谷杭芝 林蒙蒙 林蓉蓉 戴張波 胡燕

子宮內(nèi)膜異位癥是一種常見的婦科疾病，以宮腔以 外部位（卵巢、大網(wǎng)膜、子宮直腸陷凹、腹壁、肺等）的活性子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖、浸潤為特點(diǎn)，引起頑固性、進(jìn)展性、慢性盆腔疼痛，可導(dǎo)致不孕、月經(jīng)異常等。子宮內(nèi)膜異位癥雖然是一種良性疾病，但也存在惡變的風(fēng)險(xiǎn)[1]。育齡期婦女子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病率接近5%～10%，而近年來卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病率有明顯上升趨勢。手術(shù)是治療子宮內(nèi)膜異位癥的主要手段，但復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重影響育齡婦女的身心健康。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一種可溶性細(xì)胞因子，其在子宮內(nèi)膜異位癥患者的腹腔液、血清、異位內(nèi)膜組織中均呈高表達(dá)[2-4]。本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析（polymorphism chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis，PCR-RFLP）技術(shù)對MIF基因多態(tài)性進(jìn)行分析，探討其與子宮內(nèi)膜異位癥遺傳易感性的關(guān)系，以期為子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生機(jī)制及早期診斷提供依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2014年3月至2015年7月在本院婦科接受腹腔鏡手術(shù)的卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥患者150例作為病例組，術(shù)后標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為子宮內(nèi)膜異位癥，年齡 21～46 歲，中位年齡 35（26，37）歲。選取同期本院健康體檢者或因其他原因進(jìn)行腹腔鏡手術(shù)的患者150例作為對照組，通過詢問既往史結(jié)合相關(guān)化驗(yàn)檢查后排除子宮內(nèi)膜異位癥，年齡20～50歲，中位年齡29（25，36）歲。兩組受試者年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），彼此之間無血緣關(guān)系，無婦科良、惡性腫瘤，無糖尿病、甲狀腺功能異常等內(nèi)分泌疾病，家族史中無遺傳病，無肝炎、結(jié)核等感染性疾病，無類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及其他自身免疫性疾病，近期未服用過激素類藥物。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者本人或其家屬同意。

1.2 試劑與儀器 血液基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、50bp DNA ladder、100bp DNA ladder、DNA loading buffer購自天根生化科技（北京）有限公司，限制性內(nèi)切酶 AluⅠ、HaeⅢ、HpaⅡ購自 NEB（北京）有限公司，紫外分光光度計(jì)購自美國Thermo公司，電泳儀購自北京百晶生物技術(shù)有限公司，PCR擴(kuò)增儀購自德國Mastercycler Gradient Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取 無菌操作下采集外周靜脈血至少5ml，加入內(nèi)置有0.85ml枸櫞酸鈉的試管中，混勻，放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?周內(nèi)檢測）。采用血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組NDA。

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 搜索NCBI網(wǎng)站，獲取人MIF基因的序列及 MIF-rs4822446 A/G、rs4822443 G/A、rs2012133 G/C位點(diǎn)序列。將MIF基因的序列導(dǎo)入Primer Premier 5軟件中，使用Primer功能設(shè)計(jì)位于各基因位點(diǎn)上下游的引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。

表1 各位點(diǎn)引物序列

1.3.3 基因多態(tài)性檢測 采用PCR-RFLP技術(shù)檢測MIF-rs4822446 A/G、rs4822443 G/A、rs2012133 G/C 位點(diǎn)基因多態(tài)性。PCR反應(yīng)體積為20μl體系，其中模板1μg，上游引物 1μl，下游引物 1μl，2×Taq PCR Master－Mix 10μl，雙蒸水補(bǔ)足至 20μl。酶切體系為：PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 2.5μl、10×Buffer 1μl、三蒸水 6.3μl、限制性內(nèi)切酶0.2μl，恒溫水浴4h。將酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，電腦成像系統(tǒng)成像分析。各位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶及其酶切產(chǎn)物長度見表2。

表2 各位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶及其酶切產(chǎn)物長度

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；對照組各位點(diǎn)基因型頻率的觀察值與預(yù)期值行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。采用logistic回歸分析計(jì)算等位基因和基因型的OR值和95%CI。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 對照組MIF-rs4822446 A/G、rs4822443 G/A、rs2012133 G/C 位點(diǎn)中基因型頻率觀察值與預(yù)期值間均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05），表明本實(shí)驗(yàn)對照組資料具有群體代表性。

2.2 酶切結(jié)果 MIF-rs4822446 A/G位點(diǎn)經(jīng)特異引物進(jìn)行PCR后得到326bp大小的DNA雙鏈，經(jīng)AluⅠ酶切后，GG型可見1條326bp大小的條帶，AA型可見1條200bp和1條126bp大小的條帶，GA型同時(shí)可見上述3條條帶，見圖1。MIF-rs4822443 G/A位點(diǎn)經(jīng)特異引物進(jìn)行PCR后得到326bp大小的DNA雙鏈，經(jīng)HaeⅢ酶切后，AA型可見1條326bp大小的條帶；GG型被酶切成1條298bp和1條38bp大小的條帶，而38bp大小的條帶較小，因此在電泳圖上GG型僅見到1條298bp大小的條帶；GA型可見1條326bp和1條298bp大小的條帶，見圖2。MIF-rs2012133 G/C位點(diǎn)經(jīng)特異引物進(jìn)行PCR后得到793bp大小的DNA雙鏈，經(jīng)HpaⅡ酶切后，CC型可見1條209bp和1條584bp大小的條帶，GG型僅見1條793bp大小的條帶，CG型同時(shí)可見上述3條條帶，見圖3。

圖1 MIF-rs4822446 A/G位點(diǎn)酶切產(chǎn)物電泳圖（1為GG型；2為GA型；3為AA型）

圖2 MIF-rs4822443 G/A位點(diǎn)酶切產(chǎn)物電泳圖（1為GG型；2為GA型；3為AA型）

圖3 MIF-rs2012133 G/C位點(diǎn)酶切產(chǎn)物電泳圖（1為CC型；2為CG型；3為GG型）

2.3 兩組多態(tài)性位點(diǎn)等位基因、基因型頻率分布 兩組受試者M(jìn)IF-rs4822446 A/G位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。兩組受試者M(jìn)IF-rs4822443 G/A位點(diǎn)的等位基因和基因頻率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中攜帶A等位基因的婦女患子宮內(nèi)膜異位癥的風(fēng)險(xiǎn)較攜帶G等位基因的婦女高（OR=1.145，95%CI：1.053～1.246，P＜0.05）。兩組受試者M(jìn)IF-rs2012133 G/C位點(diǎn)的等位基因和基因頻率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中攜帶C等位基因的婦女患子宮內(nèi)膜異位癥的風(fēng)險(xiǎn)較攜帶G等位基因的婦女高（OR=1.208，95%CI：1.038～1.407，P＜0.05），見表 3。

表3 兩組多態(tài)性位點(diǎn)等位基因和基因型頻率分布比較[例（%）]

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥目前最經(jīng)典的病因?qū)W說就是Sampson提出的經(jīng)血逆流學(xué)說[5]，而在實(shí)際的臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，接近90%的育齡期婦女都會(huì)出現(xiàn)經(jīng)血逆流，而只有10%會(huì)發(fā)展成子宮內(nèi)膜異位癥[6]。子宮內(nèi)膜異位癥是一種多基因遺傳疾病，攜帶突變基因的患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞更具有黏附和宮外生長的活性[7]。目前有較多研究將關(guān)注點(diǎn)聚焦于MIF上，其在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中作用的研究已日益受到重視。人的MIF基因長度＜1kb，位于22號染色體長臂（2Zql1.2）的保守區(qū)內(nèi)，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成。MIF含有115個(gè)氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量約為12.5kDa[8]。國內(nèi)外許多研究表明MIF在子宮內(nèi)膜異位癥患者的腹腔液、血清、異位內(nèi)膜組織中均呈高表達(dá)[2-4]。李建等[9]研究也證實(shí)以上觀點(diǎn)，并提出血清MIF水平在診斷子宮內(nèi)膜異位癥中具有一定價(jià)值，與糖類抗原125聯(lián)合檢測可提高子宮內(nèi)膜異位癥臨床診斷的特異度，有助于疾病的鑒別診斷。

目前MIF基因見報(bào)道較多的有4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，它們分別位于啟動(dòng)子區(qū)+656 C/G、+254 T/C、-173 G/C的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)和-794的CATTn（n=5～8）微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)，研究表明MIF基因多態(tài)性與多種腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。有關(guān)MIF基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系研究報(bào)道較少。王春平等[10]研究發(fā)現(xiàn)MIF基因啟動(dòng)子區(qū)-794 CATT微衛(wèi)星多態(tài)性與廣東漢族人群子宮內(nèi)膜異位癥的遺傳易感性相關(guān)，且CATT（5/5）基因型及CATT（5）等位基因型可能是其易感基因型。于雅等[11]研究發(fā)現(xiàn)MIF基因啟動(dòng)子區(qū)+254 T/C位點(diǎn)多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的易感性有關(guān)，而C等位基因可能是其發(fā)生的遺傳易感標(biāo)志。石瑾秋等[12]研究發(fā)現(xiàn)MIF基因啟動(dòng)子區(qū)-173位點(diǎn)多態(tài)性與湖南漢族人群子宮內(nèi)膜異位癥的遺傳易感性相關(guān)，其CC基因型可能是其易感基因。以上研究均提示MIF基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥的遺傳易感性有關(guān)。然而不同研究者得出不同的基因多態(tài)性位點(diǎn)均可能是子宮內(nèi)膜異位癥的易感基因，為進(jìn)一步補(bǔ)充研究MIF基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥的遺傳易感性關(guān)系，本研究從MIF-rs4822446 A/G、rs4822443 G/A、rs2012133 G/C 3個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性出發(fā)，通過PCR-RFLP技術(shù)發(fā)現(xiàn)MIF-rs4822443 G/A和MIF-rs2012133 G/C位點(diǎn)多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，而MIF-rs4822446 A/G位點(diǎn)多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。MIF-rs4822446 A/G位點(diǎn)A等位基因可能不是子宮內(nèi)膜異位癥的易感基因。MIF-rs4822443 G/A位點(diǎn)攜帶有A等位基因的婦女患有子宮內(nèi)膜異位癥的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶G等位基因婦女的1.145倍。MIF-rs2012133 G/C位點(diǎn)攜帶有C等位基因的婦女患有子宮內(nèi)膜異位癥的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶G等位基因婦女的1.208倍。

綜上所述，本研究證實(shí)MIF-rs4822443G/A、rs2012133 G/C位點(diǎn)多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥遺傳易感性有關(guān)，為臨床篩選高風(fēng)險(xiǎn)婦女提供了檢測依據(jù)。MIF-rs4822443 G/A位點(diǎn)攜帶有A等位基因和MIF-rs2012133 G/C位點(diǎn)攜帶有C等位基因的婦女MIF基因表達(dá)是否異常，是否與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。