高金源，劉丹，陳建，秦義嫻，郎洪武

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

兔病毒性出血癥(Rabbit Haemorrhagic Disease, RHD)是由兔出血癥病毒(RHDV)引起的一種家兔高發(fā)病率、高死亡率的傳染性疫病，臨床多表現(xiàn)為發(fā)熱、精神不振、突然死亡，疫苗接種仍是預(yù)防RHD的最有效方法[1-2]。

在《中國(guó)獸藥典》2015年版三部中[3]，RHD滅活疫苗效力檢驗(yàn)采用經(jīng)典的家兔免疫攻毒方法來(lái)評(píng)價(jià)家兔攻毒后的保護(hù)效果。由于該方法需要配備負(fù)壓動(dòng)物舍，攻毒后也需要較長(zhǎng)觀察時(shí)間,存在試驗(yàn)成本高、周期較長(zhǎng)、操作繁瑣等缺點(diǎn)。本試驗(yàn)在制備了HI試驗(yàn)用RHDV 血凝(HA)抗原、陽(yáng)性血清、陰性血清的基礎(chǔ)上，確認(rèn)了免疫攻毒保護(hù)與免疫血清HI抗體效價(jià)之間的平行關(guān)系，并采用免疫血清HI效價(jià)測(cè)定方法進(jìn)行了RHD滅活疫苗的效力檢驗(yàn)應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 家兔 RHD血清抗體陰性(HI價(jià)<1∶8)的3月齡以上健康新西蘭兔，由濟(jì)源市陽(yáng)光兔業(yè)科技有限公司、濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心、四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專(zhuān)委會(huì)養(yǎng)殖場(chǎng)購(gòu)入。

1.1.2 RHDV AV34株肝臟組織毒，由齊魯動(dòng)物保健品有限公司(毒價(jià)為105.0LD50/mL)、華派生物工程集團(tuán)有限公司(毒價(jià)為105.1LD50/mL)、山東綠都生物科技有限公司(毒價(jià)為106.1LD50/mL)及中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒室(毒價(jià)為105.5LD50/mL)提供。

1.1.3 1%新鮮人“O”型紅細(xì)胞 由齊魯動(dòng)物保健品有限公司、華派生物工程集團(tuán)有限公司提供。

1.1.4 RHD滅活疫苗 規(guī)格為20 mL(頭份)/瓶，由齊魯動(dòng)物保健品有限公司(9批，批號(hào)分別為1702007、1702008、1704019、1704020、1706023、1706024、1707029、1708037、1708038)、華派生物工程集團(tuán)有限公司(8批，批號(hào)分別為2017001～2017008)、山東綠都生物科技有限公司(2批，批號(hào)分別為1803003、1804004)提供。

1.1.5 RHDV HA抗原 (HA價(jià)為1∶128)、RHD陽(yáng)性血清(HI價(jià)為1∶128)、RHD陰性血清(HI價(jià)<1∶8)、PBS(0.01 mol/L，pH7.2)、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，均由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒室提供。

1.2 方法

1.2.1 RHDV HA抗原制備 用RHDV南京株接種3月齡以上的健康易感家兔，無(wú)菌采集接種后24～96 h瀕死或剛死兔的有典型病理變化的肝臟；將肝臟組織用適量的PBS進(jìn)行搗碎，6000 g離心15 min，取上清液，制備成8倍稀釋的病毒懸液；加入β-丙內(nèi)酯溶液，使其含量為1/4000，混合均勻，放入4 ℃冰箱作用24 h，再放入37 ℃水浴水解2 h，放入4 ℃冰箱保存。同時(shí)進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)[2]和HA效價(jià)測(cè)定[1]。無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，滅活病毒HA價(jià)應(yīng)不低于1∶64。

1.2.2 RHD陽(yáng)性血清制備 采用常規(guī)微量HI試驗(yàn)法[1]，選取RHD抗體陰性(HI價(jià)<1∶8)的3月齡以上的健康家兔，先用商品化的RHD滅活疫苗進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，再用RHDV強(qiáng)毒加強(qiáng)免疫2次，中間間隔14 d，最后一次免疫后21 d，無(wú)菌采集血液，提取血清，混合后進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)和HI效價(jià)測(cè)定。無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，HI價(jià)應(yīng)不低于1∶128。

1.2.3 RHD陰性血清制備 采用常規(guī)微量HI試驗(yàn)法，選取RHD抗體陰性(HI價(jià)<1∶8)的3月齡以上的健康家兔，無(wú)菌采集血液，提取血清，混合后進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)和HI效價(jià)測(cè)定。無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，HI價(jià)應(yīng)小于1∶8。

1.2.4 疫苗免疫攻毒與血清HI效價(jià)的平行關(guān)系 采用常規(guī)微量HI試驗(yàn)法，選取RHD抗體陰性(HI價(jià)<1∶8)的3月齡以上的健康家兔35只。將RHD滅活疫苗搖勻后進(jìn)行家兔免疫，取1/2 頭份、1/4頭份、1/8頭份疫苗各皮下注射家兔10只，飼養(yǎng)觀察14 d。同時(shí)設(shè)立非免疫攻毒對(duì)照家兔5只。家兔免疫14 d后，對(duì)所有試驗(yàn)家兔進(jìn)行采血，每只家兔采血4.0 mL，提取血清，56 ℃滅活30 min，用于血清HI價(jià)測(cè)定。家兔采血后，對(duì)所有家兔進(jìn)行攻毒，每只家兔皮下注射RHDV 1 mL(含1000 LD50/mL)。每日觀察家兔健康情況，飼養(yǎng)觀察7 d，記錄家兔發(fā)病死亡情況；同時(shí)，無(wú)菌采集免疫攻毒家兔肝臟組織，研磨并稀釋4倍后，3000 g離心15 min后，取上清液測(cè)定血凝情況，以監(jiān)測(cè)RHDV兔體內(nèi)復(fù)制增殖情況。攻毒對(duì)照家兔應(yīng)至少死亡4只，試驗(yàn)成立。統(tǒng)計(jì)不同HI效價(jià)的攻毒保護(hù)情況，當(dāng)免疫攻毒保護(hù)家兔4倍肝臟組織液無(wú)血凝性時(shí)，以免疫攻毒100%保護(hù)家兔的血清最低HI效價(jià)作為免疫攻毒保護(hù)判定的最低標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 疫苗效力檢驗(yàn)替代方法的應(yīng)用 與3家企業(yè)19批RHD滅活疫苗現(xiàn)行免疫攻毒法同步進(jìn)行，攻毒前無(wú)菌采集免疫家兔血液，提取血清，進(jìn)行HI效價(jià)測(cè)定，根據(jù)1.2.4中確定的免疫攻毒保護(hù)判定標(biāo)準(zhǔn)，比較兩種方法的效力檢驗(yàn)結(jié)果，評(píng)價(jià)HI效價(jià)測(cè)定方法替代現(xiàn)行免疫攻毒法的可行性。

2 結(jié)果與分析

2.1 RHDV HA抗原、陽(yáng)性血清、陰性血清鑒定 結(jié)果見(jiàn)表1。HI法的各組分鑒定結(jié)果均符合其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，可以滿(mǎn)足HI效價(jià)測(cè)定的需要。

2.2 疫苗免疫血清不同HI效價(jià)水平的免疫攻毒保護(hù)情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果 見(jiàn)表2。

表1 HI法組分鑒定結(jié)果Tab 1 Identification results of HI component

“-”：檢測(cè)結(jié)果為陰性； “/”：不涉及

“-”： negative； “/”：unconcerned

表2 不同HI效價(jià)水平的攻毒保護(hù)結(jié)果Tab 2 Protection rate of rabbits with different HI titre levels

“-”代表保護(hù)；“HA-”代表無(wú)血凝

“-”protection; “HA-”no hemagglutination

攻毒對(duì)照家兔均發(fā)病死亡；免疫攻毒獲得保護(hù)家兔的4倍肝臟組織液均無(wú)血凝性，顯示無(wú)明顯病毒增殖情況；RHD滅活疫苗免疫家兔血清HI效價(jià)低于1∶16時(shí)(6份)，對(duì)應(yīng)的攻毒家兔均發(fā)病死亡；免疫家兔血清HI效價(jià)為1∶16時(shí)(8份)，對(duì)應(yīng)攻毒家兔5只獲得保護(hù)，而另3只均發(fā)病死亡；免疫家兔血清HI效價(jià)不低于1∶32時(shí)(21份)，對(duì)應(yīng)的攻毒家兔均獲得保護(hù)。

2.3 疫苗效力檢驗(yàn)替代方法的應(yīng)用 疫苗效力檢驗(yàn)現(xiàn)行方法(免疫攻毒法)與替代方法(HI效價(jià)測(cè)定方法)的應(yīng)用結(jié)果比較見(jiàn)表3。

表3 2種效力檢驗(yàn)方法應(yīng)用結(jié)果比較Tab 3 Comparison of the two methods applicated in potency test

所有對(duì)照組家兔血清HI效價(jià)不高于1∶8，且在攻毒后均死亡；在19批RHD滅活疫苗效力檢驗(yàn)的免疫攻毒方法與血清HI效價(jià)測(cè)定方法的比較應(yīng)用試驗(yàn)中，替代方法(HI效價(jià)測(cè)定方法)與現(xiàn)行方法(免疫攻毒法)檢驗(yàn)結(jié)果符合率為100%。

3 結(jié) 論

RHD于1984年由我國(guó)首次報(bào)道[4]，隨后確認(rèn)該疫病由杯狀病毒科杯狀病毒屬的RHDV引起。由于RHDV只能在兔體內(nèi)增殖，不能在任何組織細(xì)胞上有效增殖[4]，因此，尚未建立在細(xì)胞上進(jìn)行抗體定量檢測(cè)方法。雖然發(fā)現(xiàn)存在無(wú)血凝性的毒株[5]，但可以利用具有血凝性的RHDV毒株，通過(guò)血清HI效價(jià)的測(cè)定對(duì)家兔血清抗體進(jìn)行定量[1,6-7]。同時(shí)，RHD滅活疫苗免疫血清HI效價(jià)與RHDV的攻毒保護(hù)密切相關(guān)，但免疫攻毒臨床保護(hù)的HI效價(jià)臨界值缺少明確一致的數(shù)據(jù)[8-10]。目前，RHD滅活疫苗效力檢驗(yàn)的國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)方法均為免疫攻毒法[3,11]，雖然攻毒劑量要求不同，但均是通過(guò)觀察免疫家兔攻毒后是否獲得臨床保護(hù)來(lái)判定免疫效果。為了采用免疫血清HI效價(jià)測(cè)定方法替代現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)方法，按照《中國(guó)獸藥典》2015年版三部的攻毒劑量標(biāo)準(zhǔn)，明確了攻毒臨床保護(hù)的免疫血清HI效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)不低于1∶32。同時(shí)，與19批RHD滅活疫苗效力檢驗(yàn)免疫攻毒的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比對(duì)的應(yīng)用表明，標(biāo)準(zhǔn)方法中免疫攻毒臨床保護(hù)的家兔，其免疫血清HI效價(jià)均未低于1∶32。可見(jiàn)，只要免疫血清HI效價(jià)不低于1∶32，就能夠確保免疫家兔攻毒后可獲得臨床保護(hù)，用免疫兔血清HI效價(jià)均不低于1∶32作為RHD滅活疫苗效力檢驗(yàn)中判定攻毒臨床保護(hù)的標(biāo)準(zhǔn)確實(shí)可行。

在《中國(guó)獸藥典》2015年版三部中，RHD滅活疫苗的安全檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)均采用HI效價(jià)測(cè)定方法篩選檢驗(yàn)用敏感家兔，生產(chǎn)企業(yè)熟悉該檢測(cè)方法。同時(shí)，通過(guò)免疫家兔血清HI效價(jià)來(lái)評(píng)價(jià)疫苗免疫效果，疫苗生產(chǎn)企業(yè)可以避免使用負(fù)壓動(dòng)物舍，縮短檢驗(yàn)時(shí)間，也可節(jié)約檢驗(yàn)成本。該研究也可為下一版《中國(guó)獸藥典》的修訂提供數(shù)據(jù)。