變，并判斷它可能不是BCD的致病突變。而筆者將測(cè)序結(jié)果與Genbank、千人基因組計(jì)劃中的野生型CYP4V2基因參考序列（GenBank：KR710969.1）進(jìn)行對(duì)比分析后發(fā)現(xiàn)c.775C＞A（p.Q259K）突變，且該突變不只存在于3例先證者身上，同樣存在于其他家系成員及32名健康志愿者中。故c.775C＞A（p.Q259K）突變可能不是BCD的致病突變，不具備相應(yīng)的臨床意義，但先前報(bào)道的c.775A＞C（p.K259Q）突變的準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。