樊理華 李東麗 何佳群 武旖旎 韓新

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤，目前最有效的治療方法是廣泛性根治手術(shù)，但仍有50%的患者術(shù)后2年出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，其中約20%～30%的患者出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，而50%～80%的患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1-2]。手術(shù)本身是一種強(qiáng)烈的創(chuàng)傷應(yīng)激，是增加腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的主要原因之一[3]。但是目前還沒有一種理想的手術(shù)創(chuàng)傷腫瘤模型用于手術(shù)應(yīng)激對腫瘤影響的研究，因而建立簡單有效的腫瘤創(chuàng)傷應(yīng)激模型非常必要。本研究擬制備大鼠結(jié)直腸癌模型，在該模型基礎(chǔ)上予以特制的阻熱黃銅模板對大鼠進(jìn)行熱創(chuàng)傷處理，建立大鼠熱創(chuàng)傷應(yīng)激模型，旨在探索針對性的防治措施。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物條件 健康雄性SD大鼠72只，體重150～200g，購自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，本實(shí)驗(yàn)獲得溫州醫(yī)科大學(xué)動物保護(hù)委員會批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由獲取水和食物；動物房12h明暗周期循環(huán)（7：00～19：00給予光照），控制室溫為（21±2）℃、濕度60%。

1.2 試劑和儀器 N-甲基-N-亞硝基脲（MNU）（加拿大Toronto Research Chemicals公司），促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）（10817-09R）、IL-6（10926-09R）、IL-10（10542-09R）、皮質(zhì)酮（10356-09R）ELISA 試劑盒（上海博蘊(yùn)生物科技有限公司），一次性使用靜脈留置針（蘇州靈巖醫(yī)療器械有限公司），高速低溫離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器公司），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），超聲破膜儀（美國Sonics公司），Bio-Rad垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司），Las2000mini曝光機(jī)（美國General Electric公司），Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀（德國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常對照組、癌癥模型組和熱創(chuàng)傷應(yīng)激組3組，每組24只。

1.3.2 結(jié)直腸癌模型的建立 將MNU用無菌蒸餾水配制成濃度為4mg/ml的灌腸液對大鼠進(jìn)行灌腸，灌腸前抓住大鼠尾巴促使大鼠將直腸內(nèi)大便排出，用5ml注射器抽取灌腸液（1ml/200g）接上小兒灌腸管，導(dǎo)管前端用石蠟油涂抹，置入肛門約6cm，緩慢勻速推注，推畢后保持原位10min。灌注頻率：前4周以3次/周灌腸，4周后以1次/周持續(xù)灌腸至16周。每天對大鼠進(jìn)行觀察，每次灌注前記錄1次體重。

1.3.3 熱創(chuàng)傷應(yīng)激模型的建立 在結(jié)直腸癌模型基礎(chǔ)上，麻醉大鼠后，剪去大鼠背部脊柱兩側(cè)范圍約 30mm×30mm的長毛后，用8%硫化鈉脫毛，露出體表皮膚，將大鼠俯臥于手術(shù)固定板上，將特制的阻熱黃銅模板（12mm×12mm）放入100℃沸水中10min，取出后置于大鼠裸露皮膚處20s，將其重新加熱后置于脊柱另一側(cè)，整個燙傷過程只靠黃銅本身重力，不再另外施壓。

1.3.4 檢測標(biāo)本采集 熱創(chuàng)傷應(yīng)激組和癌癥模型組分別于熱創(chuàng)傷刺激后0、6、12和24h各隨機(jī)取6只大鼠取血和采集結(jié)直腸組織。正常對照組不作任何處理，根據(jù)另兩組處理時(shí)間各隨機(jī)取6只大鼠取血和采集結(jié)直腸組織。3組大鼠均于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)予5%水合氯醛7ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，尾靜脈穿刺取血；脫頸椎處死，取出肛緣至回盲部的結(jié)直腸組織，經(jīng)液氮冰凍后-80℃保存。

1.4 血清指標(biāo)檢測 采用ELISA法檢測大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質(zhì)酮表達(dá)水平。

1.5 結(jié)直腸組織細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）D1和髓樣細(xì)胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。取大鼠結(jié)直腸組織60mg，把組織剪切成細(xì)小的碎片，按照每20mg組織加入200μl裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑）。研磨后的勻漿在超聲破膜機(jī)下超聲破膜 10s×3次，4℃、12 000r離心 5min，小心吸取上清液，進(jìn)行蛋白含量測定。在Bio-Tek熒光分析儀上測定并計(jì)算出實(shí)際濃度。灌膠上樣，采用Bio-Rad垂直電泳儀進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜封閉過夜，洗膜后加入一抗孵育（稀釋度 1∶1 000）4℃搖床孵育過夜（16h），沖洗后加二抗孵育，曝光。采用Quantity One凝膠分析軟件行半定量分析，以Cyclin D1、Mcl-1與內(nèi)參β-actin灰度值的比值反映Cyclin D1、Mcl-1的蛋白表達(dá)。

1.6 病理組織學(xué)觀察 部分結(jié)直腸組織于4%多聚甲醛固定24h，制備石蠟標(biāo)本切片后行HE染色，觀察腫瘤組織病理形態(tài)，確定病理類型。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及病理檢查結(jié)果 臨床表現(xiàn)來看，正常對照組大鼠在實(shí)驗(yàn)期間活動正常，體重增長，無死亡。癌癥模型組和熱創(chuàng)傷應(yīng)激組大鼠實(shí)驗(yàn)期間活動減少，精神萎靡，腹瀉，黏液膿血便，毛發(fā)脫落等，體重低于正常對照組，部分大鼠有腹水現(xiàn)象，也有死亡現(xiàn)象，解剖發(fā)現(xiàn)結(jié)腸腫瘤、腹腔有粘連。病理結(jié)果提示正常對照組大鼠結(jié)腸黏膜光滑，紋理清晰，未見充血、水腫（圖1a）。癌癥模型組和熱創(chuàng)傷應(yīng)激組大鼠結(jié)直腸組織腺癌，癌組織多呈橢圓形、圓形，胞質(zhì)豐富，核大畸形、深染，多見核分裂象，呈彌漫性生長。癌組織排列呈團(tuán)狀或索狀，在腸壁中呈浸潤性生長，癌細(xì)胞間有結(jié)締組織（圖1b）。

圖1 大鼠病理所見（a：正常對照大鼠；b：結(jié)直腸癌大鼠；HE染色，×4）

2.2 各組大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質(zhì)酮水平比較 癌癥模型組和正常對照組大鼠血清ACTH和皮質(zhì)酮水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），但癌癥模型組大鼠血清IL-6、IL-10水平較正常對照組均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。熱創(chuàng)傷應(yīng)激組大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質(zhì)酮水平較正常對照組和癌癥模型組均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；且熱創(chuàng)傷應(yīng)激組創(chuàng)傷應(yīng)激后6、12、24h血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質(zhì)酮水平較應(yīng)激后0h均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質(zhì)酮水平比較

2.3 各組大鼠結(jié)直腸組織中Cyclin D1和Mcl-1蛋白表達(dá)水平比較 取正常對照組0h、癌癥模型組0h與熱創(chuàng)傷應(yīng)激組0、6、12、24h 4個時(shí)間點(diǎn)的大鼠進(jìn)行Cyclin D1和Mcl-1蛋白表達(dá)水平比較，發(fā)現(xiàn)熱創(chuàng)傷應(yīng)激組4個時(shí)間點(diǎn)Cyclin D1和Mcl-1蛋白表達(dá)水平較正常對照組0h和癌癥模型組0h均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；且熱創(chuàng)傷應(yīng)激組創(chuàng)傷應(yīng)激后6、12、24h Cyclin D1和Mcl-1蛋白表達(dá)水平較應(yīng)激后0h均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2和表2。

圖2 正常對照組（N）0h、癌癥模型組（C）0h與熱創(chuàng)傷應(yīng)激組（TIS）0、6、12、24h的 Cyclin D1和 Mcl-1蛋白表達(dá)電泳圖

表2 各組大鼠結(jié)直腸組織中Cyclin D1、Mcl-1蛋白表達(dá)水平比較（ng/ml）

3 討論

既往研究結(jié)直腸癌的腫瘤發(fā)生、腫瘤生物學(xué)和特定分子事件對結(jié)直腸生物學(xué)的影響，應(yīng)用較多的是人類的結(jié)直腸癌活檢標(biāo)本、結(jié)直腸癌異種移植物以及結(jié)直腸癌體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，但這些方法使用的是已建立的腫瘤和結(jié)腸癌細(xì)胞系，具有突變復(fù)雜性，這限制了對單個突變影響的清晰理解[4]。另外這些模型大多應(yīng)用于小鼠，會對實(shí)驗(yàn)的操作及觀察空間有一定的限制，且不能完全自然模擬結(jié)直腸癌原位生長及侵襲轉(zhuǎn)移過程[5]。本實(shí)驗(yàn)成功地通過MNU灌腸方法建立了大鼠結(jié)直腸癌模型，模擬大鼠結(jié)直腸癌自然誘導(dǎo)生長過程，成瘤時(shí)間相對較短，成瘤率高，腫瘤組織病理和生物學(xué)特性比較穩(wěn)定，自然客觀地模擬了結(jié)腸癌的發(fā)生機(jī)制，應(yīng)用SD大鼠又可進(jìn)一步提升實(shí)驗(yàn)操作的空間，為更深入地研究結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制、轉(zhuǎn)移機(jī)制和抗轉(zhuǎn)移治療提供了一種理想的動物模型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，癌癥模型組和熱創(chuàng)傷應(yīng)激組大鼠與正常對照組相比實(shí)驗(yàn)期間活動減少，精神萎靡，腹瀉、黏液膿血便、毛發(fā)脫落等，體重低于正常對照組，解剖發(fā)現(xiàn)結(jié)腸腫瘤、腹腔有粘連。大鼠腫瘤組織HE染色病理結(jié)果顯示癌細(xì)胞穿透結(jié)腸組織黏膜層、侵入肌層，提示結(jié)直腸癌模型制備成功。

理想的動物模型是手術(shù)應(yīng)激研究的基礎(chǔ)，應(yīng)該與圍術(shù)期產(chǎn)生的手術(shù)應(yīng)激機(jī)制相近，模擬手術(shù)應(yīng)激對機(jī)體造成的創(chuàng)傷；動物存活時(shí)間足夠長，不影響做后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究；模型制作簡單，誘導(dǎo)因素單一，模型重復(fù)性好，造成手術(shù)應(yīng)激的同時(shí)盡量避免觸發(fā)其他應(yīng)激源對應(yīng)激指標(biāo)結(jié)果的干擾[6-7]。手術(shù)誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)與熱創(chuàng)傷損害觸發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)大部分類似[8]，熱創(chuàng)傷能夠提供一個創(chuàng)傷誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)的模型，用來研究長時(shí)間應(yīng)激反應(yīng)的長期效應(yīng)。目前，國內(nèi)外建立的創(chuàng)傷應(yīng)激動物模型種類繁多，以Regas FC和Ehrlich HP發(fā)明的銅梳燒傷模型應(yīng)用較為廣泛[9]，且操作簡便可重復(fù)性好，被認(rèn)為是研究創(chuàng)傷應(yīng)激的合理方法，所以本實(shí)驗(yàn)選擇該具有代表性的熱創(chuàng)傷應(yīng)激模型，對結(jié)直腸癌大鼠造成熱創(chuàng)傷應(yīng)激以進(jìn)一步研究手術(shù)應(yīng)激對腫瘤微環(huán)境的影響。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程復(fù)雜，其與機(jī)體的相互關(guān)系的研究也在不斷深入中，其中腫瘤微環(huán)境在腫瘤始動、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和耐藥性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[10]。研究表明腫瘤多樣性和侵襲性都跟其微環(huán)境組成、生化特性、構(gòu)造和生理特性相關(guān)[11]。手術(shù)切除腫瘤病灶除了能夠引起手術(shù)部位的局部改變，還可導(dǎo)致機(jī)體的全身性變化。手術(shù)創(chuàng)傷可通過應(yīng)激激發(fā)引起全身炎癥反應(yīng)、神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)、細(xì)胞因子的變化、代謝改變以及其他一些可能的生物學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致下丘腦、垂體、腎上腺軸興奮，皮質(zhì)類固醇大量釋放，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境的變化，從而改變腫瘤的生物學(xué)特性[12-14]。本實(shí)驗(yàn)用高溫黃銅塊對大鼠進(jìn)行熱創(chuàng)傷處理，通過對比各組大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質(zhì)酮水平來評估應(yīng)激狀態(tài)，建立大鼠熱創(chuàng)傷應(yīng)激模型。大鼠熱創(chuàng)傷即刻可見皮膚損傷，創(chuàng)傷1周內(nèi)創(chuàng)傷處皮膚有水腫、出血、壞死。ELISA法測大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質(zhì)酮水平表明熱創(chuàng)傷應(yīng)激后上述指標(biāo)水平顯著升高，提示熱創(chuàng)傷應(yīng)激模型制備成功。

IL-6是腫瘤相關(guān)的重要促炎因子，其在結(jié)直腸癌及間質(zhì)表型的結(jié)直腸癌細(xì)胞中高表達(dá)，在結(jié)直腸癌腫瘤炎性微環(huán)境中起著重要作用[15]。研究表明，經(jīng)IL-6介導(dǎo)的信號通路在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，IL-6可使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3） 磷酸化[16]。磷酸化的STAT3（p-STAT3）進(jìn)入細(xì)胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，引起一系列促增殖蛋白（如 Cyclin D1）和抗凋亡蛋白（如 Mcl-1）的表達(dá)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。細(xì)胞的增殖狀態(tài)對研究腫瘤生物學(xué)行為、判斷其危害性具有及其重要意義，一旦細(xì)胞周期調(diào)控失常，就會導(dǎo)致腫瘤的惡性增生。Cyclin D1是細(xì)胞周期G期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其功能受抑制可導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，而該蛋白的不規(guī)則表達(dá)則加速G1期[17]。Mcl-1蛋白屬B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（bcl-2）家族蛋白，是一種高度調(diào)節(jié)蛋白，能夠引起廣泛的生存信號，也可作為細(xì)胞凋亡控制頂端的分子迅速下調(diào)凋亡過程，并通過早期介入導(dǎo)致線粒體細(xì)胞色素C釋放的級聯(lián)來促進(jìn)細(xì)胞存活[18]。本研究檢測發(fā)現(xiàn)大鼠血清中IL-6在熱創(chuàng)傷應(yīng)激后明顯升高，表明熱創(chuàng)傷應(yīng)激可異常誘導(dǎo)IL-6水平。同時(shí)結(jié)直腸組織中兩個增殖凋亡相關(guān)蛋白在熱創(chuàng)傷應(yīng)激后也能顯著升高，這說明熱創(chuàng)傷應(yīng)激能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌大鼠腫瘤細(xì)胞增殖。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在成功構(gòu)建的結(jié)直腸癌模型基礎(chǔ)上復(fù)合熱創(chuàng)傷應(yīng)激，構(gòu)建了結(jié)直腸癌大鼠熱創(chuàng)傷應(yīng)激模型，具有操作簡便、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。熱創(chuàng)傷應(yīng)激可引起大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質(zhì)酮水平升高，導(dǎo)致手術(shù)應(yīng)激相類似的激素改變。另外，熱創(chuàng)傷應(yīng)激可導(dǎo)致結(jié)直腸癌大鼠體內(nèi)IL-6的異常激活，誘導(dǎo)促細(xì)胞增殖蛋白（Cyclin D1）和抗細(xì)胞凋亡蛋白（Mcl-1）的表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌大鼠腫瘤增殖，故該模型可用于圍術(shù)期手術(shù)創(chuàng)傷對腫瘤微環(huán)境影響的機(jī)制研究，從而改善惡性腫瘤術(shù)后預(yù)后。