周曼莉，周學(xué)章，周玉成，張海威，喬連江，楊艷玲

布魯菌病(Brucellosis)是一種由布魯菌(Brucella)引起的人獸共患傳染病，簡稱布病。根據(jù)致病性和宿主特異性，將布魯菌分為6個種 20個生物型[1]。近年來，隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，布魯菌病疫情呈逐年上升趨勢，對養(yǎng)殖業(yè)和人類健康造成嚴(yán)重威脅。流行病學(xué)調(diào)查顯示，羊種布魯菌的侵襲力和致病力最強，最易引起人類布魯菌病的暴發(fā)和流行[2]，并且90%以上的致病菌均為羊種布魯菌[3-5]。布魯菌感染后引起宿主產(chǎn)生明顯的體液免疫反應(yīng)，主要是針對布魯菌表面的LPS產(chǎn)生抗體，這也是血清學(xué)檢測的依據(jù)。同時，LPS是布病重要的診斷抗原，也是布魯菌重要的毒力因子[6]。由此可見，LPS的深入研究對尋找有效的疫苗靶標(biāo)、設(shè)計構(gòu)建減毒活菌苗[7]，以及開發(fā)有效的診斷試劑，建立新型快速診斷方法具有重大意義。在目前的研究中，人們多使用牛種布魯菌或者是疫苗株來提取布魯菌LPS[8-11]，但這些LPS對檢測羊種布魯菌還存在局限性。目前，豬種布魯菌、牛種布魯菌以及羊種布魯菌是對畜牧業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重危害的主要布魯菌種。因此，篩選有效的布魯菌單克隆抗體為實現(xiàn)我國家畜布病徹底凈化提供必要的技術(shù)保障。

本試驗旨在通過提取羊種布魯菌16M LPS，制備效價高、反應(yīng)原性強、敏感性高、應(yīng)用范圍廣的單克隆抗體，擬為后續(xù)研究單克隆抗體的特性及建立布魯菌快速病原及抗體診斷方法奠定實驗基礎(chǔ)，同時為研制布病臨床快速檢測產(chǎn)品提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及菌種

1.1.1選取8只20 g左右，6～8周齡SPF級雌性Balb/c小鼠，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所實驗動物房，免疫小鼠及陰性對照小鼠于相同條件飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境良好，飼養(yǎng)過程中Balb/c小鼠精神狀態(tài)良好。

1.1.2羊種布魯菌16M為軍事獸醫(yī)研究所保藏饋贈，SP2/0細(xì)胞、小鼠來源的巨噬細(xì)胞系RAW264.7為本實驗室保存；大腸桿菌O157裂解抗原、雞沙門氏菌裂解抗原、福氏志賀菌全菌、鴨源雞桿菌1-S脂多糖由吉林檢驗檢疫局技術(shù)中心微生物實驗室提供。

1.2主要試劑 陽性血清(抗羊種布魯菌16M小鼠血清)來自長春軍事獸醫(yī)研究所；陰性血清(正常小鼠血清)為實驗室自制；布魯氏菌A、M單因子血清 (針對于羊布魯氏菌O鏈M抗原和牛布魯氏菌O鏈A抗原的血清抗體)購自廣州宜康生物科技有限公司；布魯菌試管凝集抗原購自北京中海生物公司；HAT、HT、山羊抗鼠IgG/HRP均為SIGMA公司產(chǎn)品；PEG1500為Roche公司產(chǎn)品；新生牛血清由GIBCO公司生產(chǎn)；包被抗體、各型亞類二抗均為Southern Biotech公司產(chǎn)品；TMB、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒為碧云天公司產(chǎn)品；銀染試劑盒為索萊寶公司產(chǎn)品；LPS定量檢測試劑盒為上海潤裕生物有限公司產(chǎn)品；石蠟油為西格瑪奧德里奇(上海貿(mào)易有限公司)產(chǎn)品；

1.3免疫原制備 參考文獻(xiàn)[12]，采用酚水法提取羊種布魯菌16M的LPS。取菌液離心，收沉淀。將蒸餾水，水飽和酚加入沉淀中，水浴，4 ℃冷卻并離心8 h。收酚層和水層，透析至無酚味后，凍干。用水溶解，將含1%飽和醋酸鈉的冷甲醇加入粗提取的LPS中，至加入LPS體積的3倍， 4 ℃于冰箱搖轉(zhuǎn)2 h。收沉淀，重復(fù)1次上述離心操作后，加滅菌純水溶解沉淀。使用脂多糖定量檢測試劑盒檢測LPS濃度，按照文獻(xiàn)[13]介紹的方法配制8%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，并根據(jù)銀染試劑盒說明書進(jìn)行銀染顯色鑒定LPS純度。

1.4Balb/c小鼠的免疫 參照文獻(xiàn)[14]免疫小鼠。取LPS 60 μg與等量的弗氏完全佐劑混合，對4只編號為1、2、3、4的雌性Balb/c小鼠皮下多點注射進(jìn)行初次免疫，兩周后取LPS 30 μg與等量的弗氏不完全佐劑混合進(jìn)行加強免疫。對免疫好的Balb/c小鼠進(jìn)行尾靜脈采血，于37 ℃放置1 h后4 ℃過夜，收集血清。參考文獻(xiàn)[15]進(jìn)行間接ELISA方法檢測免疫血清效價，并設(shè)空白對照和陰性對照。最終確定可以與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合的Balb/c小鼠，取LPS 50 μg進(jìn)行腹腔注射免疫。

1.5細(xì)胞融合 根據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法，進(jìn)行細(xì)胞融合。取正常小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞，加入預(yù)溫的選擇培養(yǎng)基HAT。37 ℃條件下，在PEG1 500的作用下進(jìn)行細(xì)胞融合。加入無血清的IMDM終止融合，離心，加入新生牛血清及準(zhǔn)備好的胸腺細(xì)胞，加入半固體培養(yǎng)基中，混勻，倒入培養(yǎng)皿中，放入孵箱培養(yǎng)。

1.6雜交瘤細(xì)胞篩選 將融合后的細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，用2 μg/mL 的“LPS”包板，吸取有雜交瘤細(xì)胞生長的細(xì)胞孔的培養(yǎng)上清，采用上述間接ELISA方法進(jìn)行篩選。陰性對照為SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清、空白對照為PBS、陽性對照為陽性血清用PBS稀釋100倍。篩選共進(jìn)行兩次。加入終止液，將96孔板于雙波長(450 nm，630 nm)處測定吸光值。

1.7腹水制備及純化 取石蠟油500 μL腹腔注射10周齡Balb/c小鼠。給Balb/c小鼠注射陽性雜交瘤細(xì)胞5×105～9×105個。待Balb/c小鼠腹腔明顯膨大后，將采集的腹水于5 000 r/min離心10 min，取上清。根據(jù)文獻(xiàn)[17]的方法，將上清使用ProteinA柱進(jìn)行純化。將上清稀釋并離心，使用0.22 μm濾膜過濾。用10倍柱體積的偶聯(lián)緩沖液平衡柱子，保持流速為1 mL/min。上樣，保持相同流速，收集液體。再使用5倍柱體積偶聯(lián)緩沖液過柱，等量洗脫液洗脫抗體。調(diào)整pH，使用PBS過夜透析抗體。將抗體分裝凍存。

1.8 單克隆抗體的鑒定

1.8.1免疫效價檢測 對4只免疫好的Balb/c小鼠進(jìn)行尾靜脈采血，采用上述間接ELISA法檢測其免疫血清。將收集的已免疫的Balb/c小鼠血清用樣品稀釋液從200倍開始2倍梯度稀釋，空白對照為PBS，陰性對照為陰性血清200倍稀釋。選擇免疫效價高，精神狀態(tài)好的Balb/c小鼠做后續(xù)細(xì)胞融合實驗。

1.8.2單克隆抗體親和常數(shù)及效價檢測 采用上述間接ELISA方法，將兩株單克隆抗體用樣品稀釋液從200倍開始進(jìn)行2倍梯度稀釋，檢測其親和常數(shù)及效價。

1.8.3單克隆抗體亞類鑒定 用PBS將抗體稀釋至0.5 μg/mL，4 ℃過夜。加入封閉液，37 ℃孵育2 h。加入雜交瘤細(xì)胞上清，37 ℃孵育1 h。加入用封閉液1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h。加入底物，于雙波長(450 nm，630 nm)測定吸光值。

1.8.4單克隆抗體純度檢測 按照上述方法，對獲得的兩株單克隆抗體進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳(12%分離膠)，檢測抗體純度。

1.8.5 特異性檢測

1.8.5.1交叉反應(yīng)性試驗 參照上述方法，采用間接ELISA方法檢測單克隆抗體與部分細(xì)菌的交叉反應(yīng)以評價單克隆抗體的特異性。將羊種布魯菌16M標(biāo)準(zhǔn)株與大腸桿菌O157裂解抗原、雞沙門氏菌裂解抗原、福氏志賀菌全菌、鴨源雞桿菌1-S脂多糖作為抗原包被酶標(biāo)板，檢測篩選的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清。反應(yīng)后測定每孔的OD450值，觀察這2株雜交瘤細(xì)胞上清是否與其他菌株反應(yīng)。

1.8.5.2間接免疫熒光試驗 參照文獻(xiàn)[18]的實驗方法，采用間接免疫熒光的實驗方法，將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7鋪板培養(yǎng)過夜。給實驗孔每孔加入細(xì)胞數(shù)量100倍的羊種布魯菌16M、豬種布魯菌S2、牛種布魯菌2308感染細(xì)胞5 h。加入含100 μg/mL的慶大霉素培養(yǎng)基作用2 h，于37 ℃培養(yǎng)。加入80%預(yù)冷丙酮固定細(xì)胞。加入Triton X-100室溫?fù)u床。加入一抗(陽性雜交瘤細(xì)胞上清，1∶4稀釋)，孵育1 h。加入FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶50稀釋)，避光孵育1 h。用熒光顯微鏡觀察。

1.8.5.3布魯菌A、M因子血清凝集試驗 取兩種單抗各30 μL，加入等量的LPS進(jìn)行玻片凝集試驗。再取經(jīng)滅菌純水溶解的布魯菌A、M因子血清30 μL，加入等量的LPS進(jìn)行玻片凝集試驗。以5 min內(nèi)出現(xiàn)凝集判為陽性。以此來判斷制備的單抗可以識別的抗原位點。

1.8.5.4試管凝集試驗 按照1∶12.5，1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800的比例稀釋制備的LPS單克隆抗體Anti-A-LPS:5和Anti-A-LPS:10。在每管中加入1∶20稀釋的布魯菌試管凝集抗原500 μL，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h后觀察結(jié)果。設(shè)置PBS為空白對照。

2 結(jié) 果

2.1免疫原制備 將提取的羊種布魯菌16M的LPS進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，并銀染顯色，使用脂多糖定量檢測試劑盒檢測LPS的濃度。結(jié)果顯示，用酚水法提取得到的LPS條帶清晰明顯，無其他雜帶，其濃度為1 mg/mL。表明其純度較高，濃度可以達(dá)到繼續(xù)后續(xù)實驗的要求。

1:蛋白Marker； 2：羊種布魯菌16M LPS圖1 布魯菌16M的LPS電泳銀染結(jié)果Fig.1 Silver-stined SDS-polyacrylamide gels B. melitensis 16M LPS

2.2免疫Balb/c小鼠效價檢測 采用間接ELISA方法對免疫的Balb/c小鼠抗體效價進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示：1號Balb/c小鼠的免疫血清效價為1∶3 200；2號Balb/c小鼠的免疫血清效價為1∶1 600；3號Balb/c小鼠的免疫血清效價為1∶1 600；4號Balb/c小鼠的免疫血清效價為1∶6 400；因此，取50 μg純化好的LPS對4號Balb/c小鼠進(jìn)行腹腔注射免疫，選取免疫好的4號Balb/c小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0 細(xì)胞進(jìn)行融合。檢測結(jié)果如表1及圖2所示。

圖2 免疫Balb/c小鼠抗體效價ELISA檢測結(jié)果Fig.2 Antibody titers in immunized mice by ELISA

2.3雜交瘤細(xì)胞篩選 用純化的LPS包板，采用間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，最終得到2株能穩(wěn)定分泌抗布魯菌16M LPS的陽性雜交瘤細(xì)胞株，命名為Anti-A-LPS：5和Anti-A-LPS：10。檢測結(jié)果見表2。

表1 免疫Balb/c小鼠抗體效價ELISA檢測結(jié)果
Tab.1 ELISA test results of antibody titer of immunized Balb/c mice

稀釋倍數(shù)200400800160032006400128002560051200102400空白陰性LPS-11.4321.3161.1120.9010.6120.3880.2450.1300.0910.0610.0220.059LPS-21.4221.2180.9240.7110.4150.2580.1660.1010.0620.0460.0290.050LPS-31.4831.2370.9730.7680.5000.3070.1940.1160.0820.0490.0260.048LPS-41.5081.4371.2841.1260.8950.6730.4590.2910.1820.1130.0180.059

注：數(shù)據(jù)為ELISA OD(450 nm，630 nm)值

表2 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測結(jié)果
Tab.2 Hybridoma cell culture supernatant test results

細(xì)胞株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測結(jié)果陽性對照陰性對照空白對照Anti-A-LPS:50.8650.4210.0410.033Anti-A-LPS:101.10.5480.0370.029

注：數(shù)據(jù)為ELISA OD(450 nm，630 nm)值

2.4單克隆抗體親和常數(shù)及效價檢測 將制備出的兩株單克隆抗體從200倍開始進(jìn)行2倍梯度稀釋，采用間接ELISA方法檢測其親和常數(shù)及效價。結(jié)果顯示，Anti-A-LPS：5和Anti-A-LPS：10的親和常數(shù)分別為1.12×109和1.11×109，效價分別為1∶6 400和1∶12 800。表明其效價高。檢測結(jié)果見表3及圖3。

表3 單克隆抗體親和常數(shù)及效價檢測結(jié)果
Tab.3 Affinity constants and titers of monoclonal antibodies

稀釋倍數(shù)Dilution factor200400800160032006400128002560051200102400204800空白效價Anti-A-LPS:51.3151.1851.0980.9540.8470.6960.5300.2750.0660.0440.0310.0016400Anti-A-LPS:101.2571.2221.2121.2141.1070.9840.8880.6530.5660.5190.3830.02712800

注：數(shù)據(jù)為ELISA OD(450 nm，630 nm)

圖3 單克隆抗體親和常數(shù)及效價檢測結(jié)果Fig.3 Affinity constant and titer test results of monoclonal antibodies

2.5單克隆抗體亞類鑒定 將純化的兩株單克隆抗體按照1.8.2方法進(jìn)行亞類鑒定。結(jié)果顯示，兩株單克隆抗體分別為IgG3和IgG1，輕鏈類型均為κ型。檢測結(jié)果見表4。

表4 單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果
Tab.4 Identification results of monoclonal antibody subclasses

編號Anti-A-LPS:5Anti-A-LPS:10IgG30.4930.022IgG10.0320.433κ0.1040.095

注：數(shù)據(jù)為ELISA OD(450 nm，630 nm)值

2.6單克隆抗體純度檢測 通過SDS-PAGE凝膠電泳對收腹水純化后的兩株單克隆抗體進(jìn)行純度檢測。結(jié)果顯示，兩株單克隆抗體均在55 kD和25 kD左右處出現(xiàn)明顯條帶，分別單克隆抗體的重鏈和輕鏈，凝膠上無其他雜帶。表明本試驗獲得的這兩株單克隆抗體純度較高，無其他雜蛋白。結(jié)果見圖4。

2.7 特異性檢測

1：Anti-A-LPS：5；2：Anti-A-LPS：10；3：Marker圖4 單克隆抗體SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-PAGE map of monoclonal antibodies

2.7.1交叉反應(yīng)性試驗 通過ELISA方法對單克隆抗體的特異性進(jìn)行檢測。從實驗結(jié)果可見，本實驗獲得的兩株雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體上清與大腸桿菌O157裂解抗原、雞沙門氏菌裂解抗原、福氏志賀菌全菌、鴨源雞桿菌1-S脂多糖不發(fā)生反應(yīng)，均呈現(xiàn)陰性，只與滅活的羊種布魯菌16M裂解抗原發(fā)生反應(yīng)，呈現(xiàn)陽性。表明本試驗獲得的兩株單克隆抗體特異性強。試驗結(jié)果見表5。

表5 5種不同菌株與兩株雜交瘤細(xì)胞上清反應(yīng)結(jié)果
Tab.5 Results of reaction between five different strains and two hybridoma cell supernatants

雜交瘤細(xì)胞上清菌株種類和實驗結(jié)果大腸桿菌O157裂解抗原羊布魯菌裂解抗原雞白痢沙門氏菌裂解抗原鴨源雞桿菌1-S脂多糖抗原福氏志賀菌裂解抗原Anti-A-LPS:50.1320.7820.0910.0770.094Anti-A-LPS:100.0831.0260.1150.0650.069

注：數(shù)據(jù)為ELISA OD(450 nm，630 nm)值

2.7.2間接免疫熒光試驗 通過間接免疫熒光方法對篩選出的兩株單克隆抗體進(jìn)行一抗孵育1 h的效果評價試驗。結(jié)果顯示，兩株單克隆抗體在1 h內(nèi)均能與羊種布魯菌16M、豬種布魯菌S2、牛種布魯菌2308結(jié)合，且結(jié)合效果較好。結(jié)果見圖5。

A：Anti-A-LPS：5與16M反應(yīng)；B: Anti-A-LPS：10與16M反應(yīng)；C：Anti-A-LPS：5的陰性對照；D：Anti-A-LPS：10的陰性對照；E: Anti-A-LPS：5與S2反應(yīng)；F:Anti-A-LPS：5與2308反應(yīng)；G:Anti-A-LPS：10與S2反應(yīng)；H：Anti-A-LPS：10與2308反應(yīng)；I：Anti-A-LPS：5的陰性對照；J：Anti-A-LPS：10的陰性對照圖5 單克隆抗體間接免疫熒光試驗結(jié)果Fig.5 Indirect immunofluorescence test of monoclonal antibody

2.7.3布魯菌A、M因子血清凝集試驗 通過將LPS分別與兩株單抗及布魯菌A、M因子血清進(jìn)行玻片凝集試驗，以此來判斷兩株單抗的特異性。實驗結(jié)果顯示，LPS分別與Anti-A-LPS：5和Anti-A-LPS：10兩株單抗發(fā)生凝集，同時與布魯菌A、M因子血清也發(fā)生凝集。表明制備的兩株單抗均可以識別布魯菌A、M抗原位點。結(jié)果見圖6。

圖6 布魯菌A、M因子血清凝集試驗結(jié)果Fig.6 Serum slide agglutination test of factor A and M of Brucella

2.7.4試管凝集試驗 試驗結(jié)果顯示，制備的兩株布魯菌LPS單克隆抗體均能與布魯菌試管凝集抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，并且敏感性高，稀釋至1∶800倍時依然可以發(fā)生明顯的凝集反應(yīng)。試驗結(jié)果如圖7所示。

圖7 單克隆抗體與試管凝集抗原反應(yīng)Fig.7 Monoclonal antibody reacts with tube agglutination antigen

3 討 論

光滑型布魯菌表面的LPS是布魯菌重要的毒力分子和抗原物質(zhì)。將平滑型布魯菌LPS合成所需酶的編碼基因進(jìn)行突變，就可以產(chǎn)生粗糙型的布魯菌突變株，并且使其毒力減弱，針對這一特點可以設(shè)計減毒活疫苗[19]。布魯菌LPS可逃避宿主免疫系統(tǒng)識別，這有利于布魯菌入侵宿主細(xì)胞并在胞內(nèi)生存[20]。布魯菌感染后引起宿主產(chǎn)生明顯的體液免疫反應(yīng)，然而最明顯且最持久的抗體還是針對布魯菌表面LPS而產(chǎn)生的。由于布魯菌表面的LPS是非典型的LPS，不同于其他革蘭氏陰性菌，因此針對它制備單抗進(jìn)行布魯菌病原或抗體檢測具有良好的檢測效果。所以，目前針對布魯菌抗體進(jìn)行檢測的產(chǎn)品大部分都是針對布魯菌LPS進(jìn)行設(shè)計研制的。如IDEXX的布魯菌抗體檢測試劑盒，以及國內(nèi)一些公司生產(chǎn)的膠體金快速抗體檢測卡等。

在單抗制備過程中，LPS的提取是比較關(guān)鍵的技術(shù)。由于LPS的提取難度較大，提取量較少，提取過程較復(fù)雜，因此本研究利用熱酚法提取了羊種布魯菌16M LPS，所得LPS收量較大，并且節(jié)約了提取時間。在其他研究中LPS的提取時間一般在5天以上，我們的研究中將時間縮短至3 d。采用SDS-PAGE分離后進(jìn)行銀染鑒定，結(jié)果顯示提取的LPS純度和濃度均較高。這是制備單克隆抗體的基本保障。

在我國布病的危害日益增加，因此，制備效價高、反應(yīng)原性強、敏感性高、應(yīng)用范圍廣的布魯菌LPS單克隆抗體對于布魯菌檢測及防控具有重要價值。本研究篩選鑒定了5株單克隆抗體，我們從中篩選了兩株反應(yīng)原性強的單抗進(jìn)行了免疫學(xué)驗證。通過免疫熒光試驗，布魯菌A，M因子血清凝集試驗及試管凝集試驗發(fā)現(xiàn)這兩株單抗均能發(fā)生免疫反應(yīng)，且其與大腸桿菌O157裂解抗原、雞沙門氏菌裂解抗原、福氏志賀菌全菌、鴨源雞桿菌1-S脂多糖均無免疫反應(yīng)。這一結(jié)果與王艷[21]研究結(jié)果相符。由于布魯菌的生存和增殖主要是在巨噬細(xì)胞中，因此我們選用羊種布魯菌16M、豬種布魯菌S2、牛種布魯菌2308感染巨噬細(xì)胞系RAW264.7，用制備的兩株單克隆抗體作為一抗進(jìn)行免疫熒光檢測。結(jié)果顯示，制備的兩株單抗均能與羊種布魯菌16M、豬種布魯菌S2、牛種布魯菌2308結(jié)合，這對于研制檢測布魯菌的診斷產(chǎn)品具有重要價值，這也是本研究具有的特殊意義。除此之外，我們還將LPS分別與兩株單克隆抗體及布魯菌A、M因子血清進(jìn)行玻片凝集試驗，最終確定獲得的兩株單克隆抗體均可以識別布魯菌A、M抗原位點。試管凝集試驗結(jié)果顯示，這兩株單克隆抗體均能與布魯菌試管凝集抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，而且兩株單克隆抗體的敏感性均可以達(dá)到1∶800，這個結(jié)果與其他研究結(jié)果相比，我們制備的單抗具有較好的敏感性。通過以上研究，我們成功地提取了羊種布魯菌16M LPS，同時篩選鑒定了兩株單克隆抗體，這兩株單克隆抗體均具有良好的親和效果，反應(yīng)原性及敏感性。為本實驗后續(xù)研究這兩株單克隆抗體的特性，建立布魯菌快速病原及抗體檢測方法及研制快速檢測產(chǎn)品奠定了良好的實驗基礎(chǔ)。

利益沖突：無