*

1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025

藍(lán)布正為薔薇科水楊梅屬植物柔毛路邊青GeumjaponicumThunb.var.chinense Bolle 的干燥全草，在我國(guó)苗族地區(qū)民間常用來(lái)治療頭痛頭暈。2015年版《中國(guó)藥典》[1]記載，具有益氣養(yǎng)血的作用，臨床上常用于氣血虧虛。藍(lán)布正對(duì)大腦缺血缺氧具有改善作用，能有效緩解血虛導(dǎo)致的眩暈癥狀，有改善對(duì)大腦供血供氧及耐眩暈的作用[2]。研究表明藍(lán)布正對(duì)血管性癡呆大鼠的神經(jīng)細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用[3-4]，能改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[5]。

阿爾茨海默癥，是以無(wú)意識(shí)的記憶力緩慢下降為主要臨床表現(xiàn)的一種進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[6]。隨著我國(guó)老齡化人口的增長(zhǎng)，阿爾茨海默癥的患病率逐年上升，據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，2010年中國(guó)的阿爾茨海默病患者數(shù)量已如中國(guó)的人口數(shù)躍居世界第一位，2015年世界阿爾茨海默癥報(bào)告顯示，到2050年全球老年癡呆患者從目前的4600萬(wàn)人增長(zhǎng)至1.315億人口[7]，并以低收入和中等收入國(guó)家發(fā)病率最為明顯[8]，而以拉丁美洲、中國(guó)、印度等國(guó)家的增長(zhǎng)幅度最高，將超過(guò)300%[8]。阿爾茨海默癥已成為患者和家庭的沉重負(fù)擔(dān)，給家庭和國(guó)家?guī)?lái)沉重的經(jīng)濟(jì)壓力。防治藥物嚴(yán)重缺乏以及藥物副反應(yīng)已成為各國(guó)家治療該病的挑戰(zhàn)，以此為目標(biāo)的新藥研究旨在減輕家庭及社會(huì)的經(jīng)濟(jì)壓力。筆者前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果觀察，藍(lán)布正在對(duì)血管癡呆的防治有一定的效果，以此來(lái)觀察是否對(duì)老年癡呆也有很好的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)KM雄性小鼠54只，體重約18～22 g，購(gòu)置重慶解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(軍)2012-0011。

1.2 藥品與試劑 藍(lán)布正(采集貴州產(chǎn)藍(lán)布正，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院鑒定實(shí)驗(yàn)室劉剛副教授鑒定為薔薇科水楊梅屬植物柔毛路邊青GeumjaponicumThunb. var. chinense Bolle)，吡拉西坦片(批號(hào)：717H016，杭州民生藥業(yè)有限公司)，D-半乳糖(批號(hào)：0902c052，BeiJing solarbio)，亞硝酸鈉(批號(hào)：170801，四川金山制藥有限公司)，TNF-α(批號(hào)：ab34674，abcam公司)，AKT抗體(批號(hào)：ab38449，abcam公司)。

1.3 儀器 Morris水迷宮(深圳瑞沃德生命科技有限公司)，KD-BM型包埋機(jī)(浙江金華科迪有限公司)，R-1010型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)，SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)，RM2245型石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)，XSZ-HS3型顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 老年癡呆小鼠模型的制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)2天，將54只小鼠進(jìn)行Morris水迷宮篩選，去除先天愚笨，游泳耐力很差的小鼠。經(jīng)水迷宮篩選后所有小鼠合格，未見(jiàn)先天愚笨及耐力差的小鼠。將合格小鼠隨機(jī)分為6組，正常對(duì)照組(I組)、模型對(duì)照組(II)、陽(yáng)性對(duì)照組(III)、藍(lán)布正高(IV)、中(V)、低(VI)劑量組。根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]制備AD模型小鼠。除正常對(duì)照組注射等體積生理鹽水，其余各組皮下注射D-半乳糖聯(lián)合腹腔注射亞硝酸鈉，造模的同時(shí)給予灌胃相應(yīng)藥物，除正常和模型對(duì)照組灌胃等體積生理鹽水，其余各組灌胃相應(yīng)藥物，共60 d。

1.4.2 morris水迷宮檢測(cè) 第61天進(jìn)行Morris水迷宮檢測(cè)，向Morris水迷宮內(nèi)灌水，水深剛好淹沒(méi)安全平臺(tái)1 cm，水溫保持在(24±1)℃。整個(gè)水迷宮分為4個(gè)象限，每個(gè)象限設(shè)有一個(gè)不同的標(biāo)志物供學(xué)習(xí)記憶。每次訓(xùn)練時(shí)，從平臺(tái)所在象限的正對(duì)象限內(nèi)的任意地點(diǎn)將小鼠放進(jìn)池中，投放小鼠時(shí)，使小鼠面向池壁。小鼠從下水到找到安全平臺(tái)的時(shí)間為逃避潛伏期，設(shè)為90 s，超過(guò)潛伏期未找到安全平臺(tái)者，則記為90 s。下水前3天進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，每天2次，第4天正式測(cè)試其逃避潛伏期，第5天撤出安全平臺(tái)，觀察其穿越安全平臺(tái)的次數(shù)。

1.4.3 免疫組化檢測(cè) Morris水迷宮完成的第2天，使用4%的水合氯醛0.1 mL/10g麻醉小鼠后，摘取大腦，用4%的多聚甲醛固定后，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片后進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。通過(guò)4個(gè)視野的積分吸光度IA平均值來(lái)反映炎癥因子TNF-α、AKT的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和用藥高、中劑量組逃避潛伏期顯著縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加(P<0.05)。各組小鼠游泳軌跡，與空白組相比，模型組小鼠游泳軌跡雜亂沒(méi)有秩序。見(jiàn)表1，如圖1所示。

組別劑量/g/kg逃避潛伏期/s穿越平臺(tái)次數(shù)/次Ⅰ組-48.06±27.566.00±2.40Ⅱ組-81.13±17.02△1.44±1.34i△△Ⅲ組0.850.00±32.93*4.11±1.91*Ⅳ組1051.96±28.22*4.11±2.47*Ⅴ組5.049.52±28.75*4.00±1.50*Ⅵ組2.557.39±29.93 2.89±2.28△△

注：與正常對(duì)照組比較(I組)比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型對(duì)照組(II組)比較，*P<0.05。

2.2 對(duì)腦組織海馬區(qū)TNF-α表達(dá)的影響 TNF-α陽(yáng)性顆粒呈棕黃色，主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。造模60天后，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠TNF-α表達(dá)顯著增高(P<0.01)，神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)欠清晰，表明D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉誘發(fā)小鼠腦組織炎癥損傷，成功建立了老年癡呆模型；與模型對(duì)照組比較，藍(lán)布正高劑量組TNF-α的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，表明高劑量藍(lán)布正提取物可提高抗炎癥損傷能力，改善小鼠腦組織損害狀況。見(jiàn)表2，如圖2所示。

2.3 對(duì)腦組織海馬區(qū)AKT表達(dá)的影響 AKT陽(yáng)性顆粒呈棕色或棕黃色，主要在細(xì)胞漿中表達(dá)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠AKT表達(dá)顯著增高(P<0.01)，神經(jīng)細(xì)胞排列松散，表明D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉可造成腦組織缺血缺氧，誘發(fā)小鼠腦組織炎癥損傷，成功建立了老年癡呆模型；與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、藍(lán)布正高、中、低劑量組AKT表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，表明高、中、低劑量藍(lán)布正提取物可提高抗炎癥損傷能力，改善小鼠腦組織損害狀況。表2，如圖3所示。

組別劑量/g/kgTNF-α/IAAKT/IAI組-0.05±0.030.08±0.06II組-0.41±0.19△△0.46±0.30△△III組0.80.35±0.270.16±0.21**IV組100.15±0.16*0.09±0.07**V組5.00.37±0.270.22±0.29*VI組2.50.43±0.350.15±0.06**

注：與正常對(duì)照組比較(I組)比較，△△P<0.01；與模型對(duì)照組(II組)比較，*P<0.05，**P<0.05。

3 討論

腫瘤壞死因子(TNF)在消耗性疾病中起了重要作用，又稱惡液質(zhì)素。 TNF-α的生物學(xué)活性占TNF總活性的70 %～95 %,目前常說(shuō)的TNF多指TNF-α。在缺血缺氧性腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中炎癥細(xì)胞因子TNF-α起著重要作用[11]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腦組織在缺血缺氧病理生理過(guò)程中，存在多種炎癥因子的參與反應(yīng)，導(dǎo)致缺血缺氧時(shí)腦細(xì)胞的損傷和壞死，腦組織缺血缺氧同時(shí)又加快炎癥反應(yīng)，從而形成一個(gè)循環(huán)過(guò)程[12]。研究證實(shí) TNF-α在腦損傷后高度表達(dá)，并與腦組織病變的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[13]。TNF-α是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的分泌可引起其他炎癥因子如IL-6 等的釋放，在機(jī)體炎癥啟動(dòng)、維持和消退中起著重要作用[14]。該研究中觀察到，模型對(duì)照組小鼠腦組織中TNF-α明顯增加，出現(xiàn)學(xué)記憶能力下降。

AKT的產(chǎn)生與AD的發(fā)病有一定關(guān)系。AKT與腦缺血所產(chǎn)生的氧自由基、炎癥反應(yīng)等因素有關(guān)，并參與腦缺血的病理過(guò)程。AKT不但參與炎癥損傷還參與細(xì)胞凋亡。Girifn等[15]發(fā)現(xiàn)在AD患者腦內(nèi)AKT活性的升高及下游底物的磷酸化可能與AD疾病的發(fā)生有關(guān)。TNF-α通過(guò) PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路活化NF-κB，最終引發(fā)過(guò)度的組織炎癥反應(yīng)和損傷[16]。D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉能使小鼠大腦缺氧而發(fā)生炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)2個(gè)月的造模方法，成功建立了老年癡呆小鼠模型。從炎癥角度建立老年癡呆模型也在一定程度上順應(yīng)了有關(guān)學(xué)者提出的老年癡呆患者大腦中炎癥致病因素。前期實(shí)驗(yàn)觀察藍(lán)布正能夠改善大鼠因大腦缺血而造成的學(xué)習(xí)記憶力障礙。有研究報(bào)告觀察藍(lán)布正在抗炎方面也體現(xiàn)了其較好的抗炎效果[17]。從本實(shí)驗(yàn)觀察藍(lán)布正提取物能夠改善小鼠大腦缺血缺氧，下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。

綜上，藍(lán)布正提取物可用于改善大腦缺血缺氧狀況，減輕炎癥反應(yīng)，但其具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究探討。