姜麗霞葛婷婷周麗萍劉麗珍竺璐婕周斌杰余勤

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053 2.浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨髓移植中心

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種來(lái)源廣泛、具有強(qiáng)大增殖能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，已成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。目前臨床上MSCs主要用于體外細(xì)胞移植治療[1-2]。盡管該法可行，但步驟繁瑣、擴(kuò)增到所需細(xì)胞量需要的周期較長(zhǎng)、細(xì)胞來(lái)源受限、容易發(fā)生污染及存在潛在的致瘤風(fēng)險(xiǎn)等缺點(diǎn)仍然限制了MSCs的廣泛應(yīng)用。近年來(lái)有報(bào)道指出，特定細(xì)胞因子和藥物的刺激可促進(jìn)細(xì)胞信號(hào)通路的一系列信號(hào)傳導(dǎo)，使干/祖細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)從骨髓進(jìn)入外周循環(huán)池，進(jìn)一步遷移、歸巢到達(dá)損傷部位，參與組織修復(fù)[3-4]。因此，有效的MSCs體內(nèi)動(dòng)員可以避免上述體外移植的諸多缺點(diǎn)，具有無(wú)可比擬的高效性和低創(chuàng)性，為臨床各類(lèi)疾病的治療帶來(lái)了新希望[5-9]。

目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)公認(rèn)有效的MSCs動(dòng)員劑。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，二甲基乙二?；拾彼幔╠imethyloxaloylglycine，DMOG） 可 以 在 體 內(nèi) 動(dòng) 員MSCs[10]。因此本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，探討了不同濃度DMOG對(duì)MSCs的增殖能力、細(xì)胞周期、遷移能力、多向分化能力等生物學(xué)特性的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量80～100g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184]，來(lái)源于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司 [實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016]。

1.1.2 主要試劑 DMOG購(gòu)于Cayman公司（批號(hào)：71210）；DMEM/F12培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液均購(gòu)于 Invitrogen公司（批號(hào)：1785916、10378016）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、0.25%胰蛋白酶-EDTA均 購(gòu) 于 Gibco 公 司 （批 號(hào) ：614318、2015041203）；MSCs成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基、油紅O儲(chǔ)存液均為廣州賽業(yè)生物科技有限公司產(chǎn)品（批號(hào)：RASMX-90021、T150610G001）；硝酸銀、硫代硫酸鈉均購(gòu)于Sigma公司（批號(hào)：S8157、72049）；PrimeScriptTMRT Master Mix、SYBRPremix ExTagTMⅡ（TliRnase H Plus）試劑盒均購(gòu)于Takara公司（批號(hào)：RR420Q、RR054A）。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 TE2000-S型倒置相差顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品；PN PAL-CAXXXLSM2型純水儀購(gòu)于美國(guó)PALL公司；3111型二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)FORMA公司；3K-15型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)為德國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，SpectraMax 190型酶標(biāo)儀為美國(guó)MD公司產(chǎn)品，TS-1型脫色搖床購(gòu)于海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠MSCs的體外分離及培養(yǎng) 參照本課題組前期已建立的方法[11]，采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs，通過(guò)多次傳代純化細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞分組 MSCs傳代至P4代時(shí)，根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果，將 MSCs分為 4組：DMOG 0μmol·L-1組（空白對(duì)照組）、DMOG 20μmol·L-1組、DMOG 40μmol·L-1組和 DMOG 80μmol·L-1組。DMOG以DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋?zhuān)垢鹘M中DMOG終濃度分別為 0、20、40、80μmol·L-1，用于后續(xù)生物學(xué)特性研究。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)DMOG對(duì)MSCs增殖能力的影響 將P4代MSCs以1×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度重懸于無(wú)FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，接種于7塊96孔板。次日，吸去各孔中細(xì)胞培養(yǎng)液，加入含不同濃度DMOG的DMEM/F12培養(yǎng)基，每組6個(gè)復(fù)孔。隨機(jī)取1塊96孔板，加入CCK-8試劑，孵育后酶標(biāo)儀450nm測(cè)定吸光度值。此后連續(xù)6d，每天同一時(shí)間段重復(fù)上述操作。以未接種細(xì)胞的孔作為調(diào)零孔，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，各組對(duì)應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析DMOG對(duì)MSCs細(xì)胞周期的影響 各組MSCs經(jīng)不同濃度DMOG處理24h后，收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的70%乙醇，4℃冰箱固定過(guò)夜。次日，收集并洗滌細(xì)胞，每管細(xì)胞樣品加入預(yù)制的碘化丙啶染液，37℃避光孵育。流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488nm處檢測(cè)紅色熒光，同時(shí)檢測(cè)光散射情況。采用FlowJo軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。

1.2.5 Transwell法檢測(cè)DMOG對(duì)MSCs遷移能力的影響 將P4代MSCs以1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度重懸于含不同濃度DMOG的培養(yǎng)基中，收集各組細(xì)胞懸液接種于Transwell小室上室，以含F(xiàn)BS的DMEM-LG培養(yǎng)基加入小室下層，培養(yǎng)15h后擦去小室上層未遷移的細(xì)胞。將上室的膜浸泡于4%多聚甲醛中固定，0.1%結(jié)晶紫染色，每組鏡下隨機(jī)選取9個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。

1.2.6 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)法研究DMOG對(duì)MSCs多向分化能力的影響 將P4代MSCs以1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，加入6孔板中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合80%時(shí)，吸去孔內(nèi)完全培養(yǎng)基，6孔板各孔分別更換為新鮮配制的含不同濃度DMOG的成骨、成脂和成軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)至21d，再分別以硝酸銀染色法、油紅O染色法和甲苯胺藍(lán)染色法鑒定結(jié)果。

成神經(jīng)分化結(jié)果采用免疫熒光檢測(cè)。先用含不同濃度DMOG的成神經(jīng)分化預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，更換成神經(jīng)分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6h，棄去誘導(dǎo)培養(yǎng)基，經(jīng)4%多聚甲醛固定，0.3%Triton X-100浸泡，10%山羊血清封閉液室溫封閉，加入小鼠抗大鼠Nestin或GFAP一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗避光室溫孵育，DAPI復(fù)染后，倒置相差熒光顯微鏡下觀察熒光情況，選取任意9個(gè)視野拍照并進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，分析結(jié)果。

1.2.7 Real-time qPCR檢測(cè)MSCs分化特異性基因的表達(dá) 誘導(dǎo)分化24、72、168h時(shí)分別收集各組細(xì)胞，依據(jù)Trizol操作說(shuō)明，提取各組總RNA。按照Prime－ScriptTMRT Master Mix和SYBRPremix Ex TaqTMⅡ（TliRnaseH Plus）試劑盒的操作步驟，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，使用StepOne Software v2.2.2軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DMOG對(duì)MSCs增殖能力的影響 未經(jīng)DMOG處理的MSCs，外形為長(zhǎng)梭形，呈漩渦狀生長(zhǎng)；經(jīng)不同濃度DMOG處理后的細(xì)胞，其形態(tài)均無(wú)明顯改變。見(jiàn)圖1。DMOG處理后，各濃度組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均接近S型。接種后第1～3天為潛伏期，各組細(xì)胞增殖均較慢，從第3天開(kāi)始各組細(xì)胞開(kāi)始快速增殖，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第6天后各組細(xì)胞增殖速度普遍減慢。潛伏期時(shí)，與 DMOG 0μmol·L-1比較，DMOG 20、40、80μmol·L-1組細(xì)胞增殖能力稍弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；DMOG 20、40、80μmol·L-1這 3 組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，細(xì)胞增殖能力提高。第 6 天時(shí)，DMOG 20、40、80μmol·L-1組細(xì)胞增殖能力均顯著高于DMOG 0μmol·L-1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中 DMOG 40μmol·L-1組細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖1 MSCs的形態(tài)學(xué)觀察（200×）Fig.1 Morphological observation of MSCs(200×)

2.2 DMOG對(duì)MSCs細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，處理 24h后，與 DMOG 0μmol·L-1組比較，DMOG 20μmol·L-1組中 G0/G1期的細(xì)胞比例減少，而S期+G2/M期細(xì)胞比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；DMOG 40、80μmol·L-1組 MSCs中 G0/G1期細(xì)胞比例均顯著減少（P＜0.01），而S期+G2/M期細(xì)胞比例均顯著增加（P＜0.01）。同時(shí)，DMOG 20、40、80μmol·L-1這 3 組間比較，G0/G1期和 S 期+G2/M 期細(xì)胞比例均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

2.3 DMOG對(duì)MSCs遷移能力的影響 誘導(dǎo)培養(yǎng)15h后經(jīng)結(jié)晶紫染色，顯微鏡視野中紫色多角形或長(zhǎng)梭形的細(xì)胞即為遷移穿過(guò)Transwell小室上室膜的MSCs。與 DMOG 0μmol·L-1組比較，DMOG 20、40、80μmol·L-1組中MSCs細(xì)胞遷移數(shù)均增多，其中DMOG 20、80μmol·L-1組細(xì)胞遷移數(shù)目增加顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且該兩組均高于 40μmol·L-1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但該兩組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖4。

圖2 DMOG對(duì)MSCs增殖能力的影響Fig.2 Effects of DMOG on proliferation of MSCs

圖3 DMOG對(duì)MSCs細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effects of DMOG on cell cycle of MSCs

圖4 DMOG對(duì)MSCs遷移能力的影響Fig.4 Effects of DMOG on migration of MSCs

2.4 DMOG對(duì)MSCs多向分化能力的影響 硝酸銀染色結(jié)果顯示，各組細(xì)胞染色均呈陽(yáng)性，有黑色鈣鹽著色，其中，DMOG 0μmol·L-1組黑色鈣鹽分泌集中且聚集在個(gè)別區(qū)域，DMOG 20μmol·L-1組 MSCs鈣鹽分泌較多且在孔板中分布均勻，DMOG 40、80μmol·L-1兩組黑色鈣鹽分泌較為稀疏散在。見(jiàn)圖5-1。甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示，各組細(xì)胞均呈陽(yáng)性著色，其中，DMOG 20μmol·L-1組細(xì)胞呈明顯異染性著色，即細(xì)胞外基質(zhì)被染成紫色，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，表明誘導(dǎo)后細(xì)胞產(chǎn)生了軟骨細(xì)胞基質(zhì)糖胺聚糖。見(jiàn)圖5-2。油紅O染色結(jié)果顯示，各組細(xì)胞中脂滴呈橘紅色。見(jiàn)圖5-3。免疫熒光結(jié)果顯示，各組MSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞表面Nestin陽(yáng)性表達(dá)，GFAP陰性表達(dá)。見(jiàn)圖5-4、5-5。提示DMOG處理后MSCs依然保留了成骨、成脂、成軟骨和成神經(jīng)分化能力。

2.5 DMOG對(duì)MSCs分化特異性基因表達(dá)的影響

2.5.1 成骨分化 成骨分化基因Bglap2檢測(cè)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化 1d 時(shí)，與 DMOG 0μmol·L-1組比較，其余3組的Bglap2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；DMOG 20、40、80μmol·L-1這 3 組間比較，隨著DMOC濃度增加，Bglap2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

誘導(dǎo)分化3d時(shí)，各組Bglap2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，與同時(shí)點(diǎn)DMOG 0μmol·L-1組比較，DMOG 20μmol·L-1組相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；而其余兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。DMOG 20、40、80μmol·L-1這 3組間比較，隨著 DMOG 濃度增加，Bglap2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，其中DMOG 20μmol·L-1組 Bglap2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量顯著高于 80μmol·L-1組（P＜0.01）。

圖5 -1 DMOG對(duì)MSCs成骨分化能力的影響（硝酸銀染色，200×）Fig.5-1 Effects of DMOG on osteogenic differentiation of MSCs(silver nitrate stained，200×)

圖5 -2 DMOG對(duì)MSCs成軟骨分化能力的影響（甲苯胺藍(lán)染色，200×）Fig.5-2 Effects of DMOG on chondrogenic differentiation of MSCs(toluidine blue stained,200×)

圖5 -3 DMOG對(duì)MSCs成脂分化能力的影響（油紅O染色，200×）Fig.5-3 Effects of DMOG on adipogenic differentiation of MSCs(oil red O stained,200×)

圖5 -4 DMOG對(duì)MSCs成神經(jīng)分化能力的影響（Nestin蛋白熒光染色，200×）Fig.5-4 Effects of DMOG on neural differentiation of MSCs(Nestin fluorescent stained,200×)

圖5 -5 DMOG對(duì)MSCs成神經(jīng)分化能力的影響（GFAP蛋白熒光染色，200×）Fig.5-5 Effects of DMOG on neural differentiation of MSCs(GFAP fluorescence stained,200×)

誘導(dǎo)分化7d時(shí)，各組細(xì)胞Bglap2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)。與同時(shí)點(diǎn)DMOG 0μmol·L-1組比較，DMOG 80μmol·L-1組 Bglap2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），而其余兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。DMOG 20、40、80μmol·L-1這 3 組間比較，隨著DMOG濃度增加，Bglap2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量也逐漸下降，DMOG 20、40μmol·L-1這兩組的 Bglap2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于DMOG 80μmol·L-1組（P＜0.01，P＜0.05），但該兩組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明隨誘導(dǎo)時(shí)間增加，成骨誘導(dǎo)分化特異性基因Bglap2 mRNA相對(duì)表達(dá)量先升高后下降，誘導(dǎo)分化 3d時(shí)達(dá)到峰值；DMOG 20μmol·L-1處理對(duì)MSCs成骨分化能力具有顯著促進(jìn)作用，但隨DMOG濃度增加，Bglap2 mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸降低。見(jiàn)圖6A。

2.5.2 成脂分化 成脂分化基因Pparg2檢測(cè)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化 1d時(shí)，與同時(shí)點(diǎn) DMOG 0μmol·L-1組比較，DMOG 20μmol·L-1組 Pparg2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著增高（P＜0.05），其余兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。DMOG 20、40、80μmol·L-1這 3 組間比較，DMOG 20、80μmol·L-1兩組均顯著高于 DMOG 40μmol·L-1組（P＜0.01，P＜0.05），但該兩組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

誘導(dǎo)分化3d時(shí)，各組Pparg2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。與同時(shí)點(diǎn)DMOG 0μmol·L-1組比較，其余3組 Pparg2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均下降（P＜0.05）。DMOG 20、40、80μmol·L-1這 3 組間比較，DMOG 20μmol·L-1組 Pparg2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量明顯高于其余兩組（P＜0.05）。

誘導(dǎo)分化7d時(shí)，與同時(shí)點(diǎn)DMOG 0μmol·L-1組比較，DMOG 20、40、80μmol·L-1這 3 組 Pparg2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而該3組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明MSCs中Pparg2 mRNA相對(duì)表達(dá)量增加具有時(shí)間依賴(lài)性，而不同濃度（20、40、80μmol·L-1）DMOG作用后，MSCs內(nèi)Pparg2 mRNA相對(duì)表達(dá)量增加隨時(shí)間波動(dòng)；且隨誘導(dǎo)時(shí)間增加，DMOG對(duì)MSCs的成脂分化逐漸表現(xiàn)出一定的抑制作用。見(jiàn)圖6B。

2.5.3 成軟骨分化 成軟骨分化基因CollagenⅡ檢測(cè)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化1d時(shí)，與同時(shí)點(diǎn)DMOG 0μmol·L-1組比較，DMOG 20μmol·L-1組 Collagen ⅡmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.01），其余兩組CollagenⅡ mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。DMOG 20、40、80μmol·L-1這 3 組間比較，DMOG 20μmol·L-1組 Collagen Ⅱ mRNA 相對(duì)表達(dá)量最高，與另外兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

誘導(dǎo)分化3d后，與同時(shí)點(diǎn)DMOG 0μmol·L-1組比較，其余3組mRNA相對(duì)表達(dá)量均增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。DMOG 20、40、80μmol·L-1這 3組間比較，DMOG 80μmol·L-1組 Collagen Ⅱ mRNA相對(duì)表達(dá)量最高，與另外兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

誘導(dǎo)分化7d時(shí)，與同時(shí)點(diǎn)DMOG 0μmol·L-1組比較，DMOG 20μmol·L-1組 Collagen Ⅱ mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著增加（P＜0.01），DMOG 40、80μmol·L-1組表達(dá)量則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。DMOG 20、40、80μmol·L-1這 3 組間比較，DMOG 20μmol·L-1組CollagenⅡ mRNA相對(duì)表達(dá)量最高，與另外兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。說(shuō)明較低濃度（20、40μmol·L-1）DMOG 作用后，MSCs內(nèi) CollagenⅡ mRNA表達(dá)增加具有時(shí)間依賴(lài)性。見(jiàn)圖6C。

2.5.4 成神經(jīng)分化 成神經(jīng)分化基因檢測(cè)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化后各組MSCs均表達(dá)神經(jīng)元樣細(xì)胞標(biāo)志性分子 Nestin。與同時(shí)點(diǎn) DMOG 0μmol·L-1組比較，DMOG 20、40、80μmol·L-1這 3 組 Nestin 陽(yáng)性細(xì)胞率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），提示DMOG處理對(duì)MSCs成神經(jīng)分化能力無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖6D。

3 討論

圖6 DMOG對(duì)MSCs分化特異性基因表達(dá)的影響Fig.6 Effects of DMOG on differentiation specific genes of MSCs

MSCs動(dòng)員即采用動(dòng)員措施或動(dòng)員劑促使骨髓中MSCs釋放并遷移到外周血，參與損傷修復(fù)、組織再生等[12]。在組織損傷的第一時(shí)間，給予一定的動(dòng)員措施，可使MSCs在短時(shí)間內(nèi)從骨髓跨越細(xì)胞及血管進(jìn)入外周循環(huán)池，進(jìn)一步遷移、歸巢進(jìn)入損傷部位，參與組織修復(fù)。正常生理狀態(tài)下，人體外周循環(huán)中的MSCs含量極低[13]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體在應(yīng)激、損傷、燒傷等病理狀態(tài)下，可發(fā)生MSCs內(nèi)源性動(dòng)員[14]。Rochefort等[15]發(fā)現(xiàn)慢性缺氧可使大鼠周?chē)h(huán)中MSCs數(shù)量顯著增加。本課題組前期研究證實(shí)，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）受體阻斷劑AMD3100能提高外周血中的MSCs數(shù)量[12]，DMOG也可以動(dòng)員ICR小鼠和SD大鼠的MSCs進(jìn)入外周血[10,16]。DMOG作為一種小分子酮戊二酸類(lèi)似物，通過(guò)與內(nèi)源性2-酮戊二酸競(jìng)爭(zhēng)，從而抑制脯氨酸羥化酶，可作為高效安全的低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）穩(wěn)定劑，且對(duì)動(dòng)物及人類(lèi)均無(wú)毒性[17]。Kelly等[18]研究發(fā)現(xiàn)，DMOG有利于心腦血管疾病的治療。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，DMOG對(duì)MSCs具有動(dòng)員作用，其機(jī)制是通過(guò)穩(wěn)定HIF-1表達(dá)，從而調(diào)控其下游血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）與 SDF-1α 的表達(dá)，從而發(fā)揮 MSCs動(dòng)員作用[10]。

本研究以不同濃度DMOG處理MSCs，濃度20μmol·L-1時(shí)促進(jìn) MSCs增殖，濃度達(dá)到 40μmol·L-1時(shí)促進(jìn)作用最明顯。有研究發(fā)現(xiàn)，重組Wnt3a、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin-like growth factors-1，IGF-1）聯(lián)合 AMD3100、氯化鋰（lithium chloride，LiCl）等藥物均可動(dòng)員MSCs進(jìn)入外周血，并促進(jìn)其增殖和分化[19-21]。在本研究中，DMOG處理可以提高M(jìn)SCs中S期+G2/M期的細(xì)胞比例，且3個(gè)濃度組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究報(bào)道指出，細(xì)胞周期的調(diào)控主要有外源性調(diào)控和內(nèi)源性調(diào)控兩種，外源性調(diào)控來(lái)源于細(xì)胞因子及一些外界刺激的作用[22]。筆者推測(cè)，DMOG作為一種外源性調(diào)控因素，其促進(jìn)MSCs增殖可能是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

細(xì)胞遷移是細(xì)胞歸巢的重要機(jī)制，也是影響干細(xì)胞動(dòng)員的主要因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)，DMOG可促進(jìn)MSCs遷移能力，且 DMOG 20μmol·L-1時(shí)促遷移作用更為顯著。Marchbank 等[23]研究發(fā)現(xiàn) 6.25～25μmol·L-1的DMOG能促進(jìn)人HT29細(xì)胞的遷移能力，并呈劑量依賴(lài)性，其中25μmol·L-1促遷移活性最強(qiáng)；隨著DMOG濃度增加，對(duì)細(xì)胞遷移則呈現(xiàn)抑制作用。

本研究研究發(fā)現(xiàn)，20～80μmol·L-1范圍內(nèi)，低濃度DMOG可上調(diào)成骨細(xì)胞特異性基因Bglap基因表達(dá)，高濃度則會(huì)下調(diào)Bglap基因表達(dá)。隨誘導(dǎo)時(shí)間增加，DMOG對(duì)Pparg2的下調(diào)作用逐漸明顯；而隨給藥濃度增加，Pparg2轉(zhuǎn)錄活性逐漸降低。隨濃度增加，DMOG促進(jìn)MSCs成軟骨分化的作用在一定程度上減弱。DMOG處理后MSCs仍保留了原有的成神經(jīng)分化能力，不同濃度的DMOG對(duì)MSCs成神經(jīng)分化能力無(wú)顯著促進(jìn)或抑制作用。

有學(xué)者認(rèn)為，MSCs成骨分化和成脂分化的過(guò)程不是彼此孤立的，而是存在著相互制約的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系，誘導(dǎo)成骨分化過(guò)程中DMOG可能通過(guò)激活MSCs中Wnt/β-catenin信號(hào)通路從而抑制其成脂分化過(guò)程，進(jìn)而下調(diào)成脂分化轉(zhuǎn)錄因子Pparg2的表達(dá)[24-26]。許多調(diào)控機(jī)制對(duì)兩者也具有正反向調(diào)控作用[27-28]。Taipaleenmaki等[29]認(rèn)為易于成骨的MSCs亞群Wnt信號(hào)基因高表達(dá)，而易于發(fā)生成脂分化的MSCs亞群則高表達(dá)Wnt通路抑制因子分泌型卷曲相關(guān)蛋白-1（secreted frizzled-related proteins，sFRP-1）。而Vanella等[30]研究發(fā)現(xiàn)，眾多調(diào)節(jié)因子可使MSCs由成骨分化鏈轉(zhuǎn)化為脂肪分化鏈，進(jìn)而抑制其成骨分化。本課題組前期研究證實(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)大鼠MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化有重要調(diào)節(jié)作用[31]。因此，DMOG干預(yù)后，MSCs的成骨分化、成脂分化以及成神經(jīng)分化之間是否通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相互影響尚有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，不同濃度DMOG處理后，可顯著提高M(jìn)SCs增殖、遷移能力，但對(duì)其多項(xiàng)分化能力產(chǎn)生不同的影響。其中20μmol·L-1DMOG可促進(jìn)MSCs成骨和成軟骨分化能力，抑制其成脂分化能力，對(duì)其成神經(jīng)分化能力無(wú)明顯影響。