李 婷，鄧樹(shù)豪，董昭興

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥一病區(qū)，昆明 650101)

肺纖維化是一種由各種原因引起肺泡持續(xù)性損傷、細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積、成纖維細(xì)胞對(duì)肺部受損調(diào)節(jié)不受控制，從而導(dǎo)致肺部纖維化、正常肺組織結(jié)構(gòu)改變及功能喪失，多數(shù)患者在終末期因呼吸衰竭而死亡的疾病[1]。隨著人口老齡化加劇，肺纖維化的發(fā)病率不斷上升，已成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)健康問(wèn)題[2]。近年來(lái)，雖然肺纖維化治療方面的研究取得了一定進(jìn)展，但多數(shù)患者的平均預(yù)期壽命僅2～4年[3]。因此，尋找肺纖維化的新治療靶點(diǎn)顯得十分重要。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是先天性免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞跨膜受體和病原膜識(shí)別受體之一，其通過(guò)識(shí)別外來(lái)的微生物和入侵的病原體，發(fā)出內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)并激活機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。而TLR4作為一種膜識(shí)別受體，通過(guò)與相應(yīng)配體的結(jié)合能激活機(jī)體固有免疫反應(yīng)，在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、自噬的發(fā)生、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等方面有重要作用[4]。其中，持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的各細(xì)胞因子異常分泌是肺纖維化發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)?，F(xiàn)就TLR4與肺纖維化相關(guān)的研究進(jìn)展予以綜述。

1 TLR4的主要結(jié)構(gòu)及其信號(hào)通路

機(jī)體的免疫系統(tǒng)是一種非常復(fù)雜的宿主系統(tǒng)，它在機(jī)體的生命歷程中不斷進(jìn)化，以應(yīng)對(duì)內(nèi)外環(huán)境中各種病原體對(duì)機(jī)體的入侵。先天性免疫系統(tǒng)包含多種免疫細(xì)胞，其胞膜表面提供了可識(shí)別特定病原體相關(guān)分子模式，從而建立特定免疫保護(hù)反應(yīng)的多種膜受體，TLR是其中之一。自1997年末人類首次發(fā)現(xiàn)TLR4以來(lái)，已在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)并描述了13種不同類型的TLR[5-6]。TLR的實(shí)質(zhì)是一種跨膜蛋白質(zhì)，TLR4作為一種跨膜識(shí)別受體，其結(jié)構(gòu)主要包括三部分：富含亮氨酸的胞外段、跨膜段及含有Toll/白細(xì)胞介素(interleukin，IL)1受體(Toll/IL-1 receptor，TIR)結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)段。在胞外段，富含亮氨酸的TLR細(xì)胞外域限定了TLR4與特定配體的結(jié)合[7]。而髓樣分化蛋白(myeloid differential protein,MyD)2與TLR4相互作用后，在脂多糖結(jié)合蛋白、白細(xì)胞分化抗原14等輔助分子的參與下，可誘導(dǎo)配體與TLR4胞外段上的MyD2分子結(jié)合，形成TLR4-MyD2二聚體與配體的結(jié)合物。結(jié)合物產(chǎn)生的聚合信號(hào)可進(jìn)一步轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)段的TIR結(jié)構(gòu)域，TIR結(jié)構(gòu)域?yàn)橐欢闻cIL-1具有高度同源性的區(qū)域，是TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的核心元件，從而引發(fā)下游適配器蛋白的招募[8]。適配器蛋白主要包括MyD88、MyD88相關(guān)接頭蛋白、β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing adapter inducing interferon-β，TRIF)、TRIF相關(guān)接頭蛋白4種，這些適配器蛋白與TLR4胞內(nèi)段TIR結(jié)構(gòu)域相互關(guān)聯(lián)，參與形成兩條不同的胞內(nèi)信號(hào)通路。一條為MyD88依賴途徑，為T(mén)LR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑，也是與肺纖維化聯(lián)系最為密切的途徑。該途徑通過(guò)配體激活的TIR結(jié)構(gòu)域與MyD88及MyD88相關(guān)接頭蛋白結(jié)合，激活下游IL-1受體相關(guān)激酶，從而啟動(dòng)下游的核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)及核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1通路，促進(jìn)各種炎癥細(xì)胞因子基因表達(dá)的激活；另一條為T(mén)RIF依賴途徑，其通過(guò)TRIF及TRIF相關(guān)接頭蛋白與配體激活的TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合，啟動(dòng)下游信號(hào)干擾素調(diào)節(jié)因子3，從而促進(jìn)各種炎癥反應(yīng)的發(fā)生[9-12]。

2 TLR4信號(hào)通路在肺纖維化中的表達(dá)及作用

2.1TLR4信號(hào)通路在肺纖維化組織中的表達(dá) 雖然TLR4及其信號(hào)通路參與肺纖維化的發(fā)展，但其具體機(jī)制尚未明確。有研究通過(guò)干預(yù)TLR4的表達(dá)指出，TLR4的表達(dá)與肺纖維化的發(fā)展有密切聯(lián)系。在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化組織中，TLR4表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增強(qiáng)；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析TLR4及其下游的適配器蛋白MyD88、TRIF等發(fā)現(xiàn)，TLR4信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，提示在纖維化小鼠的肺組織中TLR4信號(hào)通路被廣泛激活[13]。與正常小鼠相比，TLR4基因敲除小鼠肺組織膠原的表達(dá)明顯減少，同時(shí)死亡率及纖維化程度也降低，提示TLR4的表達(dá)有助于肺纖維化的發(fā)展[14]。在關(guān)于肺纖維化的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，脂多糖通過(guò)激活TLR4信號(hào)的表達(dá)，誘導(dǎo)人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因下調(diào)和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路激活，促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的增殖，這可能在急性肺損傷后的早期加速肺纖維化的發(fā)展，而運(yùn)用TLR4干擾小RNA沉默肺成纖維細(xì)胞的TLR4基因后，脂多糖促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的作用減輕[15]。在聯(lián)合敲除小鼠TLR4及TLR2基因的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合基因敲除的小鼠在輻射誘導(dǎo)后TLR表達(dá)的缺失使肺纖維化程度加重，故認(rèn)為T(mén)LR4或TLR2中的一個(gè)或兩者共同在肺纖維化發(fā)展過(guò)程中具有保護(hù)作用[16]。同時(shí)與正常小鼠相比，TLR4基因敲除的小鼠在經(jīng)博來(lái)霉素誘導(dǎo)后肺纖維化程度加重，可見(jiàn)TLR4的缺失影響了組織的炎癥反應(yīng)及持續(xù)免疫抑制的緩解，促進(jìn)了肺組織損傷后組織纖維化的發(fā)展[17]。雖然TLR4在肺纖維化組織中表達(dá)增加，但基于TLR信號(hào)通路的復(fù)雜性，干預(yù)其表達(dá)可能促進(jìn)肺纖維化發(fā)展，也可能抑制肺纖維化發(fā)展，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究[18]。

2.2TLR4信號(hào)通路在肺纖維化中的作用 TLR4是TLR受體家族中的一種，其在肺纖維化的發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用。研究表明，肺纖維化的形成與機(jī)體的炎癥-免疫反應(yīng)有密切聯(lián)系，而TLR廣泛表達(dá)于各種免疫細(xì)胞，如樹(shù)突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等[19]。TLR4信號(hào)通路極其復(fù)雜，上下游各關(guān)鍵分子除與TLR4存在信號(hào)級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)作用外，還與其他分子蛋白存在交互作用。目前，關(guān)于TLR4信號(hào)通路與肺纖維化的研究主要集中在其主要配體高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)及下游關(guān)鍵靶蛋白MyD88、NF-κB方面，這些 TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵分子在肺組織的損傷、修復(fù)及纖維化的發(fā)展過(guò)程中有重要作用。在百草枯誘導(dǎo)的損傷肺組織中，檢測(cè)到TLR4-MyD88-NF-κB信號(hào)通路各蛋白的表達(dá)增加[20]?？梢?jiàn)，TLR4信號(hào)通路各關(guān)鍵蛋白在纖維化肺組織中表達(dá)增加，且可能在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

2.2.1激活HMGB1促進(jìn)肺纖維化發(fā)展 HMGB1是一種重要的炎癥介質(zhì)，同時(shí)還是TLR4的主要配體。有研究指出，在用HMGB1刺激體外培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞后，其平滑肌肌動(dòng)蛋白和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表達(dá)增加并達(dá)峰值，且通過(guò)NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)TGF-β1的釋放，可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞[21]。脂多糖刺激肺成纖維細(xì)胞，可促進(jìn)纖維細(xì)胞的異常增生和膠原蛋白的分泌，從而加劇肺纖維化，并通過(guò)誘導(dǎo)HMGB1的激活增強(qiáng)了肺纖維化的發(fā)展，其潛在的分子機(jī)制與TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活及其下游目標(biāo)有關(guān)[22]。此外有研究表明，在百草枯誘發(fā)的肺纖維化模型中，其IL-27和IL-23水平顯著升高，且支氣管肺泡灌洗液中的HMGB1水平也升高，而通過(guò)使用甘氨酸或TLR4陰性小鼠來(lái)阻斷HMGB1信號(hào)，可以極大程度地抑制中性粒細(xì)胞滲透導(dǎo)致的肺損傷[23]。因此在肺纖維化發(fā)展過(guò)程中，增強(qiáng)的HMGB1信號(hào)，激活了TLR4的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)了纖維化的發(fā)展。

2.2.2抑制MyD88減輕肺纖維化發(fā)展 MyD88是TLR4信號(hào)通路上游的主要適配器蛋白，其在肺纖維化中的表達(dá)增加，激活后可誘發(fā)一系列信號(hào)分子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與肺纖維化的發(fā)展。在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的肺組織中發(fā)現(xiàn)，其MyD88和IL-1受體的蛋白表達(dá)增加，而給予氟非尼酮降低IL-1受體和MyD88的表達(dá)水平后，可通過(guò)抑制炎癥小體的產(chǎn)生和MyD88信號(hào)通路的表達(dá)來(lái)減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[24]。在用人間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的正常小鼠肺組織細(xì)胞后，肺組織細(xì)胞的炎癥和纖維化程度明顯減輕，但在MyD88缺失的情況下，人間充質(zhì)干細(xì)胞減輕小鼠肺部炎癥和纖維化的能力降低，表明人間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)肺纖維化小鼠所具有的減輕肺部炎癥和纖維化的潛力部分是通過(guò)抑制MyD88介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)而產(chǎn)生[25]。MyD88在肺纖維化組織中表達(dá)增加，通過(guò)抑制其介導(dǎo)的信號(hào)通路可減緩肺纖維化的發(fā)展。

2.2.3抑制NF-κB減輕肺纖維化發(fā)展 TLR4信號(hào)激活可作用于其信號(hào)通路下游的NF-κB并促進(jìn)大量細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括促纖維化的IL-1、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等，同時(shí)引起各種細(xì)胞反應(yīng)作用于肺組織。有文獻(xiàn)報(bào)道，在百草枯誘導(dǎo)的小鼠肺損傷中，IL-1、TNF-α、IL-6等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)對(duì)急性肺損傷后炎癥細(xì)胞的激活具有重要意義，沉默相關(guān)基因可通過(guò)誘導(dǎo)NF-κB炎癥通路失活，減輕炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和纖維化，從而延緩肺組織損傷及纖維化的進(jìn)展[26]。此外有研究指出，運(yùn)用抗炎分子對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠進(jìn)行干預(yù)，可有效降低肺成纖維細(xì)胞的細(xì)胞活力和遷移率，抑制肺上皮細(xì)胞中與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，減弱博來(lái)霉素誘導(dǎo)小鼠的肺纖維化并改善其病理變化[27]。雖然抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路可以減少促纖維化炎癥因子的表達(dá)，但NF-κB受多種上游信號(hào)分子的調(diào)節(jié)，故TLR4/NF-κB炎癥信號(hào)通路在肺纖維化中的具體作用仍需進(jìn)一步研究。

3 TLR4參與肺纖維化的相關(guān)機(jī)制

3.1調(diào)節(jié)自噬 自噬失調(diào)與各種纖維性疾病的發(fā)展密切相關(guān),包括腎臟纖維化、心肌纖維化、肝臟及肺臟的纖維化等。近年來(lái)，研究者對(duì)導(dǎo)致肺纖維化的潛在機(jī)制有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，抑制自噬促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展已被初步證實(shí)。TLR4可通過(guò)作用于B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因，解除B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2同源結(jié)構(gòu)樣蛋白抗體1的抑制作用促進(jìn)自噬，同時(shí)還可直接誘導(dǎo)自噬小體的形成[28-29]。有研究從自噬水平闡述了TLR4在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化組織中的作用，并指出TLR4通過(guò)抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白途徑誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，從而減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。TLR4介導(dǎo)的自噬激活對(duì)肺組織的損傷、炎癥和纖維化轉(zhuǎn)歸十分重要。而TLR4的缺乏會(huì)干擾炎癥的消退，促進(jìn)損傷肺組織免疫抑制微環(huán)境的形成，抑制肺組織的自噬和凋亡，加重肺組織炎癥和纖維化。另有研究指出，TLR4的激活在肺纖維化的發(fā)展過(guò)程中起保護(hù)作用[17]。

3.2調(diào)節(jié)炎癥因子 當(dāng)機(jī)體的免疫細(xì)胞檢測(cè)到組織感染或損傷時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生保護(hù)性的炎癥反應(yīng)，對(duì)炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間和損傷部位進(jìn)行嚴(yán)格的控制。免疫炎癥保護(hù)反應(yīng)是病原體清除與病原體所在宿主細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡，保護(hù)損傷組織的關(guān)鍵過(guò)程，而肺纖維化的發(fā)展正是由于組織發(fā)生持續(xù)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織的修復(fù)不受調(diào)節(jié)和控制產(chǎn)生。TLR4的同源基因已被證實(shí)可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，通過(guò)激活TLR4啟動(dòng)一系列下游靶蛋白，可激活各種轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)下游IL-1、TNF-α、TGF-β1等細(xì)胞因子的產(chǎn)生[10,21]，這些細(xì)胞因子在肺纖維化的發(fā)展過(guò)程中有重要作用。

在靜脈注射博來(lái)霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的實(shí)驗(yàn)中，組織學(xué)證實(shí)在胸膜和胸膜下區(qū)域有膠原蛋白沉積，同時(shí)肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化標(biāo)志物過(guò)表達(dá)，這些組織表現(xiàn)與炎癥過(guò)程有關(guān)；在該動(dòng)物模型中，抑制局部胸膜IL-1β及胱天蛋白酶的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白沉積減少，故抑制IL-1β表達(dá)可能成為治療肺纖維化的新靶點(diǎn)[30]。此外，IL-1β與嚴(yán)重的進(jìn)展性肺纖維化有關(guān)，表現(xiàn)為肌成纖維細(xì)胞、成纖維細(xì)胞病灶的形成及大量膠原和纖維連接蛋白的胞外沉積[31]。文獻(xiàn)報(bào)道，活化的NF-κB增加了TNF-α的形成，而TNF-α 基因啟動(dòng)子本身含有NF-κB位點(diǎn)，即TNF-α能夠刺激NF-κB的活化，故兩者相互促進(jìn)。NF-κB通過(guò)TNF-α信號(hào)通路介導(dǎo)了博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化發(fā)展，而抑制NF-κB表達(dá)的同時(shí)TNF-α表達(dá)減少，肺纖維化程度也減輕[32]。在各種細(xì)胞因子中，TGF-β1致纖維化的作用已得到證實(shí)，其主要通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和成纖維細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化，以及協(xié)同其他各種細(xì)胞因子發(fā)揮致肺纖維化的作用。另有研究表明，TLR4誘導(dǎo)的NF-κB的激活，促進(jìn)了TGF-β1的分泌，并通過(guò)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和增殖促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展[20]?？梢?jiàn)，與TLR4信號(hào)通路相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子均可促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生。

4 小 結(jié)

作為肺組織重要的膜識(shí)別受體，TLR4在肺纖維化的發(fā)展過(guò)程中有重要作用。目前，有關(guān)TLR4及其信號(hào)通路對(duì)炎癥和纖維化影響作用的觀點(diǎn)并不一致?；赥LR4復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，TLR4的激活或抑制對(duì)不同類型的組織損傷、炎癥和纖維化產(chǎn)生的影響也不同。關(guān)于TLR4在腎臟和肝臟纖維化等疾病中的作用機(jī)制已有較為成熟的研究，而TLR4作用于肺纖維化的具體機(jī)制的研究較少。隨著研究的不斷深入，未來(lái)TLR4與肺纖維化之間的關(guān)系將更加明確，干預(yù)TLR4的表達(dá)可能會(huì)成為肺纖維化治療的新靶點(diǎn)。