李春玲，丁亞蓮，謝文靜，牛春，張萍

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750101)

反式-4-羥基-L-脯氨酸(trans-4-hydroxy-L-proline, Hyp)，簡稱羥脯氨酸，是一種稀有亞氨基酸，在醫(yī)藥保健、材料化工、食品營養(yǎng)和護(hù)膚美容等行業(yè)都具有廣泛的應(yīng)用[1-3]。值得關(guān)注的是，Hyp是膠原蛋白的組成成分，也是肝和膽囊的構(gòu)成成分, 具有多種生理功能和生物活性，對維持動物正常生理代謝、提高體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)利用效率起著重要作用[4-6]。目前，Hyp的生產(chǎn)方法有三種，即生物組織提取法、化學(xué)合成法和微生物合成法。生物組織提取法是利用動植物組織作為原料，通過系列化學(xué)方法回收得到Hyp[7]。目前，該方法是國內(nèi)生產(chǎn)Hyp的主要方法，但存在生產(chǎn)和純化步驟多、雜酸含量高、產(chǎn)率低、成本高、環(huán)境污染大、廢水廢渣難處理等諸多問題[5]。化學(xué)合成法多以(S)-芐氧甲基環(huán)氧乙烷為原料，通過系列化學(xué)反應(yīng)，最終生成Hyp。該方法存在原材料成本高，生產(chǎn)過程中會使用有毒性物質(zhì)等問題，實際生產(chǎn)已經(jīng)棄用[8]。微生物合成法即微生物發(fā)酵法，是通過微生物細(xì)胞發(fā)酵表達(dá)反式-4-脯氨酸羥化酶(trans-4-proline hydroxylase)，將游離的L-脯氨酸(L(-)-proline，)轉(zhuǎn)化為Hyp的生產(chǎn)方法。與前兩種方法相比，微生物發(fā)酵法具有反應(yīng)所需能耗低、專一性極強、無副產(chǎn)物、原材料來源廣泛、不使用或很少使用有毒物質(zhì)、環(huán)境污染小等優(yōu)點[8-10]。

采用生物組織提取法生產(chǎn)Hyp的方法已經(jīng)不符合我國日益嚴(yán)峻的環(huán)保形式，而且有限的動植物資源也嚴(yán)重制約了本行業(yè)的發(fā)展?；瘜W(xué)合成法工藝復(fù)雜，成本較高，且環(huán)境污染嚴(yán)重。因此，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)Hyp將成為未來發(fā)展的必然趨勢。但是，國內(nèi)有關(guān)Hyp的微生物發(fā)酵法研究起步較晚，僅見盛花開[11]、袁春偉[12]、劉合棟[13]等關(guān)于基因工程菌株構(gòu)建、初級發(fā)酵條件優(yōu)化的研究，鮮見工業(yè)化生產(chǎn)目的菌株篩選相關(guān)報道。鑒于此，實驗以工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用為目的，對引進(jìn)的8株產(chǎn)Hyp菌株的生長特性、發(fā)酵效率進(jìn)行比較分析，以期篩選出優(yōu)良菌株，為實現(xiàn)Hyp微生物發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 出發(fā)菌株為8株含有重組質(zhì)粒的產(chǎn)Hyp大腸桿菌，由寧夏泰瑞制藥股份有限公司技術(shù)中心引進(jìn)保存。胰蛋白胨、酵母提取物購自O(shè)xoid公司，瓊脂粉購自Sigma公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

活化平板(LB固體)：包含胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉，pH7.0～7.2，瓊脂粉?？剐云桨?LB固體)：包含胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂粉、抗性RL，pH7.0～7.2。抗性培養(yǎng)基(LB液體)：包含胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂粉、滅菌冷卻后添加抗性RL，pH7.0～7.2。非抗性培養(yǎng)基(LB液體)：包含胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂粉,pH7.0～7.2。Hyp搖瓶培養(yǎng)基(MCG)：包含葡萄糖、甘油、尿素、玉米漿、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、VB1、抗性RL、L-脯氨酸，pH 7.4。發(fā)酵罐(50 L)培養(yǎng)基：葡萄糖、甘油、尿素、玉米漿、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、VB1、抗性RL、L-脯氨酸，pH7.4。

恒溫大幅振蕩搖床(HQL150C，武漢科學(xué)儀器廠)、恒溫培養(yǎng)箱(LHP160，江蘇杰瑞爾電器有限公司)、分光光度計(BECKMANDU-600)、高效液相色譜系統(tǒng)(Waters)。

1.2 方法

1.3.1 菌種活化 將冷藏于-80 ℃冰箱的菌種取出，室溫融化，接種環(huán)劃線接種于活化平板上，30 ℃培養(yǎng)過夜，用活化后的菌種制備斜面種子，保存待用。

1.3.2 菌株重組質(zhì)粒穩(wěn)定性測定 參照盛花開等的方法[11]，活化后的菌種接至裝30 mL抗性培養(yǎng)基的三角瓶(規(guī)格250 mL)中，30 ℃、220 r/min、搖床培養(yǎng)20 h后轉(zhuǎn)接非抗性培養(yǎng)基，連續(xù)轉(zhuǎn)接6次，取菌液梯度稀釋至10-6，涂布至活化平板，然后挑單菌落接種至抗性平板，統(tǒng)計質(zhì)粒留存率。質(zhì)粒留存率=生長菌落數(shù)/點接菌落數(shù)×100%。

1.3.3 種子制備 活化后的菌種挑取單菌落，接種至裝有30 mL抗性培養(yǎng)基的三角瓶(規(guī)格250 mL)中，30 ℃、220 r/min、搖床培養(yǎng)10 h。

1.3.4 菌株生長曲線測定 取種子液3.6 mL接種于裝有60 mL抗性培養(yǎng)基的三角瓶(規(guī)格500 mL)中，間隔2 h取發(fā)酵液，連續(xù)取樣12次，以ddH2O為對照，測定樣液在600 nm吸光值，作生長曲線。

1.3.5 菌株全細(xì)胞酶活測定 參照劉合棟等的方法[13]，取發(fā)酵液1.5 mL，12000 r/min離心2 min；棄去上清液，回收菌體，加入500 μL酶反應(yīng)緩沖液(MES 240 mmol/L、L-脯氨酸20 mmol/L、α-酮戊二酸40 mmol/L、硫酸亞鐵4 mmol/L、Vc 8 mmol/L)重懸菌體細(xì)胞，混勻，30 ℃ 220 r/min、搖床培養(yǎng)15 min后，沸水浴2 min，終止酶反應(yīng)，測定Hyp濃度，分析細(xì)胞全酶活性。定義1個單位酶活為1 min將1 nmol/L L-脯氨酸完全轉(zhuǎn)化為反式-4-羥脯氨酸的酶量，單位為U。全細(xì)胞酶活是每mg干菌體的酶活，單位為U/mg。

1.3.6 Hyp濃度測定 參照盛花開等的方法[11]，取發(fā)酵時間24～48 h的發(fā)酵液，每隔4 h取樣1次，利用高效液相色譜法測定Hyp濃度。液相條件：C18柱(200 mm×4.6 mm)，流動相為乙腈∶水=5∶95，流速為1.0 mL/min，柱溫為室溫。

2 結(jié) 果

2.1 菌株重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 8株菌株經(jīng)活化后，對其菌株重組質(zhì)粒穩(wěn)定性進(jìn)行測定分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)編號Hyp-Y1801、Hyp-Y1805、Hyp-Y1808的菌株重組質(zhì)粒的留存率均超過95%，重組質(zhì)粒穩(wěn)定性較好，作為出發(fā)菌株(表1)。

表1 菌株重組質(zhì)粒穩(wěn)定性Tab 1 Stability of recombinant plasmid in strains

2.2 菌株生長曲線分析 對Hyp-Y1801、Hyp-Y1805、Hyp-Y1808菌株的發(fā)酵生長曲線進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，三菌株均在發(fā)酵4 h時進(jìn)入對數(shù)生長期，在2 h

后進(jìn)入平穩(wěn)期，對數(shù)期約為8 h(圖1)。種子培養(yǎng)時間確定為10 h。

圖1 菌株生長曲線分析Fig 1 Strain growth curve analysis

2.3 菌株全細(xì)胞酶活分析 取Hyp-Y1801、Hyp-Y1805、Hyp-Y1808平穩(wěn)期(12 h)發(fā)酵液，對菌株全細(xì)胞酶活進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Hyp-Y1801、Hyp-Y1805、Hyp-Y1808全細(xì)胞酶活分別為0.076、0.037、0.071 U/mg，其中Hyp-Y1801、Hyp-Y1808酶活較高。

2.4 菌株發(fā)酵效率分析 以Hyp-Y1801、Hyp-Y1808為生產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵小試，每隔4 h取樣1次，測定發(fā)酵液中Hyp的濃度，以此確定菌株的生產(chǎn)效率。表2結(jié)果表明，隨著時間延長Hyp的濃度逐漸升高，發(fā)酵44 h時Hyp濃度達(dá)到最高，分別為50.4 g/L、47.5 g/L。

表2 菌株發(fā)酵效率Tab 2 Fermentation efficiency of strains

3 分析與討論

目前，國內(nèi)主要依靠生物組織提取生產(chǎn)Hyp，該方法存在最主要的問題是產(chǎn)物的得率很低，僅為4%～7%，而且產(chǎn)生大量排放物，帶來巨大的環(huán)保風(fēng)險，這些問題大大限制了該技術(shù)規(guī)?；瘧?yīng)用[6]，導(dǎo)致國內(nèi)Hyp生產(chǎn)發(fā)展十分緩慢，生產(chǎn)規(guī)模較小，產(chǎn)量極其有限。但是，隨著Hyp的廣泛應(yīng)用，市場對其需求急劇增加。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)技術(shù)具有成本低、效率高等優(yōu)勢，采用該技術(shù)開展Hyp規(guī)模化、高效化生產(chǎn)，是未來發(fā)展的必然。目前，國內(nèi)尚未見微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)Hyp的報道。

Hyp生產(chǎn)的發(fā)酵菌株主要包括細(xì)菌、霉菌以及鏈霉菌等，其中對大腸桿菌(細(xì)菌)發(fā)酵菌株研究較多，應(yīng)用較為成熟[8]。本研究引進(jìn)了8株產(chǎn)Hyp大腸桿菌菌株，并對其發(fā)酵生產(chǎn)性能進(jìn)行系統(tǒng)分析。引進(jìn)的產(chǎn)Hyp大腸桿菌為基因工程菌株，菌體所含的重組質(zhì)粒負(fù)責(zé)編碼Hyp合成的關(guān)鍵酶。重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性是保障Hyp發(fā)酵生產(chǎn)的根本。本研究發(fā)現(xiàn)， Hyp-Y1801、Hyp-Y1808菌株重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性很好，留存率均超過了95%，可以有效保障Hyp發(fā)酵生產(chǎn)的順利進(jìn)行。在此基礎(chǔ)上，本研究對菌株的生長特性、全細(xì)胞酶活和生產(chǎn)效率進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)Hyp-Y1801、Hyp-Y1808發(fā)酵4 h時，進(jìn)入對數(shù)生長期，在12 h后進(jìn)入平穩(wěn)期，對數(shù)期約為8 h，這與盛花開[11]、劉合棟[13]等的研究報道較一致。Hyp-Y1801菌株的全細(xì)胞酶活較高，且發(fā)酵效價達(dá)到了50.4 g/L，較袁春偉[12]、劉合棟[13]等報道的高18.6%，較Shibasaki等[8]報道的高22.9%，具有較好的實際生產(chǎn)應(yīng)用潛力。有關(guān)Hyp-Y1801中試生產(chǎn)試驗正在進(jìn)行之中，菌株的優(yōu)良特性在規(guī)模化生產(chǎn)中的實際表現(xiàn)還有待進(jìn)一步驗證。