李 濤，蔣 偉綜述，季國(guó)忠，馮振卿審校

作者單位：210011南京，南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化醫(yī)學(xué)中心/腫瘤個(gè)體化醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心[李 濤(醫(yī)學(xué)碩士研究生)、蔣 偉、季國(guó)忠]；211166南京，南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病(馮振卿)

0 引 言

近年來(lái)，以嵌合抗原受體T細(xì)胞療法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）為代表的腫瘤免疫治療取得了重大突破。CAR由能特異性識(shí)別腫瘤抗原的單鏈抗體序列（single-chain variable fragment，scFv）、胞內(nèi)活化信號(hào)分子（通常為CD3ζ）和共刺激信號(hào)分子（通常為CD28、CD134或CD137等）組成。經(jīng)過(guò)數(shù)年研究，CAR結(jié)構(gòu)經(jīng)歷了五代發(fā)展。第一代CAR的胞內(nèi)區(qū)僅含有CD3ζ，形成scFv-CD3ζ結(jié)構(gòu)。由于缺乏共刺激信號(hào)，CAR-T細(xì)胞進(jìn)入機(jī)體后會(huì)很快凋亡，抗腫瘤活性受到很大限制［1］。第二代CAR在細(xì)胞內(nèi)區(qū)增加一個(gè)免疫共刺激信號(hào)分子CD28，形成scFv-CD28-CD3ζ結(jié)構(gòu)。與第一代相比，第二代CAR-T細(xì)胞的抗原特異性不變，增殖和細(xì)胞因子分泌能力提高［2］。第三代CAR則是在細(xì)胞內(nèi)區(qū)再增加一個(gè)免疫共刺激信號(hào)分子CD134或 CD137，形成 scFv-CD28-CD134-CD3ζ或scFv-CD28-CD137-CD3ζ結(jié)構(gòu)。雖然有研究認(rèn)為，第三代CAR比第二代更好，但目前這方面的證據(jù)仍不充分。第四代CAR（TRUCKs）除了嵌合抗原受體基因外，增加了具有免疫調(diào)節(jié)等功能的基因，從而提高CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性［3］。第五代CAR為通用型，有望降低制備成本、簡(jiǎn)化制備程序［4］。

CAR-T細(xì)胞療法特別是CD19 CAR-T細(xì)胞在治療惡性血液系統(tǒng)疾病上取得了良好的臨床療效。2014年凱特琳癌癥中心進(jìn)行的CD19 CAR-T細(xì)胞靶向治療B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的臨床研究中，16例患者中有14例達(dá)到完全緩解（CR），完全緩解率達(dá)到88%［5］。2017年，美國(guó)諾華公司生產(chǎn)的針對(duì)B細(xì)胞前體急性淋巴性白血病的CAR-T細(xì)胞治療藥物Kymriah已通過(guò)FDA批準(zhǔn)上市。截至2018年7月11日，已有92項(xiàng)CD19 CAR-T細(xì)胞靶向治療血液病的臨床實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行，其中49項(xiàng)在中國(guó)。

目前針對(duì)CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的臨床研究也在陸續(xù)開(kāi)展，如抗HER2 CAR-T細(xì)胞治療乳腺癌［6］，抗GPC3 CAR-T細(xì)胞治療肝癌［7］等等。但由于實(shí)體腫瘤微環(huán)境比惡性血液病復(fù)雜，CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體腫瘤仍存在許多挑戰(zhàn)，如CAR-T細(xì)胞低浸潤(rùn)性，腫瘤免疫抑制性微環(huán)境，脫靶效應(yīng)等［8］。在實(shí)體腫瘤中，CAR-T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞首先要選擇一個(gè)最佳的腫瘤抗原作為靶標(biāo)，然后正確趨化浸潤(rùn)至腫瘤組織，克服低氧、低pH、低營(yíng)養(yǎng)等惡劣因素以及腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫抑制細(xì)胞及因子的影響，最后在其表達(dá)的CAR的“引導(dǎo)”下正確識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、裂解性殺傷等方式殺傷腫瘤細(xì)胞［9］。為了克服CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體腫瘤的局限，研究者們對(duì)CAR結(jié)構(gòu)進(jìn)行改進(jìn)，以期通過(guò)優(yōu)化CAR結(jié)構(gòu)提高CAR-T細(xì)胞的療效。

1 提高CAR-T細(xì)胞靶向性策略

CAR-T細(xì)胞免疫療法最理想的靶抗原應(yīng)僅在腫瘤組織高表達(dá)，在正常組織中不表達(dá)或呈極低表達(dá)狀態(tài)［10］。目前應(yīng)用于CAR-T療法的實(shí)體腫瘤抗原多為腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigen，TAA），這種抗原不僅表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，在正常細(xì)胞也有一定程度的表達(dá)。所以靶向此類(lèi)抗原的CAR-T細(xì)胞在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，往往會(huì)引發(fā)針對(duì)正常組織的on-target off tumor毒性，即“脫靶效應(yīng)”［11］。

1.1 選擇恰當(dāng)?shù)哪[瘤相關(guān)抗原 多項(xiàng)研究已證實(shí)，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican-3，GPC3）在肝癌細(xì)胞表面高表達(dá)而在正常細(xì)胞上表達(dá)受限［12］，是一個(gè)很有前途的肝癌CAR-T細(xì)胞治療靶點(diǎn)。GPC3 CART細(xì)胞對(duì)GPC3表達(dá)陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞展示出良好的活化和殺傷效果，而對(duì)不表達(dá)GPC3的肝癌細(xì)胞幾乎無(wú)特異性殺傷作用［7］。黏蛋白MUC1是一種跨膜蛋白［13］，Wilkie等［14］進(jìn)行的MUC1-CAR-T 細(xì)胞治療MUC1過(guò)表達(dá)的乳腺癌實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MUC1-CAR-T細(xì)胞可顯著抑制乳腺癌小鼠模型移植瘤的生長(zhǎng)。除了上述CAR-T細(xì)胞，靶向EGFR、CEA等腫瘤相關(guān)抗原的CAR-T細(xì)胞也已被證實(shí)具有良好的抑瘤效果［15-16］。

1.2 構(gòu)建雙特異性CAR 解決脫靶效應(yīng)另一個(gè)常用方法為構(gòu)建雙特異性CAR。目前雙特異性CAR存在如下3種設(shè)計(jì)方式。①靶向兩種TAA的兩個(gè)scFv分別與共刺激信號(hào)（CD28/CD137）和激活信號(hào)（CD3ζ）連接。其中一個(gè)scFv與CD28/CD137相連，另一個(gè)scFv與CD3ζ相連。這樣只表達(dá)一種靶抗原的正常細(xì)胞與CAR-T細(xì)胞結(jié)合后，僅能提供激活信號(hào)或共刺激信號(hào)，無(wú)法充分活化T細(xì)胞。只有當(dāng)CAR-T細(xì)胞遇到同時(shí)表達(dá)兩種抗原的腫瘤細(xì)胞，CD3ζ激活信號(hào)和共刺激信號(hào)方可共同作用導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞活化［17-18］。②兩個(gè)scFv串聯(lián)后與胞內(nèi)區(qū)信號(hào)連接［19-20］。③一種scFv同時(shí)識(shí)別2種TAA。近期，李宗海團(tuán)隊(duì)研發(fā)出一種靶向EGFRvIII/EGFR的新型雙特異性CAR-T細(xì)胞，這種CAR僅含有1個(gè)scFv片段，卻能特異性地識(shí)別和結(jié)合膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面的EGFRvIII和EGFR位點(diǎn)，而對(duì)正常細(xì)胞表面的EGFR沒(méi)有識(shí)別作用［21］。

2 促進(jìn)CAR-T細(xì)胞腫瘤趨化能力

CAR-T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞首先要正確趨化至腫瘤組織，這一過(guò)程主要依賴(lài)于腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞之間的“趨化因子-趨化因子受體（chemokine receptor，CCR）”識(shí)別作用。但往往腫瘤細(xì)胞趨化因子表達(dá)水平降低，或T細(xì)胞缺乏相應(yīng)的受體，導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞很難“找到”這些腫瘤細(xì)胞。

2.1 T細(xì)胞過(guò)表達(dá)趨化因子受體 Craddock［22］等人在GD2 CAR-T細(xì)胞治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤的研究中將CCL2受體CCR2b轉(zhuǎn)導(dǎo)至CAR-T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)共表達(dá)GD2 CAR和CCR2b的T細(xì)胞可快速遷移至腫瘤部位，且CCR2b的表達(dá)不影響GD2 CAR-T細(xì)胞的殺傷功 能 。Moon［23］等 也 證 實(shí) ，meso CAR-T 細(xì) 胞 表 達(dá)CCR2b后浸潤(rùn)能力提升12.5倍，meso CAR/CCR2b-T細(xì)胞和meso CAR-T細(xì)胞都可以抑制間皮素瘤生長(zhǎng)，但meso CAR/CCR2b-T細(xì)胞的抑瘤效果更加明顯。類(lèi)似的還有通過(guò)過(guò)表達(dá)CCR4促進(jìn)CD30 CAR-T細(xì)胞向霍奇金淋巴瘤細(xì)胞遷移［24］。

2.2 腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)趨化因子 除了T細(xì)胞過(guò)表達(dá)CCR，還有研究者試圖通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表達(dá)趨化因子來(lái)增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞遷移能力。Nishio［25］將趨化因子RANTES和細(xì)胞因子IL-15基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至溶瘤病毒Ad5△24內(nèi)，聯(lián)合應(yīng)用Ad5△24和GD2 CAR-T細(xì)胞殺傷神經(jīng)母細(xì)胞瘤。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，溶瘤病毒特異性識(shí)別并入侵至腫瘤細(xì)胞后，一方面通過(guò)介導(dǎo)caspase-3活化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，另一方面將其基因組整合至腫瘤細(xì)胞基因組中，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表達(dá)RANTES和分泌IL-15。而RANTES的受體CCR1、CCR3和CCR5在T細(xì)胞表面普遍表達(dá)，因此GD2 CAR-T細(xì)胞可以被大量招募至腫瘤組織內(nèi)，殺傷腫瘤細(xì)胞。同時(shí)腫瘤組織分泌的IL-15還可以促進(jìn)CAR-T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的增殖及活化。由于正常組織缺乏相應(yīng)的受體，Ad5△24不會(huì)殺傷正常組織細(xì)胞和T細(xì)胞。

3 促進(jìn)CAR-T細(xì)胞抗腫瘤活性策略

不同于惡性血液病“簡(jiǎn)單”的腫瘤微環(huán)境，實(shí)體腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫抑制性分子、細(xì)胞及T細(xì)胞自身的調(diào)節(jié)機(jī)制等因素都會(huì)對(duì)CAR-T細(xì)胞的活性和功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響。

3.1 CAR-T細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用免疫抑制劑 程序性細(xì)胞死亡蛋白（programmed cell death protein 1，PD-1）主要在激活的T細(xì)胞和B細(xì)胞中表達(dá)，與PD-L1結(jié)合后發(fā)揮抑制性免疫調(diào)控作用，避免因T/B細(xì)胞過(guò)度激活而引起的自身免疫病。一些腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1，導(dǎo)致PD-1/PD-L1信號(hào)通路被持續(xù)激活，抑制T細(xì)胞抗腫瘤免疫［26］。目前已研制出的PD-1/PDL1免疫檢查點(diǎn)抑制劑，如PD-1阻斷劑nivolumab、pembrolizumab，PD-L1 阻 斷 劑 atezolizumab、durvalumab、avelumab，在黑色素瘤［27］、非小細(xì)胞肺癌［28］等惡性腫瘤中顯示出良好的治療效果。在一項(xiàng)HER2 CAR-T細(xì)胞聯(lián)合PD-1抗體治療乳腺癌的研究中，抗HER2 CAR-T細(xì)胞聯(lián)用PD-1抗體殺傷腫瘤的效果強(qiáng)于單獨(dú)使用CAR-T細(xì)胞或PD-1抗體。PD-1抗體與T細(xì)胞上的PD-1結(jié)合，不僅阻斷了PD-1與腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的結(jié)合，抑制PD-1/PD-L1信號(hào)通路對(duì)T細(xì)胞的免疫負(fù)調(diào)控作用，還會(huì)減少骨髓源性抑制性細(xì)胞CD11b+Gr-1+細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)，間接減弱免疫抑制性因素對(duì)CAR-T細(xì)胞的影響［29］。

除了CAR-T細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑，還有學(xué)者設(shè)計(jì)構(gòu)建可分泌PD-L1單抗的CAR-T細(xì)胞［30］。CAR-T細(xì)胞到達(dá)腫瘤組織后，分泌的PDL1scFv可以與局部腫瘤細(xì)胞表面PD-L1結(jié)合，下調(diào)CAR-T細(xì)胞PD-1、LAG3、TIM3等免疫抑制分子的表達(dá)，并上調(diào)NK細(xì)胞的ACDD作用，即抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，多方面增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤作用。而近期有報(bào)道稱(chēng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑療法會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的免疫性心肌炎［31-32］，該并發(fā)癥目前沒(méi)有有效的治療手段，死亡率達(dá)46%［33］。這一不良反應(yīng)將限制免疫檢查點(diǎn)抑制劑在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用。

還有研究者利用腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)PD-L1反轉(zhuǎn)受體，將PD-1細(xì)胞外區(qū)序列與CD28分子的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)序列相連，并與CAR基因序列一起轉(zhuǎn)染至T細(xì)胞內(nèi)。這樣當(dāng)CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞上的PD-L1結(jié)合后，將通過(guò)其胞內(nèi)區(qū)的CD28分子產(chǎn)生活化信號(hào)而不是抑制性信號(hào)，并促進(jìn)IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)CAR-T細(xì)胞增殖、活化和腫瘤浸潤(rùn)［34］。

3.2 CAR-T細(xì)胞過(guò)表達(dá)細(xì)胞因子 CAR-T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境內(nèi)除了要克服Treg細(xì)胞和PD-L1等細(xì)胞或因子的免疫抑制性調(diào)控作用外，還需要外源性生長(zhǎng)因子維持生存。目前應(yīng)用較多的為細(xì)胞因子IL-2、IL-12和IL-15等。IL-2半衰期較短，且全身性使用高劑量IL-2容易引發(fā)毛細(xì)血管滲漏綜合征、器官衰竭等不良反應(yīng)［35］。因此，有研究者設(shè)計(jì)將這些細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至T細(xì)胞內(nèi)，即第四代CAR。IL-2基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至T細(xì)胞后，激活的T細(xì)胞會(huì)自行分泌IL-2，維持T細(xì)胞的增殖和活化［36］。IL-12基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至T細(xì)胞后，可以招募NK細(xì)胞、重新激活TIL細(xì)胞、抑制IL-10、TGF-β等免疫抑制性因子分泌，改善腫瘤微環(huán)境［37］。

3.3 調(diào)控T細(xì)胞活化或凋亡相關(guān)基因表達(dá) T細(xì)胞活化的第二信號(hào)DAG，在T細(xì)胞活化后會(huì)被甘油二酯激酶DGKα或DGKζ分解為磷脂酸［38］。若降低DGK表達(dá)，DAG將會(huì)被持續(xù)激活，促進(jìn)T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子分泌［39］。因此有學(xué)者設(shè)計(jì)了DGK敲除的DGK-/-CAR-T細(xì)胞，這種CAR-T細(xì)胞處于持續(xù)活化狀態(tài)，對(duì)TGFβ、PGE2、腺苷等生長(zhǎng)抑制因子敏感性降低，F(xiàn)asL、顆粒酶、穿孔素等腫瘤殺傷因子分泌增多［40］。

有研究表明，IL-2或IL-15缺乏所導(dǎo)致的T細(xì)胞凋亡往往伴隨抗凋亡基因Bcl-2低表達(dá)，而過(guò)表達(dá)Bcl-2基因可以逆轉(zhuǎn)生長(zhǎng)因子缺乏所引起的細(xì)胞死亡［41］。在缺乏外源性IL-2因子支持的情況下，T細(xì)胞的活性?xún)H能保持2周左右，而轉(zhuǎn)導(dǎo)了Bcl-2基因的T細(xì)胞2周后仍能保持65%的細(xì)胞活性［42］。因此通過(guò)過(guò)表達(dá)Bcl-2延緩CAR-T細(xì)胞死亡，有望成為解決CAR-T細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)生存的一條新途徑。

除了上述改進(jìn)手段，還有其他優(yōu)化策略也在研究中。如引用自殺基因控制CAR-T細(xì)胞的副作用［43］，使用抑制性CAR（iCAR）減輕CAR-T細(xì)胞的脫靶效應(yīng)［44］，采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方式減輕攜帶CAR基因的病毒對(duì)T細(xì)胞的毒性［45］等。

4 總結(jié)和展望

與手術(shù)治療、放療、化療等傳統(tǒng)的腫瘤治療手段相比，CAR-T細(xì)胞通過(guò)激活機(jī)體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞，展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和臨床應(yīng)用前景。但相對(duì)于它在治療白血病方面取得的成就，CAR-T細(xì)胞對(duì)實(shí)體瘤的治療遠(yuǎn)未達(dá)到人們所期望的效果。為了改善CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的效果，提高CAR-T細(xì)胞療法的安全性，研究者們針對(duì)CAR結(jié)構(gòu)開(kāi)展了一系列優(yōu)化和改進(jìn)設(shè)計(jì)，并取得了一定的效果。而CAR-T細(xì)胞療法涉及多方面因素，改善CAR結(jié)構(gòu)只是其中一方面。提高CAR-T細(xì)胞對(duì)實(shí)體瘤的療效還可以多角度進(jìn)行探索，如選擇腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）進(jìn)行 CAR-T細(xì)胞制備，CAR-T細(xì)胞療法與介入等其他療法聯(lián)用等?？傊?，隨著免疫技術(shù)的不斷發(fā)展，CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的臨床應(yīng)用是可以期待的。