魏寧頤,何 丹,林 麗,王雪梅,林銀驥,楊 梅

(云南中醫(yī)學院,云南 昆明650500)

1 實驗動物

現(xiàn)國內(nèi)外可以作為實驗用的動物有百余種,大致可以分為三類：哺乳類、鳥類、兩棲類。鳥類動物在實驗中因場地及個體生存因素要求較多,未被采用。兩棲類如青蛙多用于實驗教學,本課題也暫不考慮。另外,考慮實驗動物當與人體生理、病理相似,故課題組擬從哺乳類中選擇實驗動物。哺乳類實驗動物常用的有：兔、猴、狗、大鼠、小鼠等。家兔對溫度變化表現(xiàn)明顯；犬貓科動物對喂養(yǎng)食物敏感,容易發(fā)生嘔吐反應；猴進化程度與人類最為相似,為理想的實驗動物,但其飼養(yǎng)成本高,課題組經(jīng)費有限最終也未選擇。大鼠多用于安全性試驗及生長發(fā)育相關(guān)的研究,對呼吸道疾病有較強的抵抗力,為更好地觀察云南春燥證引起的呼吸道病理改變,也未選用。小鼠形體小、飼養(yǎng)空間成本要求低,且對溫差敏感,2～3℃就能引起生理上的改變,符合中醫(yī)動物模型必須充分體現(xiàn)中醫(yī)的基本特點并結(jié)合辨證論治等思路[4-5],且有文獻表示小鼠可以用于解熱鎮(zhèn)靜研究[6]。現(xiàn)我國實驗小鼠種類繁多,經(jīng)過科研工作者的多年選育,昆明種小鼠適應力強,成活率高,飼養(yǎng)成本低,我國有70%的中醫(yī)證候?qū)嶒灢捎美ッ鞣N小鼠,具有豐富的實驗基礎。最終課題組結(jié)合實驗需要及相關(guān)實驗指標的要求選取昆明種小鼠作為實驗用鼠。

2 制模因素

中醫(yī)證候動物模型的制作方法有模擬病因、復制癥狀、藥物反證等方法,本研究采用模擬病因的方法來制作云南春燥證動物模型。

中醫(yī)學用陰陽來概括自然界和人體,陰在內(nèi),陽在外,陰陽失調(diào)可以為致病因素。云南春燥證形成的原因也可以從內(nèi)外2個因素考慮。在外為云南地區(qū)春季特有的氣候因素：多風、少雨、土質(zhì)稀薄不易存水、1000多米的海拔紫外線強度較高；在內(nèi)為云南人嗜食辛辣的飲食特征?？紤]以上2種重要原因,造模選擇在特殊制定的人工氣候箱進行,課題組借鑒西北燥證造模經(jīng)驗,及外燥證小鼠造模經(jīng)驗,在了解云南地區(qū)春季平均氣溫后,最終將云南春燥模型造模外因因素定為溫度(23±2)℃,相對濕度(31.5±2)%,每日am10∶00-pm8∶00打開風扇,風速2.7m/s進行吹風,同時給予正常光照。課題組自配小鼠可用的香燥飼料配方如下,辣椒粉∶五香粉=1∶3,飼料∶香燥配料=100∶1(五香粉為云南昆明華瑞食品加工有限公司生產(chǎn)),從而模擬云南春燥的致病內(nèi)因。

3 實驗指標

云南春燥證臨床常以口鼻、咽喉、肌膚干燥和干咳為臨床特征[3]。故實驗在初步設計指標時擬選取三個基本指標,意在驗證造模方法的可行性及效果。小鼠生物表征(活動度、飲食、二便、毛發(fā)),腹背皮膚含水率,氣道sIg A、SP-A以及SP-D,小鼠腹部、背部肌膚的含水率,以測量春燥環(huán)境對小鼠皮膚干燥程度的影響。

實驗過程中課題組對小鼠生物表征進了觀察,目前得到一些表征的變化[7-8],例如實驗小鼠出現(xiàn)煩躁、易怒、可見實驗小鼠身上打斗后的咬痕；小鼠毛發(fā)稀疏,缺少光澤；爪甲顏色變暗等。欲提高實驗準確度,建議實驗后期對這些生物指標進行定量分析,制定定性分析表,采用更多的實驗手法驗證小鼠生物表征、生活習性等,而非只是目前的定性分析,讓實驗更具定量意義。實驗初期,因動物頸部猝死后摘取肺組織進行病理檢測,故腹部皮膚采樣面積過小,無法進行含水率的測量,建議后期實驗中注意再殺小鼠方式,盡量保證小鼠腹部皮膚完整性,以便于進一步測量腹部皮膚含水率。

4 模型標準

課題組造模采取的是病因造模法,在判斷模型是否成功因素上,參考云南春燥證臨床癥狀,效仿丁建中[9]、楊靜寧等人[10]應用桑杏湯、沙參麥冬湯分別檢測溫燥及陰虛內(nèi)燥的方法,驗證云南春燥動物模型。初步篩選部分指標進行論證,例如：小鼠皮膚含水率降低、小鼠二便干燥、小鼠呼吸道出現(xiàn)因干燥引起的一系列病理性反應,如氣道免疫球蛋白、呼吸道組織變化、大腸組織變化、呼吸道纖毛運動等。同時對造模小鼠給予桑杏湯治療,實驗結(jié)果表明,桑杏湯組小鼠情志、體重、飲食量、飲水、毛發(fā)、二便等均有改善,氣道sIg A、SP-A以及SP-D含量均明顯下降。結(jié)果提示桑杏湯干預下的云南春燥證小鼠模型臨床癥狀有所改善,可以說明云南春燥受外燥影響明顯[11]。

5 存在的問題

當前階段課題組依據(jù)文獻及相關(guān)類似實驗經(jīng)驗采用病因造模法,探討穩(wěn)定并可以復制的云南春燥證造模方法。在造模2周后檢測了部分實驗指標,包括生物表征、皮膚含水量、氣道免疫球蛋白等,實驗結(jié)果所示[6-7]小鼠經(jīng)過2周的人工氣候箱飼養(yǎng),已經(jīng)開始出現(xiàn)生物表征的變化,這種變化隨著飼養(yǎng)在干燥氣候的時間增加而越來越明顯；小鼠的肺組織及氣道內(nèi)sIg A、Sp-A含量下降,SP-D、IgG含量上升。因?qū)嶒炋幵谄鸩诫A段,當前實驗指標過少,無法準確判斷造模是否成功。課題組應當進一步擴大實驗指標檢測范圍,篩選云南春燥證黃金指標,例如代表肺津的水通道蛋白、免疫應答白介素細胞、呼吸道黏膜運動情況等指標。同時,在現(xiàn)階段已出現(xiàn)變化的實驗指標上,進一步采取以方測證法、反證動物模型,進一步完善云南春燥動物模型的科學性。

6 結(jié)語

本課題組云南春燥證動物模型的研制已開展一段時間,目前課題組已初步完成模型的建立,并檢驗了小鼠生物表征(活動度、飲食、二便、毛發(fā)),背皮膚含水率,氣道sIg A、SP-A以及SP-D這些指標,從目前實驗數(shù)據(jù)來看,云南春燥動物模型的建立已取得階段性成果。但為確保實驗的嚴謹性、科學性,建議課題后期重點篩選更多實驗指標,規(guī)范實驗客觀指標,盡可能應用可量化實驗指標。同時進一步確定云南春燥證動物模型的黃金指標,并對已出現(xiàn)變化的實驗指標進行“以方測證”,運用反證方法對動物模型進行檢測,建立科學的可復制的云南春燥動物模型。