王 娜，鄒大威

(1.首都醫(yī)科大學(xué)，北京100069； 2.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京100069)

糖尿病腎病是糖尿病的慢性微血管并發(fā)癥之一。在我國(guó)，30%～50%的糖尿病患者合并有腎病[1]。早期糖尿病腎病的特征是微量白蛋白尿,并逐步進(jìn)展至大量白蛋白尿，以及血清肌酐和尿素氮水平升高，最終進(jìn)展為腎衰竭。患者一旦發(fā)生腎衰竭則需要行透析或腎移植治療。臨床上，有效的干預(yù)措施能防止或延緩糖尿病腎病的進(jìn)展，因此研究糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制是極為必要的。研究表明，腎小球?yàn)V過(guò)屏障的組分之一——足細(xì)胞數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)或功能完整性破壞與蛋白尿的產(chǎn)生存在相關(guān)性[2]。因此，研究足細(xì)胞的損傷機(jī)制可能為糖尿病腎病的干預(yù)治療提供新思路?，F(xiàn)就糖尿病腎病中足細(xì)胞損傷的機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 氧化應(yīng)激

早在2001年，Brownlee[3]就提出氧化應(yīng)激是糖尿病及其并發(fā)癥的共同病機(jī)。在高糖刺激下，細(xì)胞會(huì)生成大量晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)，并在細(xì)胞內(nèi)部不斷聚積。在AGEs產(chǎn)生過(guò)程中，線粒體還會(huì)釋放大量的活性氧類(reactive oxygen species,ROS)，過(guò)量的ROS打破機(jī)體氧化體系與抗氧化體系的平衡，損傷細(xì)胞。氧化應(yīng)激可直接導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡，或通過(guò)重排肌動(dòng)蛋白、增加內(nèi)皮素-1合成、改變微血管通透性最終導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。

1.1氧化應(yīng)激直接導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡 細(xì)胞色素C從線粒體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟[4]。ROS可通過(guò)氧化心磷脂，降低心磷脂對(duì)細(xì)胞色素C的親和力，促進(jìn)細(xì)胞色素C與線粒體內(nèi)膜分離，并釋放至細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后與細(xì)胞質(zhì)中的凋亡激活因子-1結(jié)合，促進(jìn)凋亡激活因子-1寡聚化。凋亡激活因子-1可募集caspase-9并形成凋亡小體，最終導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡。抑制線粒體氧化損傷和細(xì)胞色素C釋放，消除線粒體ROS，可阻止細(xì)胞凋亡途徑的激活和足細(xì)胞損傷[5]。慢性腎病常伴有高脂血癥，ROS過(guò)量生成與脂質(zhì)代謝紊亂共同參與了糖尿病腎病腎功能損害的進(jìn)程[6]。棕櫚酸可促進(jìn)線粒體產(chǎn)生ROS，過(guò)量的ROS通過(guò)線粒體凋亡途徑參與氧化應(yīng)激導(dǎo)致的凋亡。若用線粒體抗氧化劑預(yù)處理足細(xì)胞，而后再加入棕櫚酸，線粒體積累的ROS以及足細(xì)胞凋亡顯著降低[7]。

1.2氧化應(yīng)激間接導(dǎo)致足細(xì)胞損傷 ROS是足細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白絲分布和凋亡的重要介質(zhì)[8]。肌動(dòng)蛋白絲是細(xì)胞骨架的主要成分，用于維持足細(xì)胞足突的完整性。ROS水平升高誘導(dǎo)足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白重排，足突融合，最終導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能障礙，這可能是脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中形成的脂質(zhì)自由基導(dǎo)致的[9]。纖溶酶原誘導(dǎo)的線粒體ROS可通過(guò)促進(jìn)足細(xì)胞合成內(nèi)皮素-1，誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷。使用線粒體ROS選擇性抑制劑可阻止纖溶酶原對(duì)內(nèi)皮素-1合成的促進(jìn)作用[10]。當(dāng)氧化應(yīng)激導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生的ROS增加時(shí)，自由基會(huì)誘發(fā)DNA鏈斷裂，從而激活核中的DNA修復(fù)酶，導(dǎo)致3-磷酸甘油醛脫氫酶的活性受到抑制，AGEs受體表達(dá)增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷[11]。AGEs可通過(guò)提高血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)而導(dǎo)致蛋白尿。在體外足細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，高糖條件下血管緊張素Ⅱ的表達(dá)增加，血管緊張素Ⅱ通過(guò)作用于血管緊張素Ⅱ受體，刺激內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)[12]。AGEs可導(dǎo)致血管緊張素Ⅱ受體表達(dá)上調(diào)[13]，使細(xì)胞能夠更好響應(yīng)血管緊張素Ⅱ的刺激，提高內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)量。一氧化氮合酶缺陷會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平升高[14]?？赡艿臋C(jī)制是一氧化氮合酶缺陷導(dǎo)致具有舒張血管效應(yīng)的NO合成不足，使得血管不能有效對(duì)抗血管緊張素Ⅱ的作用，導(dǎo)致內(nèi)皮生長(zhǎng)因子途徑中的負(fù)調(diào)節(jié)活性喪失，氧化應(yīng)激水平升高。

2 微RNA

微RNA(microRNA,miRNA)是一類在細(xì)胞內(nèi)普遍存在的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度為21～24 bp，可通過(guò)阻滯蛋白質(zhì)翻譯或誘導(dǎo)信使RNA裂解等發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的作用。miRNA并非通過(guò)單一途徑影響特定靶基因，而是可以改變大量靶基因的表達(dá)，影響疾病進(jìn)程。與糖尿病腎病足細(xì)胞損傷相關(guān)的miRNA可分為兩類，一部分miRNA的表達(dá)量隨糖尿病腎病的發(fā)展而下降，提示這部分miRNA的高表達(dá)具有腎臟保護(hù)作用；而另一部分miRNA在高糖條件下表達(dá)上調(diào)，加重腎臟損害，提示其高表達(dá)具有損傷腎臟的作用。高糖條件下表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的miRNA主要包括miR-125、miR-30、miR-346、miR-34c，表達(dá)上調(diào)加重腎損害的miRNA包括miR-195、miR-21、miR-155、miR-27a。

2.1miRNA表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致足細(xì)胞損傷 在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型中，miR-125表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與負(fù)性調(diào)控p38促分裂原活化的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38MAPK)及p38MAPK磷酸化蛋白表達(dá),進(jìn)而激活SIRT1-P53通路有關(guān)；同時(shí)，高表達(dá)miR-125能有效抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與阻斷SIRT1-P53通路有關(guān)[15]。以上研究證實(shí)了miR-125在糖尿病足細(xì)胞損傷中的調(diào)控作用。

miR-30家族對(duì)足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，其表達(dá)量的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。高糖條件下，miR-30d啟動(dòng)子因受轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (transforming growth factor β，TGF-β)的負(fù)性調(diào)控，導(dǎo)致miR-30家族的表達(dá)顯著下調(diào)[16]。高表達(dá)miR-30a的人足細(xì)胞可抵抗損傷因素的刺激[17]，其是通過(guò)抑制足細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)實(shí)現(xiàn)的[18]。

在高糖條件下,同樣能夠抑制EMT的miR-346的表達(dá)量也明顯降低。miR-346對(duì)EMT的抑制作用是通過(guò)抑制糖原合成酶激酶-3的合成實(shí)現(xiàn)的[19]。足細(xì)胞發(fā)生EMT后會(huì)獲得活動(dòng)性，從腎小球基底膜脫落，加重蛋白尿。使用高糖刺激足細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致miR-34c的表達(dá)量顯著降低，過(guò)表達(dá)的miR-34c可顯著降低Notch1和Jagged1的信使RNA水平，從而抑制足細(xì)胞凋亡[20]。

2.2miRNA表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致足細(xì)胞損傷 高糖條件下培養(yǎng)的足細(xì)胞中miR-195的表達(dá)上調(diào)，miR-195通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)下調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)[21]，最終導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡。miRNA-陣列分析顯示，與健康對(duì)照組相比，2型糖尿病模型小鼠血漿miR-21的水平明顯升高[22]，且miR-21的水平與2型糖尿病小鼠的蛋白尿程度相關(guān)[23]。miR-21在足細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)可促使足細(xì)胞去分化，并增加足細(xì)胞的遷移；抑制miR-21的表達(dá)可減少足細(xì)胞遷移。miR-21是通過(guò)激活Wnt/β-catenin通路中的關(guān)鍵因子β-catenin，上調(diào)TGF-β1/Smads通路中TGF-β1和P-Smad3的水平，并降低Smad7的水平，促進(jìn)足細(xì)胞的去分化，使足細(xì)胞發(fā)生EMT[24]。miR-21增加足細(xì)胞的遷移能力則是通過(guò)影響張力蛋白同源物實(shí)現(xiàn)的[23]。

Nephrin是一種上皮標(biāo)志物，同時(shí)也是足細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)蛋白，參與腎小球足細(xì)胞中細(xì)胞-細(xì)胞黏附，并且是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞表面受體，其崩解會(huì)導(dǎo)致蛋白尿[25]。與對(duì)照組相比，由鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病野生型C57小鼠中miR-155的表達(dá)顯著增加，而足細(xì)胞nephrin和乙?；痭ephrin的水平則降低[26]；而采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病miR-155-/-小鼠與野生型相比，尿蛋白排泄顯著降低，足細(xì)胞損傷標(biāo)志物desmin的表達(dá)也顯著降低，而nephrin、乙?；痭ephrin以及WT-1的水平則升高[26]。該研究證實(shí)，miR-155表達(dá)的升高使nephrin以及乙?；痭ephrin的水平降低，導(dǎo)致糖尿病腎病的腎損傷。miR-27a表達(dá)的上調(diào)會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)和足細(xì)胞損傷，其是通過(guò)負(fù)向調(diào)控叉頭框蛋白O1的表達(dá)，并激活ERS實(shí)現(xiàn)的。使用miR-27a抑制劑可發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)條件下的足細(xì)胞中叉頭框蛋白O1的表達(dá)上調(diào)，ERS相關(guān)分子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78的表達(dá)下調(diào)，氧化應(yīng)激減弱[27]。

3 自 噬

自噬現(xiàn)象存在于正常狀態(tài)人的足細(xì)胞中，且一定水平的自噬對(duì)維持人足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能以及代謝穩(wěn)態(tài)有重要作用[28]。自噬異常會(huì)導(dǎo)致糖尿病腎病蛋白尿進(jìn)展[29-30]。多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與足細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)，目前研究主要集中在哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、沉默信息調(diào)節(jié)因子-1(sirtuin 1，SIRT1)3個(gè)信號(hào)通路。

3.1mTOR通路 細(xì)胞自噬與凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程，其中mTOR通路是兩者共同的中樞。與營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的細(xì)胞自噬在足細(xì)胞損傷中發(fā)揮了重要作用。mTOR是自噬的負(fù)性調(diào)控因子[31]。AGEs能促使人足細(xì)胞中mTOR的活化，抑制轉(zhuǎn)錄因子EB的核轉(zhuǎn)位，下調(diào)自噬相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制足細(xì)胞中自噬體的形成，同時(shí)增加足細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡[32]。高遷移率族蛋白-1可通過(guò)抑制Akt/mTOR通路，減少足細(xì)胞自噬[33]。Pim1-p21-mTOR信號(hào)軸對(duì)足細(xì)胞自噬也有影響。Pim1參與調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白(autophagy-related protein，Atg)p21的降解[34]。Pim1抑制劑可調(diào)控mTOR的表達(dá),激活足細(xì)胞的自噬[35]。足細(xì)胞的保護(hù)性自噬減少，足細(xì)胞凋亡增加，這可能是導(dǎo)致糖尿病腎病腎臟損傷的原因之一。氨基酸信號(hào)是自噬調(diào)節(jié)的重要上游信號(hào)。氨基酸饑餓增加了自噬體數(shù)量，抑制了mTOR的活性，增加了轉(zhuǎn)錄因子EB的活性，而抑制轉(zhuǎn)錄因子EB可阻斷氨基酸饑餓誘導(dǎo)的自噬[36]。以上研究表明，氨基酸饑餓可通過(guò)抑制mTOR通路和活化轉(zhuǎn)錄因子EB介導(dǎo)足細(xì)胞自噬。

3.2AMPK通路 AMPK作為代謝傳感器發(fā)揮作用，協(xié)調(diào)細(xì)胞在各種器官(包括腎臟)中的存活和功能。AMPK可以磷酸化TSC2絲氨酸殘基1 387位點(diǎn)，激活其復(fù)合物的GAP活性，從而使哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)失活。 mTORC1可通過(guò)Ser 317和Ser 777位點(diǎn)的磷酸化直接激活UNC-51樣激酶1，并加強(qiáng)UNC-51樣激酶1與AMPK的相互作用，最終引發(fā)自噬[37]。SIRT1是可以調(diào)節(jié)代謝和細(xì)胞存活的脫乙酰酶。AMPK可通過(guò)AMP/ATP的變化感知細(xì)胞的能量變化，當(dāng)比值升高時(shí)，即胞內(nèi)能量處于低水平時(shí)，AMPK激活。AMPK活化后可直接激活A(yù)tg1，也可通過(guò)抑制mTOR的活性調(diào)節(jié)自噬。高糖環(huán)境下培養(yǎng)的足細(xì)胞中AMPK的表達(dá)減少，而應(yīng)用AMPK激動(dòng)劑能改善高糖對(duì)腎臟的損傷[38]，提示糖尿病環(huán)境下足細(xì)胞AMPK失活，而激活A(yù)MPK能改善AMPK對(duì)自噬的調(diào)節(jié)。在營(yíng)養(yǎng)缺乏等應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸比例升高提示能量不足，Sirt1被激活[39]，Sirt1能通過(guò)促進(jìn)自噬體的形成，促進(jìn)足細(xì)胞自噬[40]。

3.3SIRT1通路 SIRT1通過(guò)去乙?；疉tg，如Atg5、Atg7、Atg8以及叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子3a，在細(xì)胞中發(fā)揮效應(yīng)[41]。在Sirt1敲除小鼠中可發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞自噬受到抑制[42],證明Sirt1起到正向調(diào)控自噬和抗細(xì)胞凋亡的作用。

3.4其他 長(zhǎng)鏈非編碼RNA也可通過(guò)調(diào)控足細(xì)胞自噬參與疾病進(jìn)程。長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)的失調(diào)參與了多種人類疾病的發(fā)生和發(fā)展，但目前對(duì)于長(zhǎng)鏈非編碼RNA在糖尿病腎病進(jìn)程中的作用尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA可通過(guò)調(diào)節(jié)足細(xì)胞自噬參與疾病進(jìn)程[43]。Gm5524在響應(yīng)糖尿病腎病時(shí)顯著上調(diào)，而Gm15645則在響應(yīng)糖尿病腎病時(shí)顯著下調(diào)。在高糖培養(yǎng)條件下，Gm5524的敲低和Gm15645的過(guò)表達(dá)降低了足細(xì)胞的自噬，并誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡[44]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA對(duì)足細(xì)胞自噬的影響還可通過(guò)調(diào)節(jié)ERS實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA TUG1可通過(guò)ERS-CHOP-過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α通路實(shí)現(xiàn)足細(xì)胞自噬的調(diào)控[45]。用高糖處理后，足細(xì)胞內(nèi)TUG1的含量明顯升高，而過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α和裂解的caspase-3的含量降低，CHOP的表達(dá)升高，足細(xì)胞ERS的水平提高，細(xì)胞凋亡減少[45]。

除上述機(jī)制外，醛固酮/鹽皮質(zhì)激素受體也可誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬[46]。此種自噬的調(diào)控方式還受ERS和氧化應(yīng)激的影響。ERS增加了自噬的形成，可保護(hù)足細(xì)胞免于凋亡。氧化應(yīng)激則是先通過(guò)激活ERS，然后觸發(fā)CHOP依賴性細(xì)胞凋亡和自噬。血紅素加氧酶-1也可激活足細(xì)胞的自噬途徑[47]。雖然此方向研究較少，但也為糖尿病腎病的治療提供了一個(gè)新思路。

4 外泌體

高糖可誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞EMT，經(jīng)EMT的細(xì)胞可通過(guò)釋放含有TGF-β1的外泌體刺激足細(xì)胞的EMT，并導(dǎo)致足細(xì)胞的損傷和功能障礙。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可被足細(xì)胞內(nèi)化。采用經(jīng)過(guò)EMT的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體處理足細(xì)胞，足細(xì)胞的上皮標(biāo)志物喪失，并獲得間充質(zhì)標(biāo)志物，這證明足細(xì)胞發(fā)生了EMT[48]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)外泌體處理的足細(xì)胞，足細(xì)胞EMT的強(qiáng)誘導(dǎo)劑TGF-β1信使RNA的表達(dá)水平升高，并激活了Wnt/β-catenin信號(hào)通路，最終誘導(dǎo)了足細(xì)胞的去分化，導(dǎo)致細(xì)胞骨架解體，足突消失[48]。

5 展 望

糖尿病腎病足細(xì)胞損傷機(jī)制主要是劃分為氧化應(yīng)激、自噬、miRNA三大部分，當(dāng)前研究比較熱門的是自噬、miRNA。近年來(lái)，有許多與足細(xì)胞損傷密切相關(guān)的起到調(diào)控作用的miRNA相繼被發(fā)現(xiàn)，這為進(jìn)一步闡明足細(xì)胞的損傷機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。除了上述研究方向外，國(guó)內(nèi)也有團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性地將外泌體納入了損傷機(jī)制的研究范圍，并取得了進(jìn)展；關(guān)于長(zhǎng)鏈非編碼RNA對(duì)足細(xì)胞損傷的影響亦是一個(gè)新興研究方向。

糖尿病腎病的作用機(jī)制是多重且復(fù)雜的，就目前對(duì)足細(xì)胞損傷機(jī)制的研究結(jié)果很難說(shuō)明是哪一種因素在導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生以及發(fā)展中起決定性作用，將來(lái)或許需要轉(zhuǎn)變思路，打破固有的從單方面研究足細(xì)胞損傷機(jī)制的思維方式，從整體層面去研究其機(jī)制，這可能有助于更深刻地理解糖尿病腎病中足細(xì)胞的損傷機(jī)制。在已有的研究中，關(guān)于氧化應(yīng)激、外泌體、miRNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA以及自噬相互作用的研究較少，或可作為未來(lái)研究的方向。