陳學智呂惠卿陳建治王一奇溫成平

1.浙江中醫(yī)藥大學 杭州 310053 2.景寧縣人民醫(yī)院

痛風是因嘌呤代謝紊亂，血尿酸生成增多和（或）腎臟排泄尿酸減少，導致尿酸鈉（monosodium urate，MSU）晶體沉積，從而引起的一種難治愈、易復發(fā)的疾病。研究證實，MSU刺激Nod樣受體蛋白3（Nodlike receptor pyrin domain containing 3，NLRP3）炎性體活化可激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-l（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1），促使白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）分泌，導致痛風性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作。因此，NLRP3炎性體是痛風發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。

畬藥是畬族人民幾千年實踐經(jīng)驗總結(jié)的傳統(tǒng)民族醫(yī)藥，在防治風濕、跌打損傷、黃疸性肝炎、骨髓炎等疾病方面有諸多祖?zhèn)髅胤胶徒?jīng)驗方，已成為祖國醫(yī)藥寶庫的一個重要組成部分[2]。長期居住在中國東南部山區(qū)的畬族人民通常采用三腳風爐防治痛風。三腳風爐屬于畬藥中的習用藥材，為傘形科茴芹屬植物條異葉回芹（Primpinellae diversifoliae）的干燥全草，又名八月白，具有散瘀止血、活血止痛、除濕解毒等功效，收載于《浙江省中藥炮制規(guī)范》[3-4]。筆者團隊前期研究證實三腳風爐具有較強的抗炎鎮(zhèn)痛作用[5-6]。為進一步開發(fā)利用畬藥資源，本文通過研究三腳風爐水提物（Primpinellae diversifoliae water extracts，PDW）對痛風性關(guān)節(jié)炎大鼠NLRP3炎性體及炎癥因子IL-1β和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的影響，擬探討三腳風爐治療痛風性關(guān)節(jié)炎的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性SPF級SD大鼠24只，體質(zhì)量（200±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號[SYXK（浙）2013-0184]。根據(jù)實驗室動物護理和使用指南，動物分組分籠，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（20±2）℃，相對濕度為（50±5）%，標準飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.2 藥物和主要試劑 三腳風爐采自麗水市景寧縣，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學陳孔榮副教授鑒定為傘形科茴芹屬植物條異葉回芹（Primpinellae,diversifoliae）的干燥全草，加水浸泡回流提取，合并兩次濾液，旋蒸濃縮凍干得PDW，臨用前配制成500mg·kg-1的溶液。RNA提取試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix購于 Takara公司（批號：RR036A）；SYBR Premix EX TaqTMⅡ購于 Takara公司（批號：RR820B）；IL-1β 和TNF-α試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司（批號：160312、171204）；美洛昔康購于華東大藥房（批號：170218）；聚山梨酯80購于華東醫(yī)藥股份有限公司（批號：151229）；MSU為實驗室自行制備；實驗用水為Milli-Q超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 主要儀器 BS423S電子天平購于北京賽多利斯科學儀器有限公司；JY-04A多功能粉碎機購于浩瀚工貿(mào)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；多功能酶標儀為美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；5417R高速離心機和PCR儀為德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 動物模型制作及分組

1.4.1.1 MSU混懸液的制備 準確稱取尿酸4.0g，置于800mL沸水中，加入0.5mol·L-1氫氧化鈉9mL，調(diào)整pH至8.9。用玻璃棒攪拌，加熱至渾濁溶液變成清亮，室溫冷卻后過夜，過濾得MSU混懸液，經(jīng)70℃干燥箱烘干，180℃高溫滅菌。臨用時稱取250mg MSU，加入9mL無菌0.9%氯化鈉溶液，再加入1mL聚山梨酯80，加熱攪拌，配成10mL MSU混懸液備用。

1.4.1.2 動物分組及給藥 將大鼠分為正常對照組、模型組、美洛昔康組和PDW組，每組6只。正常對照組和模型組大鼠以同體積0.9%氯化鈉溶液灌胃，美洛昔康組以美洛昔康（3mg·kg-1）灌胃，PDW組以PDW（500mg·kg-1）灌胃，2 次/d，連續(xù) 7d。美洛昔康和PDW的劑量選擇參考預(yù)實驗。第7天灌胃給予受試物1h后造模。正常對照組大鼠右后足踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.9%氯化鈉溶液0.2mL，其余各組注射MSU混懸液0.2mL。

1.4.1.3 急性痛風性關(guān)節(jié)炎模型制作 參照文獻[6]復制急性痛風性關(guān)節(jié)炎模型。受試大鼠麻醉后選右后足踝關(guān)節(jié)外側(cè)后方為穿刺點，針口斜面朝前上方與脛骨成45°夾角刺入踝關(guān)節(jié)腔，以6號注射針向關(guān)節(jié)腔一次性注入MSU混懸液0.2mL，注射部位出現(xiàn)明顯腫脹表示建模成功。

1.4.2 檢測指標

1.4.2.1 踝關(guān)節(jié)腫脹情況測量 各組大鼠在造模前以游標卡尺測量右后足踝關(guān)節(jié)下0.5mm處的直徑，造模后5、24、30、48h，在原部位以相同方法測量，比較致炎前后踝關(guān)節(jié)腫脹情況。

1.4.2.2 Real-time PCR 檢測 NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表達 造模48h后將大鼠斷頸處死，快速分離大鼠受試側(cè)踝關(guān)節(jié)及周圍軟組織，將組織剪碎，在碾缽中加入液氮，進一步將組織研磨成粉末，按照RNA提取試劑盒說明書提取RNA，然后分別根據(jù)基因庫中 mNLRP3、mASC、mcaspase-1和 mβ-actin 核苷酸序列設(shè)計引物，委托生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列見表1。將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA后，使用SYBR GreenⅠ實時定量PCR對上述mRNA表達量進行檢測。反應(yīng)結(jié)束后分析基因擴增的Ct值，以β-actin為內(nèi)參，計算目的基因相對表達量2-ΔΔCT，計算公式如下：△CT=目的基因CT值-內(nèi)參基因CT值，ΔΔCT=ΔCT實驗組-ΔCT對照組。PCR產(chǎn)物擴增的特異性通過熔解曲線進行分析，以消除引物二聚體等副反應(yīng)產(chǎn)物的影響。反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃1min，變性 95℃ 10s，退火 58℃ 10s，延伸 72℃ 10s，共40個循環(huán)，最后72℃延伸5min。每個標本檢測3個復孔。

1.4.2.3 大鼠血清中IL-1β和TNF-α含量的測定造模48h后，大鼠處死前眼眶取血，靜置析出血清后，4℃、1 000r/min離心10min。取上清液，嚴格按照試劑盒說明進行操作，以ELISA法檢測IL-1β和TNF-α含量。各孔用酶標儀在450nm測定OD值，用試劑盒標準品制作標準曲線，根據(jù)樣品吸光值計算IL-1β和INF-α含量。

表1 引物序列Tab.1 Primer Sequences

1.5 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用Graphpad Prism 5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹情況比較 模型組大鼠右后足踝關(guān)節(jié)發(fā)生腫脹，在造模24h后達峰值。踝關(guān)節(jié)直徑造模前為（7.08±0.29）mm，造模 24h為（11.29±0.34）mm，48h 為（9.42±0.26）mm，提示急性痛風性關(guān)節(jié)炎模型建模成功。與模型組比較，美洛昔康組給藥后5、24、30、48h大鼠踝關(guān)節(jié)直徑均小于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；PDW 組給藥后 5、24、30、48h能明顯減輕大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹，踝關(guān)節(jié)直徑小于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，P＜0.05）。與美洛昔康組比較，PDW組踝關(guān)節(jié)腫脹直徑差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖 1。

圖1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)直徑比較Fig.1 Comparison of ankle joint diameters of all groups

2.2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表達比較 與正常對照組比較，模型組NLRP3、ASC、caspase-1的 mRNA 表達顯著升高 （P＜0.001）；與模型組比較，美洛昔康組 NLRP3、ASC、caspase-1 的 mRNA 表達量下降（P＜0.001，P＜0.01），PDW組NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA表達也明顯下降（P＜0.001，P＜0.01）。與美洛昔康組比較，PDW 組NLRP3的mRNA表達量高于美洛昔康組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但兩組間ASC和caspase-1的mRNA表達差異沒有統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表達比較Tab.2 Comparison of mRNA expression of NLRP3,ASC and caspase-1 in ankle joint of each group

2.3 各組大鼠血清IL-1β和TNF-α含量比較 與正常對照組比較，模型組大鼠炎癥因子IL-1β和TNF-α含量均增高（P＜0.001）。與模型組比較，美洛昔康組IL-1β 和 TNF-α 含量明顯減低（P＜0.001）；PDW 組IL-1β和TNF-α含量也明顯低于模型組（P＜0.001，P＜0.01）；但均高于美洛昔康組（均 P＜0.05）。見表 3。

表3 各組大鼠血清IL-1β和TNF-α含量比較（pg·mL-1）Tab.3 Comparison of content of IL-1β and TNF-α in serum of each group

3 討論

隨著經(jīng)濟發(fā)展和生活方式改變，痛風患病率逐年上升，現(xiàn)已成為沿海一帶的常見病[7]?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，痛風是因嘌呤代謝紊亂，導致血尿酸生成增多和（或）腎臟排泄尿酸減少，從而引起的一種難治愈、易復發(fā)的代謝性疾病。痛風性關(guān)節(jié)炎多呈間歇性發(fā)作，發(fā)作時常見大關(guān)節(jié)紅腫熱痛，病情纏綿難愈。目前，臨床治療痛風急性發(fā)作首選非甾體類抗炎藥如美洛昔康、依托考昔等，其次選用秋水仙堿，上述藥物控制不佳時選用糖皮質(zhì)激素。但以上藥物具有較為明顯的副作用，如非甾體抗炎藥容易引起胃腸道潰瘍或出血、腎功能不全；秋水仙堿容易引起腹瀉等，影響患者的依從性。畬藥三腳風爐用于防治痛風有其獨特的優(yōu)勢，具有耐藥性低、副作用少、藥源豐富、價格低廉且作用靶點多等特點，標本兼治、防治并舉。

NLRP3炎性體又名嗜中性白細胞堿性磷酸酶3（neutrophilic alkaline phosphatase3，NALP3） 炎性體，是一種大分子蛋白復合體，由NLRP3蛋白、ASC和caspase-l組成，是目前研究最多的炎性體，在炎癥反應(yīng)和天然免疫中起重要作用。最新研究成果認為，痛風急性發(fā)作與NLRP3炎性體的活化密切相關(guān)，MSU在關(guān)節(jié)部位的沉積導致NLRP3炎性體的活化，引起炎癥因子的釋放，如IL-1β、TNF-α、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）等，引起炎癥反應(yīng)發(fā)生，是急性痛風性關(guān)節(jié)炎發(fā)作的重要原因[8-9]，可見，NLRP3炎性體是調(diào)節(jié)IL-1β和TNF-α的上游關(guān)鍵蛋白。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，PDW組給藥后5、24、48h能夠明顯抑制踝關(guān)節(jié)腫脹，且能明顯下調(diào)大鼠踝關(guān)節(jié)致炎部位NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA表達，降低血清IL-1β和TNF-α含量。與美洛昔康組比較，PDW組踝關(guān)節(jié)直徑無統(tǒng)計學差異，且ASC和caspase-1的mRNA表達差異也無統(tǒng)計學意義，由此推測三腳風爐抗痛風性關(guān)節(jié)炎可能通過抑制NLRP3炎性體的活化，阻止IL-1β和TNF-α炎癥介質(zhì)的分泌，從而減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮其抗痛風作用，且與美洛昔康作用效果接近。

三腳風爐為畬族習用藥材，長期流傳于畬族民間，治療痛風具有較好的臨床療效，能顯著減少痛風關(guān)節(jié)炎發(fā)作次數(shù)，因其副作用少和耐藥性低，在痛風急性發(fā)作期緩解關(guān)節(jié)腫痛方面具有其獨特的開發(fā)利用價值，本文通過研究三腳風爐對NLRP3炎性體及炎癥因子的影響，初步闡明了其抗痛風關(guān)節(jié)炎作用機制，為畬藥治療痛風提供了實驗依據(jù)。