中國中醫(yī)科學院中藥研究所 北京 100700

黃連解毒湯原載于《肘后備急方》，由黃連、黃柏、黃芩、梔子組成，被視為清熱解毒的代表方，具有瀉火解毒之功效，主治一切實熱火毒、三焦熱盛之證[1]。黃連解毒湯廣泛應用于治療火熱熾盛證引起的各系統(tǒng)疾病，是典型的證候類藥物。癥見大熱煩躁、口燥咽干、目赤睛痛、錯語不眠，或熱病吐血、衄血、便血，甚或發(fā)斑、外科癰疽瘡瘍皆可使用。研究證實，黃連解毒湯在抗炎、抗氧化、抗血栓、降血糖、降血脂、降血壓、抗腫瘤，以及保護心血管系統(tǒng)、護肝等方面都應用廣泛[2-5]。目前，本課題組的研究評價了黃連解毒湯（顆粒劑）對胃火熾盛證引起的口腔科疾病患者的治療作用，但是對于黃連解毒湯的具體機制尚不明確。在前期研究的基礎上，本實驗通過尿液代謝組學方法，利用超高效液相色譜-靜電場軌道阱質譜（ultra performance liquid chromatography coupled with orbitrap tandem mass spectrometry,UHPLC-Orbitrap MS）法對胃火熾盛證引起的口腔疾病患者干預前和黃連解毒湯干預后，以及健康對照組的尿液進行分析，區(qū)分胃火熾盛證的代謝輪廓并尋找可能的生物標志物，同時初步闡明黃連解毒湯的干預機制。

1 材料和方法

1.1 研究對象 收集2018年1月至8月北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院、北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院和成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院口腔科門診病例。所有患者1年內未接受任何牙周治療；排除明顯錯頜畸形患者；排除近3個月有急慢性傳染病史或者抗生素服用史的患者?；颊吒鶕嗅t(yī)證候和臨床表現診斷為復發(fā)性口腔潰瘍、智齒冠周炎和復發(fā)性皰疹性口炎，共計納入58例，作為口腔疾病患者組（干預前）。相同的58例患者給予黃連解毒湯后作為黃連解毒湯干預組。納入同時期的口腔健康志愿者10例作為健康對照組，要求全口牙附著無喪失，無牙齒缺損，近3個月無急慢性傳染病史或者抗生素服用史。其中對照組男性6例、女性14例，年齡22～58歲，平均（33.30±13.33）歲?？谇患膊』颊呓M男性22例、女性36例，年齡 21～60歲，平均（36.22±13.26）歲；其中復發(fā)性口腔潰瘍10例、智齒冠周炎26例、復發(fā)性皰疹性口炎22例。

1.1.1 診斷標準

1.1.1.1 中醫(yī)證候診斷標準 智齒冠周炎、復發(fā)性口腔潰瘍、復發(fā)性皰疹性口炎胃火熾盛證診斷標準參照中醫(yī)臨床診療術語國家標準（證候部分）[6]、2017年發(fā)布的《中醫(yī)病證診斷療效標準》[7]《中醫(yī)證候鑒別診斷學》[8]及《中醫(yī)診斷學》[9]中胃火熾盛證候分類診斷標準擬定。胃火熾盛證病性（基礎證候）辨證標準為：（1）發(fā)熱（自覺燥熱）；（2）口渴飲冷；（3）口穢；（4）面紅；（5）目赤；（6）大便秘結；（7）小便短黃；（8）舌紅苔黃而干；（9）脈數或洪。（1）～（7）中具備兩點，同時結合舌脈表現即滿足胃火熾盛證病性診斷。

智齒冠周炎（胃火熾盛證）還需滿足：（1）牙痛；（2）冠周牙齦紅腫或盲袋溢膿。復發(fā)性口腔潰瘍（胃火熾盛證）還需滿足：（1）口瘡疼痛，或伴口瘡灼燒感；（2）冠周牙齦紅腫或盲袋溢膿。復發(fā)性皰疹性口炎（胃火熾盛證）還需滿足群集小皰，或伴灼痛刺癢。

1.1.1.2 西醫(yī)疾病診斷標準 智齒冠周炎診斷標準參考“十二五”國家級規(guī)劃教材《口腔頜面外科學》第7版[10]和《Peterson口腔頜面外科學》第2版[11]中智齒冠周炎的診斷標準擬定；復發(fā)性口腔潰瘍診斷標準參照《口腔黏膜病學》[12]與《復發(fā)性阿弗他潰瘍療效評價試行標準》[13]擬定。復發(fā)性皰疹性口炎診斷標準則參考《口腔黏膜病學》[12]與Clinical Oral Medicine and Pathology[14]擬定。

1.1.2 納入標準 （1）符合胃火熾盛證標準。（2）年齡18～60歲。（3）滿足以下條件之一的可以納入：患者癥狀符合智齒冠周炎診斷標準，試驗開始前未使用過其他藥物治療本??；患者癥狀符合復發(fā)性口腔潰瘍（輕型）診斷標準，發(fā)病史半年以上，且平均潰瘍持續(xù)時間5d以上者，本次潰瘍發(fā)作在48h之內，且未進行治療；患者癥狀符合復發(fā)性皰疹性口炎診斷標準，本次病程（出現前驅癥狀、紅斑或水皰）在48h之內，且未進行治療，每年復發(fā)1次以上。（4）患者知情同意并簽署知情同意書。

1.1.3 排除標準 （1）具有以下情況的智齒冠周炎患者需排除：重度吸煙者（＞20支/d）；伴有頜面部間隙感染及慢性擴散性冠周炎患者；在智齒冠周炎病灶區(qū)域合并牙周??；過去4周內全身應用抗生素。（2）具有以下情況的復發(fā)性口腔潰瘍患者需排除：過去6個月內有毒品使用史；重度吸煙者（＞20支/d）；患有已知可能與復發(fā)性口腔潰瘍有關的疾病，例如：潰瘍性結腸炎、白塞病、賴特綜合征、免疫缺陷病等；過去4周內全身應用抗生素，3個月內全身使用過皮質激素、免疫抑制劑者；佩戴有可能與潰瘍直接接觸的正畸固定器或保持器。（3）具有以下情況的復發(fā)性皰疹性口炎患者需排除：體溫＞38.5℃，和（或）外周血 WBC＞11.0×109/L，和（或）中性粒細胞比例＞85%；過去4周內使用過抗病毒藥物或抗生素，過去3個月內進行過免疫抑制或免疫調節(jié)治療。（4）伴嚴重心、肝腎功能不全等系統(tǒng)性疾病的患者。（5）妊娠期或哺乳期婦女，或當前沒有采取有效避孕措施的育齡婦女。（6）對本研究用藥過敏，或對含有黃連、黃柏、黃芩、梔子的制劑較為敏感者，如服用后易腹瀉或平素為脾胃虛寒體質者。

1.1.4 脫落標準 （1）受試者自行退出；（2）研究者令其退出，如受試者依從性太差、出現夾雜癥或發(fā)生嚴重不良事件等。

1.2 儀器 Ultimate 3000超高效液相色譜儀（含自動進樣器、柱溫箱、在線真空脫氣機、低壓四元梯度泵、PDA檢測器）和LTQ Orbitrap velos pro質譜儀（高分辨靜電場軌道阱質譜）均購自美國Thermo Fisher公司；KQ-250B型超聲波清洗器購于昆山市超聲儀器有限公司；Mix-3000震蕩混勻器購于杭州米歐儀器有限公司；Mikro 220R臺式高速冷凍離心機購于Hettich公司。

1.3 試藥 黃連（Rhizoma Coptidis Franch.，產地為重慶石柱縣）、黃芩（Radix Scutellariae Georgi，產地為河北承德圍場縣）、黃柏（Phellodendri Chinensis C.K.Schneid.，產地為重慶新都縣）、梔子（Gardeniae jasminoides J.Ellis，產地為江西省樟樹市），均購于北京仟草中藥飲片有限公司，經中國中醫(yī)科學院中藥研究所何希榮教授鑒定可用于實驗研究。黃連解毒湯配方顆粒（3.2g/袋）由中國中醫(yī)科學院中藥研究所提供（批號：1801001Y）。甲醇、甲酸、乙腈均購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司（批號：174486、168642、175160）；其它化學品和溶劑均為分析純。

1.4 方法

1.4.1 黃連解毒湯配方顆粒服用方法 口腔疾病患者組予以黃連解毒湯配方顆?？诜?，早晚飯后0.5～1h內以80℃以上熱水沖調，1袋/次，2次/d。療程為5d。

1.4.2 樣品處理 健康對照組受試者、口腔疾病患者組（干預前）及黃連解毒湯干預5d后分別于清晨空腹收取尿樣。取200μL尿液樣本，加600μL乙腈，渦旋混勻，4℃、12 000r/min離心10min，取上清液待測。將3組的所有尿液樣本取等量混合均勻后，按照上述樣品處理過程處理，所得作為質控（quality control,QC）樣品。

1.4.3 色譜條件

1.4.3.1 液相條件 Agilent Extend-C18柱（3.0mm×150mm，3.5μm）；柱溫：30℃；流動相為 A（乙腈）和 B（0.1%甲酸-水），梯度洗脫 0～10min，5%A；10～15min，5%～15%A；15～25min，15%～50%A；25～30min，50%～95%A；30～36min，95%A。流速 0.3mL·min-1；進樣體積3μL。

1.4.3.2 質譜條件 電噴霧離子源（electrospray ion source,ESI）參數設定如下：正負離子掃描模式，正離子模式下毛細管溫度為350℃，毛細管電壓為35V，噴霧電壓為 3.5kV，鞘氣（N2）流速為 40psi，輔助氣（N2）流速為10psi；負離子模式下毛細管電壓為35V，噴霧電壓為 3.5kV，鞘氣（N2）流速為 35psi，輔助氣（N2）流速為10psi。樣品一級質譜在FT模式下進行全掃描，分辨率R為30 000，m/z掃描范圍為150～1 000，二級及三級質譜采用數據依賴性掃描（data dependent scan）。數據采集和分析采用Xcalibur、Metworks和Mass Frontier 7.0軟件。

1.4.4 數據處理 采用 Progenesis QI軟件（Nonlinear）對采集的數據進行色譜峰識別、提取、峰對齊和歸一化處理，在原始峰表中去除QC樣品，測定相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）＞30%的變量，依據80%規(guī)則去除零值，處理原始峰表后，將歸一化后的峰表導入SIMCA-P 14.1（Umetrics）數據處理軟件，采用主成分分析法（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析法（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）對各組尿液的代謝物進行分析。通過變量重要因子（variable importance in the project,VIP）值（＞1）及內源性代謝物在正常組與模型組之間的t檢驗，篩選與上火相關的潛在生物標志物。根據精確相對分子質量計算分子的不飽和度，結合同位素峰強度及對應的二級離子碎片信息與HMDB（http://www.hmdb.ca/）中的代謝物質譜數據庫進行匹配，對可能的潛在標志物進行初步鑒定。

2 結果

2.1 健康對照組、口腔疾病患者組（干預前）和黃連解毒湯干預組尿液LC-MS質譜檢測結果 建立UHPLC-Orbitrap MS分析尿液樣品的方法，分別在正負離子模式下進行檢測分析。分別將所有健康對照組、口腔疾病患者組（干預前）和黃連解毒湯干預組的尿液處理后進行質譜檢測，總離子流圖見圖1。以正離子模式下為例，可見3組尿液的總離子流圖存在明顯差異，進一步采用PCA和OPLS-DA獲得詳細的信息。

圖1 3組人群在正離子模式下的超高效液相色譜-質譜聯(lián)用檢測總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms for ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometric analysis of urine samples deriving from three groups

2.2 數據分析

2.2.1 PCA 采用PCA統(tǒng)計3組人群代謝物的變化趨勢。以正離子模式下為例，QC樣品評估PCA得分見圖2。相對聚集的QC樣品表明，系統(tǒng)重復性好，所采集的數據值得進一步研究。各組之間PCA得分見圖3。每個點代表1個樣品，每個樣品的位置由其成分決定，處于相同病理生理狀態(tài)的樣本通常具有相似的代謝物組成，因此在得分圖上也處于相似的位置。相反，彼此之間距離越遠表示其病理生理狀態(tài)相差越大。

2.2.2 差量變異研究 基于健康對照組、口腔疾病患者組（干預前）及黃連解毒湯干預組的PCA分析結果，確定存在代謝差異。以正離子模式下為例，健康對照組、口腔疾病患者組（干預前）及黃連解毒湯干預組樣品OPLS-DA得分見圖4。健康對照組和口腔疾病患者組（干預前），口腔疾病患者組（干預前）和黃連解毒湯干預組樣品的S-plot載荷圖及火山圖見圖5-6。S-plot載荷圖中每個點代表樣品中代謝物相關信息，距離原點越遠的點對兩組間區(qū)分貢獻越大，為兩組中差異較大的代謝物?；鹕綀D中每個黑色點代表樣品中代謝物相關信息，距離原點越遠的黑色點對兩組間區(qū)分貢獻越大，可認為是兩組中差異較大的潛在生物標志物。

圖2 QC樣品評估的PCA得分圖Fig.2 PCA score chart of quality control sample evaluation

圖3 健康對照組和口腔疾病患者組（干預前）、口腔疾病患者組（干預前）和黃連解毒湯干預組正離子模式下的PCA得分圖Fig.3 PCA score chart of urine sample under positive ion mode from healthy control group and oral disease group(before intervention),oral disease group(before intervention)and Huanglian Jiedu Decoction intervention group

2.2.3 潛在生物標志物的鑒定 根據精確分子量和MS/MS結果以及與HMDB或標準品進行比較，健康對照組和口腔疾病患者組（干預前）之間初步鑒定出38個差異代謝物，其中正離子模式下32個、負離子模式下6個。口腔疾病患者組（干預前）和黃連解毒湯干預組之間初步鑒定出36個差異代謝物，其中正離子模式下28個、負離子模式下8個。3組尿樣共有且給藥后有一定改善趨勢的差異代謝物共有10個，其中正離子模式下有9個，分別為癸酰肉堿、α-N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺、反-2,順-4-癸二烯酰肉毒堿、異亮羥基脯氨酸、3-氨基己酸、10，20-二羥基二十碳酸、菊蒿醇B、Sterebin A和亮菌素；負離子模式下有2個，分別為α-N-苯乙?；?L-谷氨酰胺和L-谷氨酰胺。其中，α-N-苯乙?；?L-谷氨酰胺在正、負離子模式下均檢出。以α-N-苯乙?；?L-谷氨酰胺為例，保留時間23.50min時，該化合物（[M+Na]+m/z 287.1004（C13H16O4N2Na），[M+H]+m/z 265.1186），正離子模式下提取離子流圖和質譜圖如圖7-1和圖7-2中Ⅱ、Ⅲ所示。將結果與數據庫中化合物進行比對，初步確定該化合物為α-N-苯乙?；?L-谷氨酰胺。MS/MS質譜的結果也證實了這一點，m/z 270.0748（C13H13O4NNa）是由[M+Na]+峰裂解失去NH3得到的，進一步失去CO產生m/z 242.0797（C12H13O3NNa），再進一步失去C7H6基團得到 m/z 152.0323（C5H7O3NNa）。見圖 7 中Ⅲ。根據以上信息，確定該化合物為α-N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺?？谇患膊』颊呓M（干預前）和健康對照組，以及黃連解毒湯干預組和口腔疾病患者組（干預前）潛在生物標志物的鑒定結果見表1、2。通過分析軟件給出了口腔疾病患者組（干預前）和健康對照組，以及黃連解毒湯干預組和口腔疾病患者組（干預前）之間潛在標志物的變化趨勢，標志物的增加或者減少反映了代謝通路的進行方向與趨勢。

圖4 健康對照組和口腔疾病患者組（干預前）、口腔疾病患者組（干預前）和黃連解毒湯干預組正離子模式下的OPLS-DA得分圖Fig.4 OPLS-DA score plots of urine sample under positive ion mode from healthy control group and oral disease group(before intervention),oral disease group(before intervention)and Huanglian Jiedu Decoction intervention group

圖5 正離子模式下健康對照組和口腔疾病患者組（干預前）的S-plot載荷圖及對應火山圖Fig.5 S-plot loadings plots and volcano plots of urine sample under positive ion mode from healthy control group and oral disease group(before intervention)

圖6 正離子模式下口腔疾病患者組（干預前）和黃連解毒湯干預組的S-plot的載荷圖及對應火山圖Fig.6 S-plot loadings plots and volcano plots of urine sample under positive ion mode from oral disease group(before intervention)and Huanglian Jiedu Decoction intervention group

圖7 -1潛在標志物α-N-苯乙?；?L-谷氨酰胺的鑒定Fig.7-1 Identification of potential maker of α-N-phenylacetyl-L-glutamine

2.3 代謝通路分析 將10個通過模式識別篩選出的差異代謝物導入MetaboAnalyst軟件進行代謝通路分析得到的結果見圖8。推測黃連解毒湯治療胃火熾盛證引起的口腔疾病主要涉及的代謝通路為三聚氰胺、天冬氨酸和谷氨酸代謝（alamine，aspartate and glutamate metabolism），D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝（D-glutamine and D-glutamate metabolism）等。

3 討論

圖7 -2潛在標志物α-N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺的鑒定Fig.7-2 Identification of potential maker of α-N-phenylacetyl-L-glutamine

表1 口腔疾病患者組（干預前）和健康對照組尿液生物標志物的鑒定結果Tab.1 Identification of biomarkers in oral disease group（before intervention）and healthy control group in urine

表2 黃連解毒湯干預組和口腔疾病患者組（干預前）尿液生物標志物的鑒定結果Tab.2 Identification of biomarkers in Huanglian Jiedu Decoction intervention group and oral disease group（before intervention）in urine

圖8 黃連解毒湯干預胃火熾盛證引起的口腔疾病影響的代謝通路Fig.8 Metabolic pathway of Huanglian Jiedu Decoction influencing on oral diseases caused by syndrome of excessine heat in stomach fire

通過 UHPLC-MS方法對健康對照組、口腔疾病患者組（干預前）以及黃連解毒湯干預組3組人群的尿液進行檢測，結果初步鑒定發(fā)現，健康對照組和口腔疾病患者組（干預前）存在38個差異代謝物，口腔疾病患者組（干預前）和黃連解毒湯干預組對比則存在36個差異代謝物，結果提示α-N-苯乙?；?L-谷氨酰胺等10種化合物可能與黃連解毒湯干預胃火熾盛證口腔疾病的作用機制和代謝途徑有關。

作為細胞內滲透劑，高水平的谷氨酰胺可引起腦細胞腫脹、腦水腫甚至顱內高壓的發(fā)生[15]。本研究發(fā)現，口腔疾病患者組α-N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺和L-谷氨酰胺明顯升高，說明α-N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺和L-谷氨酰胺含量過高可能促進上火的發(fā)生。肉毒堿種類或水平的變化在一定程度上可以提示體內脂肪酸或氨基酸代謝的紊亂，其水平升高與細胞線粒體脂質過載和脂肪酸不完全氧化有關[16]，本研究結果提示黃連解毒湯可以通過調節(jié)體內脂肪酸或氨基酸代謝，如降低癸酰肉堿、反-2,順-4-癸二烯酰肉毒堿、異亮羥基脯氨酸、3-氨基己酸的含量等，從而緩解胃火熾盛證的癥狀。10，20-二羥基二十碳酸可由環(huán)氧二十碳三烯酸經P450環(huán)氧化酶降解產生，同時會降低環(huán)氧二十碳三烯酸的活性[17]。10，20-二羥基二十碳酸在胃火熾盛證引起的口腔疾病患者尿液中含量升高，推測10，20-二羥基二十碳酸可能也是胃火熾盛證的生物標志物。

本研究將UHPLC-Orbitrap MS與PCA等統(tǒng)計方法相結合，分別對胃火熾盛證口腔疾病患者與健康對照組，以及口腔疾病患者黃連解毒湯干預前后的尿液進行快速分析，從中發(fā)現并鑒定出10種黃連解毒湯干預胃火熾盛證口腔疾病的潛在生物標志物，推測黃連解毒湯治療胃火熾盛證口腔疾病主要涉及的代謝通路。本研究首次從代謝組學角度研究了胃火熾盛證口腔疾病的代謝輪廓，并初步闡明了黃連解毒湯的干預機制，為胃火熾盛證疾病的癥狀客觀化提供科學依據。